Case Study: Discovering Inhibitors of Voltage-gated Sodium Channels
Come un modo per illustrare le questioni relative alla scoperta di farmaci a canale ionico delineato sopra, il resto di questo articolo descriverà un caso di studio incentrato sull’identificazione di inibitori del canale del sodio voltage-gated per trattare il dolore neuropatico cronico. Il trattamento del dolore è un problema medico serio e c’è uno sforzo importante nell’industria farmaceutica per sviluppare nuove terapie per questa condizione. In particolare, il trattamento del dolore neuropatico, definito come “dolore cronico che deriva da una lesione primaria o disfunzione del sistema nervoso periferico” dall’Associazione Internazionale per lo studio del dolore (IASP), rimane un importante bisogno medico insoddisfatto.
È chiaro che i canali del sodio voltaggio-dipendenti (Nav1) svolgono un ruolo chiave nell’origine e nella propagazione dei potenziali di azione dei nervi sensoriali necessari per la segnalazione del dolore. Le applicazioni locali di bloccanti dei canali del sodio non selettivi, come la novocaina, forniscono un sollievo dal dolore completo attraverso il blocco di conduzione. Tuttavia, questo approccio al sollievo dal dolore è limitato a pochissime applicazioni, come le procedure dentistiche, poiché i canali del sodio sono anche vitali per la conduzione nel cuore, nel SNC, nel muscolo scheletrico e nei neuroni sensoriali non cocettivi. La famiglia Nav1 super è composta da 10 membri (Yu e Catterall, 2004). Sette di questi sottotipi, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 e Nav1.9, sono presenti nel sistema nervoso periferico (PNS). Di questi, Nav1.7, Nav1.8 e Nav1.9 sono espressi prevalentemente nei neuroni nocicettivi e Nav1.3 è prevalentemente embrionale, ma è up-regolato nel PNS adulto dopo l’infortunio. Questo modello di espressione limitato rende questi sottotipi bersagli attraenti per lo sviluppo di nuovi agenti analgesici. Tuttavia, il loro contributo relativo alla segnalazione del dolore, e in particolare alla segnalazione del dolore neuropatico, non è chiaro e può variare con diverse eziologie e qualità sensoriali del dolore.
In assenza di selettività molecolare per un sottotipo Nav1, è possibile indirizzare specificamente i canali Nav1 in un dato stato conformazionale preservando la conduzione dell’impulso dipendente dal canale del sodio. Questo tipo di inibizione dipendente dallo stato è la base per la finestra terapeutica osservata con anticonvulsivanti e antiaritmici bloccanti del canale del sodio, come lamotrigina e lidocaina. Questi farmaci hanno una maggiore affinità per i canali negli stati aperti e/o inattivati rispetto ai canali chiusi a riposo. Questo meccanismo di inibizione favorisce il legame nei tessuti rapidamente infornati o parzialmente depolarizzati. Il dolore neuropatico dovrebbe essere sensibile a questo meccanismo inibitorio, poiché si pensa che derivi da aree indotte da lesioni di depolarizzazioni, un’ipotesi supportata dall’efficacia clinica della lidocaina somministrata per via sistemica a dosi subanestetiche. Inoltre, il blocco non selettivo e dipendente dallo stato può offrire la massima efficacia, dal knockout individuale di Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 o Nav1.9 non ha fornito prove convincenti per un ruolo dominante di nessuno di questi canali nella segnalazione del dolore neuropatico.
Sulla base di questa logica, è stata presa la decisione di perseguire inizialmente inibitori Nav1 selettivi e dipendenti dallo stato, monitorando la selettività molecolare testando i composti di interesse su Nav1.7, Nav1.5 (il canale cardiaco primario del sodio) e Nav1.8 in parallelo.
È stato utilizzato un test basato sul potenziale di membrana per vagliare compounds 200.000 composti su Nav1.8 espressi stabilmente in una linea cellulare ricombinante. Questo test HTS era basato sul trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET) tra due membri di una coppia di coloranti potenzialmente sensibili alla membrana sviluppata da Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). I canali Nav1.8 sono stati preincubati con il composto di prova e l’agonista chimico deltametrina in assenza di sodio extracellulare. La successiva aggiunta di sodio ha provocato la depolarizzazione della membrana e il blocco Nav1 è stato quantificato come interferenza con quel processo di depolarizzazione cellulare.
