Risultati e discussione

Gli HANCs provengono dall’epidermide della testa e richiedono la funzione del gene lb. Studi precedenti (5, 11, 17, 19) hanno descritto il ruolo dei geni lb nei processi di specificazione del destino cellulare. Nella Drosophila, gli esperimenti di guadagno e perdita di funzione hanno rivelato che i geni lb specificano l’identità di un sottoinsieme di cellule cardiache e muscolari e che questa funzione deriva dall’espressione mesodermica altamente limitata e specifica del lignaggio di lb. Inoltre, l’analisi precisa del lbe (Fig. 1) e lbl (dati non mostrati) modello di espressione all’inizio della fusione del cuore ha rivelato un gruppo triangolare di cellule lb-positivi situati appena anteriormente alla punta del cuore (Fig. 1 A, punta di freccia). Per produrre una descrizione più precisa della posizione di queste cellule rispetto alle ghiandole linfatiche associate al cuore e alle ghiandole anulari, abbiamo embrioni con doppia etichetta per lb e marcatori specifici della ghiandola (Fig. 1 B e C). I precursori della ghiandola linfatica rivelati con l’anticorpo anti-serpente fiancheggiano entrambi i lati della punta del cuore (Fig. 1B) ma non si sovrappongono con l’area etichettata da lb. Allo stesso modo, la doppia colorazione di l(2)1857 enhancer trap line, che esprime specificamente LacZ nelle primordie embrionali della ghiandola anulare (15), dimostra che le cellule lb-positive si trovano immediatamente di fronte alla ghiandola anulare (Fig. 1C).

Per determinare l’origine delle cellule lb-positive associate al cuore, abbiamo seguito l’espressione lb nella parte anteriore degli embrioni dalla fase iniziale in poi. Nelle fasi embrionali che precedono la fusione del cuore, non siamo stati in grado di rilevare l’espressione lb associata alla parte anteriore di due primordie cardiache. Questa scoperta ha suggerito che le cellule lb-positive non sono originariamente specificate nell’area del cuore e possono rappresentare cellule di origine diversa che si associano alle cellule cardiache in fasi successive. Infatti, alla fine della fase 11, un gruppo di cellule lb-positive nell’epidermide della testa dorsale (Fig. 2A) può essere rilevato. Queste cellule iniziano a invaginare leggermente più tardi e formano la parte principale dell’epidermide piegata (Fig. 2 TER). La posizione e la tempistica di questa invaginazione assomigliano a un ripiegamento dell’epidermide della testa, dando origine alla parte posteriore della sacca dorsale chiamata sacca frontale (20). Per verificare se le cellule che esprimono lb corrispondono alla punta del sacco frontale, abbiamo usato la linea escargot-LacZ N516 che esprime lacZ nelle cellule che formano la sacca dorsale (20). Doppia colorazione dello stadio 14 (Fig. 2B) e fase 16 (Fig. 2C) Gli embrioni N516 che utilizzano anticorpi anti-Lbe e anti-β-galattosidasi dimostrano chiaramente che lb ed esg sono coespressi nella punta del sacco frontale invaginante. Una vista dorsale della regione della testa embrionale (Fig. 2D) conferma che queste cellule mostrano la stessa disposizione triangolare delle cellule lb-positive associate al cuore mostrate in precedenza(confronta Fig. 2D e 1).

Presi insieme, questi dati indicano che le cellule che esprimono lb che si trovano immediatamente davanti al cuore provengono dall’epidermide della testa e migrano verso la punta del cuore durante l’invaginazione del sacco frontale. Questa osservazione solleva un’ulteriore domanda sul ruolo dei geni lb nella specifica di questo gruppo di cellule. Abbiamo precedentemente dimostrato che i geni lb svolgono un ruolo importante nella specificazione di un sottoinsieme di precursori cardiaci e muscolari (11, 19). L’analisi funzionale del gene Lbx1 del topo lb ortholog (21, 22) ha anche rivelato la sua implicazione nel controllo della specifica e della migrazione diretta dei precursori muscolari appendicolari. Inoltre, i dati più recenti indicano che Lbx1 nei topi specifica una sottopopolazione di cellule della cresta neurale cardiaca necessarie per il normale sviluppo del cuore (23).

Per verificare se la Drosophila lb è richiesta per la specifica delle cellule associate al cuore, abbiamo analizzato la formazione di sacche dorsali in embrioni carenti per entrambi i geni lb (vedi Materiali e metodi). Usando la sonda esg RNA come marker, abbiamo dimostrato che negli embrioni lbdef l’espressione esg nella parte distale del sacco frontale che porta le cellule associate al cuore è assente (confronta Fig. 2 E e G con F e H). Inoltre, come mostrato dalle viste dorsolaterali degli embrioni dello stadio 14 (Fig. 2 G e H), la distanza tra il sacco vitellino e le cellule esg-positive più distali è significativamente ingrandita negli embrioni con deficit di lb. Questa scoperta, supportata dall’osservazione dell’ottica Nomarski che rivela che la parte posteriore del sacco frontale ha alterato la morfologia (dati non mostrati), ha indicato che gli HANCs non sono specificati o non migrano correttamente negli embrioni lbdef. Poiché la carenza analizzata copre anche i geni adiacenti bap e C15, abbiamo testato la formazione del sacco frontale in embrioni mutanti bap e Arm-GAL4>embrioni UAS-RNAiC15. In entrambi gli embrioni bap208 e RNAiC15, il sacco frontale colorato con esg era di forma normale (dati non mostrati), escludendo così l’influenza dei geni bap e C15 sulla differenziazione o migrazione delle cellule associate al cuore. Questi dati suggeriscono fortemente che il pattern anormale delle cellule sacche frontali esg-positive distali negli embrioni lbdef deriva dalla perdita della funzione lb.

