Quando si tratta di solubilizzare e denaturare le proteine prima della messa a fuoco isoelettrica e dell’elettroforesi su gel 2-D, la maggior parte dei ricercatori sceglie l’urea. Ciò non sorprende poiché questo lieve agente chaotropico può interrompere completamente le interazioni tra le molecole proteiche e aumentare l’efficienza dell’attività della proteasi nella digestione delle proteine impedendo efficacemente alle proteine di aggregarsi e/o precipitare. Inoltre, l’urea viene anche utilizzata per la renaturazione di proteine da campioni precedentemente denaturati.

Nonostante la sua popolarità come efficace denaturante proteico, l’uso della soluzione di urea nella digestione delle proteine comporta una sfida particolare: aumenta il rischio di carbamilazione. Perché questo dovrebbe interessarti? Ecco alcuni motivi per cui la carbamilazione può essere dannosa per il tuo esperimento e perché dovrebbe essere evitata a tutti i costi.

1. Oltre a bloccare le estremità N-terminali delle molecole proteiche, la carbamilazione interferisce con la caratterizzazione delle proteine e le rende non disponibili per un ulteriore uso.
2. Attacca aggressivamente le catene laterali dei residui di arginina e lisina e rende la proteina inadatta ai digerimenti enzimatici.
3. Ostacola la digestione enzimatica delle proteine e influenza negativamente l’identificazione e la quantificazione delle proteine nell’analisi della SM.
4. Confonde i risultati ottenuti dai peptidi con tempi di ritenzione imprevisti e aumenta la complessità del campione.
5. Riduce l’efficienza di ionizzazione e influisce negativamente sull’intensità del segnale dei picchi rilevati.
6. Induce un cambiamento nel punto isoelettrico delle proteine e porta a risultati artefatti.
7. Può influenzare i risultati degli studi di carbamilazione in vivo.

Quali sono le cause della carbamilazione?

Per definizione, la carbamilazione si riferisce alla modificazione post-traduzionale che altera le proprietà strutturali e funzionali delle proteine. Ciò è causato dalla reazione non enzimatica tra acido isocianico e gruppi amminici liberi.

In soluzioni acquose, l’urea esiste in equilibrio con il cianato di ammonio. È importante notare che (1) l’urea in soluzione si dissocia spontaneamente producendo ioni cianato e ammonio, (2) si degrada in acido isocianico (CNOH), la forma che reagisce attivamente con i gruppi amminici proteici e induce la carbamilazione e (3) la velocità con cui l’urea si dissocia e l’entità della carbamilazione dipende dalla temperatura, dal pH e dal tempo di incubazione.

Prevenire la carbamilazione: alcuni consigli utili da considerare

Nulla può cambiare il fatto che l’urea in presenza di calore e proteine porterà sempre alla carbamilazione. È possibile utilizzare il più alto grado di urea disponibile e ancora correre il rischio di carbamilazione.

Per fortuna, ci sono diversi modi per proteggere i peptidi dalla carbamilazione. Ecco alcune strategie efficaci che possono essere utilizzate per raggiungere questo obiettivo.

• Utilizzare sempre reagenti a base di urea preparati al momento durante le procedure proteomiche. Utilizzare tamponi premiscelati e pronti all’uso a base di urea secca di alta qualità provenienti da fonti credibili e osservare estrema cautela nella preparazione dei campioni. Nota: Conservare il materiale solido a temperatura ambiente e mantenere la manipolazione al minimo.
• Rimuovere l’urea dal campione proteico prima della digestione utilizzando la dialisi e / o la cromatografia a fase inversa veloce o utilizzando colonne di spin.
• Mantenere il campione ad una temperatura relativamente bassa per diminuire la velocità con cui l’urea si decompone. Evitare di riscaldare tamponi contenenti urea sopra 37oC per ridurre il rischio di carbamilazione.
• Deionizzare la soluzione di urea utilizzando una resina a scambio ionico per ridurre la concentrazione di cianato.
• Acidificare la soluzione di urea (100 mm HCl) per ostacolare la formazione di acido isocianico.
• Utilizzare reagenti come etanolamina, etilendiammina, metilammina e Tris-HCl per ridurre al minimo la carbamilazione di proteine/peptidi. Questi reagenti aiutano scavenging per molecole di cianato rendendoli così non disponibili per i peptidi.

Certo, queste strategie hanno i loro svantaggi (cioè, richieda il tempo di trattamento esteso, induca la precipitazione delle proteine prontamente denaturate e può essere inadatto per le numerose tecniche di digestione enzimatica) ma poiché i digerimenti enzimatici sono eseguiti nelle temperature elevate sopra un lungo periodo di tempo, non avete scelta ma rimuovere l’urea dalla miscela della digestione. Altrimenti, correrai sempre il rischio di carbamilazione. E ‘ un rischio che non vorresti correre.