Sebbene la schermata iniziale su Nav1.8 ha prodotto una varietà di colpi, solo un singolo composto è stato considerato un vantaggio vitale per gli sforzi di chimica medicinale. Prima di impegnare risorse a questo piombo, il composto, un succinimide disostituito chiamato BPBTS(N-{ metil }-N’-(2,2′-bithien-5-il metil)succinimide), è stato esaminato in dettaglio dal morsetto manuale di tensione di cella intera. Il BPBTS è risultato inibire tutti i sottotipi Nav1 con potenza simile e l’inibizione dipendeva dal potenziale di membrana e dalla frequenza di stimolazione. Questo meccanismo inibitorio era coerente con una maggiore affinità del composto per i canali nello stato aperto e inattivato, rispetto ai canali nello stato di riposo. Inoltre, i BPBTS erano due ordini di grandezza più potenti dei bloccanti anticonvulsivanti e antiaritmici Nav1 usati clinicamente, inibendo lo stato inattivato di Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 e Nav1.2, con valori Ki di 0,09, 0,15, 0,08 e 0,14 µM e lo stato di riposo con valori Kr di 1,5, 1,3, 0,3 e 1,2 µM, rispettivamente (Priest et al., 2004).
Come tale, BPBTS era un vantaggio attraente per la chimica medicinale; le sue principali passività sono uno scarso profilo farmacocinetico. Nel corso della profilazione degli analoghi dei BPBTS, così come degli inibitori Nav1 pubblicati, utilizzando il test di screening fluorescente basato sul potenziale di membrana, sono state notate discrepanze basate sulla struttura tra le potenze determinate nel test fluorescente e dall’elettrofisiologia per alcuni composti. Queste discrepanze sono state ricondotte a un’interazione tra questi composti e l’agonista veratridina usato per aprire i canali Nav1.7. Successivamente, il test fluorescente è stato modificato in modo tale che i canali Nav1 sono stati preincubati con il composto di prova in concentrazioni fisiologiche di sodio extracellulare e la depolarizzazione Nav1-dipendente è stata avviata mediante aggiunta di agonisti (Fig. 1). Le potenze inibitorie del canale misurate in questo test modificato sono correlate molto bene con l’inibizione dello stato inattivato determinata dall’elettrofisiologia in molte classi strutturali di inibitori Nav1 (Felix et al., 2004; Liu et al., 2006).
Un funzionale, membrana potenziale FRET-based saggio per Nav1.7 canali. In assenza di altre conduttanze ioniche che possono iperpolarizzare la cellula, l’espressione eterologa dei canali Nav1.7 fornisce un sistema in cui al potenziale di membrana a riposo della cellula la maggior parte dei canali risiederà nello stato inattivato non conduttivo. La rimozione dell’inattivazione rapida mediante l’aggiunta di veratridina sposta l’equilibrio del canale allo stato conduttivo e aperto che consente l’ingresso di sodio che porta alla depolarizzazione cellulare. Le variazioni di tensione possono essere monitorate con una coppia di coloranti FRET voltage-sensing, cumarina e oxonolo. La depolarizzazione cellulare altera la distribuzione di ossonolo attraverso la membrana, causando un cambiamento nel segnale del tasto. In presenza di un inibitore Nav1.7, l’equilibrio del canale si sposta verso la conformazione inattivata e legata al farmaco, riducendo il numero di canali che saranno disponibili per la modifica della veratridina e prevenendo il segnale del TASTO indotto dall’agonista. La curva dose–risposta per il cambiamento indotto dalla veratridina nel segnale del TASTO è ripida, suggerendo che la modifica di un piccolo numero di canali Nav1.7 è sufficiente a causare la depolarizzazione cellulare.
anche se farmaceutici di BPBTS non è riuscito a superare l’iniziale di piombo in potenza, di chimica farmaceutica riuscito a migliorare il profilo farmacocinetico, eventualmente generando trans-N-{metil }-N-methyl-N’-ciclopentano-1,2-dicarbossammide (CDA54), con il 44% di biodisponibilità orale, una mezz’ora di vita, e un tasso di clearance di 14 ml/min/kg, che è stato profilato ampiamente in vivo (Brochu et al., 2006). In due modelli di ratto di dolore neuropatico, CDA54 (10 mg / kg, somministrato per via orale) ha ridotto significativamente l’ipersensibilità comportamentale indotta da lesioni nervose del 44-67%. La stessa dose/concentrazione plasmatica di CDA54 non ha influenzato la nocicezione acuta (saggio sulla piastra calda nel ratto), la coordinazione motoria (saggio sul rotorod nel ratto) o la conduzione cardiaca (parametri elettrofisiologici misurati nel cane cardiovascolare). Queste proprietà sono in contrasto con quelle degli attuali bloccanti dei canali del sodio utilizzati nella clinica, che causano compromissione della coordinazione motoria nei ratti e effetti collaterali del SNC nell’uomo a tutte le dosi efficaci. È interessante notare che, dopo il dosaggio orale, il rapporto cervello-plasma per CDA54 era 0,03. Al contrario, i bloccanti Nav1 utilizzati clinicamente si accumulano nel SNC, con un rapporto cervello-plasma superiore a 10 per la mexiletina. Questi dati ottenuti con CDA54 hanno fortemente suggerito che l’inibizione dei canali del sodio PNS da sola è efficace nei modelli animali di dolore neuropatico e che limitare le esposizioni del SNC degli inibitori Nav1 è un approccio praticabile allo sviluppo di inibitori Nav1 con un indice terapeutico migliorato.