Componenti mesodermici e non mesodermici coinvolti nel pattern della regione di deflusso cardiaco. I nostri esperimenti immunostenenti hanno dimostrato che le cellule lb-positive che ancorano il cuore si trovano molto vicino ai cardioblasti che esprimono lb (Fig. 1). Poiché i cardioblasti più anteriori esprimono tin (5), abbiamo embrioni con doppia etichetta con anticorpi anti-Tin e anti-Lbe per visualizzare le rispettive posizioni della punta del cuore e la parte più distale del sacco frontale. Sorprendentemente, queste due strutture si sovrappongono di circa tre lunghezze di cellule quando osservate dal lato dorsale (Fig. 3 BIS). Inoltre, la vista confocale laterale della regione cardiaca anteriore (Fig. 3B) mostra chiaramente che la punta del sacco frontale, che consiste di cellule che esprimono lb non mesodermiche, è direttamente attaccata al cuore. Più precisamente, abbiamo osservato che la parte anteriore dell’aorta (in parte sovrapposta alle cellule lb associate al cuore) si piega ventralmente, formando un’area morfologicamente distinta corrispondente alla regione di deflusso cardiaco. Questa morfologia suggerisce che potrebbe esserci un componente cellulare aggiuntivo che favorisce la flessione ventrale del cuore. Abbiamo deciso di cercare la presenza di un muscolo situato ventralmente attaccato alla punta dell’aorta. La vista laterale dell’embrione, doppio macchiato per catena pesante miosina (Myo) e Lbe (Fig. 3C), mostra chiaramente che il deflusso del cuore è effettivamente collegato a un muscolo della testa, che proponiamo di chiamare COM. Un’analisi più precisa delle sezioni confocali ha rivelato che il primordio cardiaco è, infatti, collegato da due COM strettamente distese che si estendono dall’esofago e si attaccano a entrambi i lati della regione di deflusso cardiaco (punte di freccia aperte in Fig. 3D). Sorprendentemente, questi muscoli della testa embrionali non sono stati descritti in precedenza a nostra conoscenza. La mancanza di documentazione pubblicata per le COM è probabilmente dovuta al fatto che la morfologia e l’origine dei muscoli somatici della testa nell’embrione di Drosophila non sono state analizzate sistematicamente. Usando l’unica descrizione disponibile della muscolatura della testa adulta fatta da Miller (24), non siamo stati in grado di identificare i muscoli della testa adulta che potrebbero corrispondere alle COM embrionali presentate qui.

È interessante notare che la doppia colorazione Myo / Lbe ha anche rivelato che gli HANCs nonmesodermici sono attaccati ad entrambe le cellule cardiache (Fig. 3E) e le COMs (Fig. 3D). Perché gli HANCs esprimono lb e si associano selettivamente con la coppia di cellule cardiache lb-positive più anteriori (Fig. 3E e 4 D–F), ipotizziamo che l’instaurazione di questo contatto possa comportare interazioni cellulari di tipo omofilo. Testare le molecole di adesione cellulare coinvolte nella segnalazione intercellulare tra cellule omotipiche (25, 26) aiuterà a definire i meccanismi alla base della creazione di connettività tra gli HANCS che esprimono lb e le cellule cardiache.

Per visualizzare la disposizione spaziale della punta dell’aorta, le COM e gli HANCS che esprimono lb, abbiamo utilizzato l’analisi 3D assistita da computer e la ricostruzione di scansioni confocali. Questo approccio ha pienamente confermato le nostre osservazioni rivelando che, oltre agli HANCs, la regione di deflusso del cuore è strettamente collegata a una coppia di COM(Fig. 3 SEPTIES). Questi muscoli si sovrappongono alla punta del cuore da entrambi i lati e contribuiscono alla sua flessione ventrale.

Per capire come viene stabilito il contatto tra cuore, COM e HANCs durante lo sviluppo, abbiamo monitorato queste strutture negli embrioni di stadio 14 precoce e tardivo (Fig. 3 G e H). I nostri dati indicano che sia le cellule cardiache lb-positive che gli HANCs che esprimono lb attraggono le COM che si estendono.