Una campagna UHTS, utilizzando il test basato sul potenziale di membrana descritto per lo screening degli inibitori di Nav1.7, ha scoperto i nuovi inibitori del canale 1–benzazepin-2-one (Hoyt et al., 2007; Williams et al., 2007). Questa classe di inibitori ha dimostrato una relazione struttura–attività definita e, quando valutati in vivo, i membri di questa serie sono risultati efficaci per via orale nei modelli di dolore neuropatico e epilessia dei roditori. È importante sottolineare che alcuni membri di questa classe hanno mostrato selettività molecolare per i canali Nav1. 7 (Williams et al., 2007). Ad esempio, composto 2 di Fig. 2 era altamente dipendente dallo stato e selective 10 volte selettivo per Nav1.7 su Nav1.8 e Nav1.5. Il membro più potente, anche se non sottotipo-selettivo, di questa classe di inibitori Nav1.7 (composto 1, BNZA; Fig. 2) è stato tritiato. BNZA si lega con alta affinità (Kd di 1,6 nM) ai canali ricombinanti Nav1.7. Questa è la prima dimostrazione del legame del legante ad alta affinità con Nav1.7 e fornisce un prezioso strumento di screening con cui cercare composti selettivi Nav1.7. I dati ottenuti con la serie strutturale 1-benzazepin-2-one suggeriscono che Nav1.7-è possibile identificare analoghi selettivi e, con le proprietà farmacocinetiche e metaboliche appropriate, tali composti potrebbero essere sviluppati come agenti analgesici, mostrando potenzialmente una migliore tollerabilità rispetto ai farmaci esistenti usati per trattare il dolore neuropatico. Il supporto per la fattibilità dello sviluppo di inibitori selettivi del canale del sodio sottotipo come nuovi analgesici deriva dal recente rapporto di un agente selettivo Nav1.8 ad alta affinità, che dato per via intraperitoneale era efficace in una vasta gamma di modelli di dolore ai roditori (Jarvis et al., 2007).
Inibitori 1-benzazepin-2-one Nav1. Le strutture di due inibitori 1-benzazepin-2-one Nav1 sono illustrate insieme alle loro potenze per i canali hNav1.5, hNav1.7 e hNav1.8 come determinato in potenziale di membrana funzionale, saggi basati su FRET. Vengono anche presentate le potenze stimate di questi composti per lo stato inattivato dei canali hNav1.5 e hNav1.7, come determinato dalle registrazioni elettrofisiologiche. Si noti che solo compound 2 visualizza la selettività per il canale hNav1.7. Entrambi i composti sono inibitori più deboli del canale hNav1.8.
Un potenziale approccio alternativo alla ricerca di inibitori selettivi del canale del sodio sarebbe quello di esaminare i composti che mirano ai meccanismi di gating dei canali. Diversi peptidi hanno precedentemente dimostrato di modificare gating dei canali del sodio, ma poche piccole molecole, in particolare gli inibitori, sono stati descritti per funzionare in questo modo. Uno di questi agenti è ProTx-II, un peptide a 30 aminoacidi purificato dal veleno della tarantola; questo peptide blocca i canali del sodio e mostra la selettività per Nav1. 7 (Smith et al., 2007). ProTx-II si lega allo stato di riposo dei canali del sodio e sposta la dipendenza dalla tensione dell’attivazione del canale su potenziali più depolarizzati. Le forti depolarizzazioni superano l’inibizione del canale, che è un segno distintivo di questo tipo di peptide modificatore di gating. Una possibile strategia per identificare i mimetici di piccole molecole di un peptide modificatore gating è radiolabel ProTx-II in forma biologicamente attiva e sviluppare un test di legame con i canali Nav1.7 espressi eterologicamente in una linea cellulare. Lo screening per piccole molecole che modulano il legame ProTx-II potrebbe rivelare nuove classi di inibitori del canale che si dividono nella membrana e interferiscono con il movimento della pala di gating, impedendo così l’apertura del canale. Un ulteriore vantaggio di questo tipo di UHTS è che potrebbero essere impiegate alte concentrazioni di composti di prova, una situazione che è preclusa nello screening a base di coloranti a causa dell’interferenza della fluorescenza che si verifica tipicamente con alte concentrazioni di molte piccole molecole organiche. Dato che alcuni peptidi modificatore gating legano a regioni che sono unici per canali specifici all’interno di una super famiglia, inibitori selettivi del sottotipo potrebbero essere identificati utilizzando tale strategia.