Il contatto tra COM e HANCs sembra leggermente precedere l’attaccamento di COM alla punta dell’aorta e si vede all’inizio dello stadio 14 (Fig. 3G). A quel tempo, il fillopodia di COM si estende nella direzione delle cellule cardiache lb-positive (Fig. 3G) e diventare definitivamente attaccato a queste cellule in fase avanzata 14 all’inizio della fusione del cuore (Fig. 3H). Poiché le COM entrano in contatto con le cellule cardiache e gli HANCs prima che gli HANCs si attaccino al cuore, ipotizziamo che le COM, oltre a piegare la punta del cuore, facilitino il suo contatto con gli HANCs. La creazione di un contatto tra i muscoli somatici e i loro siti di attacco epidermico (cellule tendinee) è stata ampiamente studiata (27), rivelando il ruolo chiave della striscia del fattore di trascrizione del dito di zinco (28) e di una proteina legante l’RNA Come (29). Abbiamo usato entrambi questi marcatori per verificare se gli HANCs e le cellule cardiache a cui le COMS attaccano le proprietà di visualizzazione delle cellule tendinee. La doppia etichettatura eseguita su embrioni WT con anti-Lbe / anti-Stripe e su embrioni how-lacZ con anticorpi anti-Lbe/anti-LacZ ha rivelato che gli HANCs e le cellule cardiache in contatto con COM non esprimono marcatori cellulari tendinei (dati non mostrati). Questo risultato indica che le cellule lb-positive attraggono COM utilizzando un meccanismo diverso da quello utilizzato dalle cellule tendinee. I candidati più interessanti per guidare le COM sono la fessura proteica secreta che possiede i motivi di legame a più proteine e i suoi recettori Robo e Robo2 (30). Slit e Robo sono emersi di recente come componenti cardine che controllano i processi di attrazione e repulsione durante la morfogenesi dei muscoli somatici (31), suggerendo che potrebbero anche essere implicati nell’attrazione COM.

Le cellule cardiache più anteriori che esprimono lb svolgono un ruolo centrale nel pattern della regione di deflusso cardiaco. L’osservazione che sia COMs che HANCs hanno scelto di attaccarsi alle cellule cardiache più anteriori lb-positive ci ha spinto a testare se la deregolamentazione dell’espressione lb all’interno del cuore potrebbe influenzare il pattern della regione di deflusso cardiaco. Per eseguire questo test, abbiamo utilizzato il sistema di espressione mirato Gal4/UAS (16). Sono state utilizzate due diverse linee di effettori GAL4, 24B-GAL4 e Tin-GAL4 (Fig. 4 Lettere A e C). La linea 24B-GAL4 consente un’espressione mirata in tutte le cellule cardiache e muscolari (Fig. 4A) con un livello uniforme e alto di espressione nelle cellule cardiache più anteriori (freccia in Fig. 4 BIS). La linea Tin-GAL4 (gentilmente fornita da R. Bodmer) induce l’espressione del transgene UAS selettivamente in quattro cardioblasti in ogni emisegamento (questi includono le cellule lb-positive), ma il livello di induzione nelle cellule cardiache più anteriori è inferiore (freccia in Fig. 4C) rispetto a quella della linea 24B-GAL4. Per espandere l’espressione lb cardiaca, entrambe le linee effettore GAL4 sono state incrociate con la linea UAS-lbe. L’espressione cardiaca lb ectopica guidata dalla linea Tin-GAL4 era più debole dell’espressione lb endogena all’interno del cuore e non sono state osservate evidenti alterazioni indotte dal guadagno di funzione nel pattern della regione di deflusso cardiaco (dati non mostrati). Al contrario, gli embrioni 24B-GAL4>UAS-lbe hanno mostrato una marcata espansione dell’espressione lb all’interno del cuore (Fig. 4G), che porta al contatto anormale delle COM con la punta del cuore. Più precisamente, abbiamo scoperto che le COM si attaccano direttamente alle cellule cardiache più anteriori che formano il deflusso cardiaco (asterisco in Fig. 4G) e non alla seconda coppia di cellule cardiache come nel WT (Fig. 4D). La connessione alterata di COMs molto probabilmente deriva dai segnali attraenti ectopici generati dall’espressione cardiaca ingrandita di lb. Di conseguenza, la flessione ventrale della parte più anteriore del cuore era più pronunciata (confronta Fig. 4 D e G). Abbiamo anche notato una morfologia alterata di COMs (punta di freccia aperta in Fig. 4 D e G), che potrebbe derivare dall’espressione muscolare ectopica 24B-GAL4-driven di lb. Il contatto tra HANCs e cellule cardiache non è stato influenzato dalle condizioni sperimentali di misexpression. Per verificare se l’espressione lb cardiaca è necessaria per l’attrazione delle COM, abbiamo approfittato dell’influenza normativa negativa precedentemente descritta di even-skipped (eve) che è in grado di reprimere specificamente lb nelle cellule cardiache (5). Ancora una volta, le linee effettore 24B-GAL4 e Tin-GAL4 sono state utilizzate per guidare l’espressione di eve all’interno del cuore. Abbiamo scoperto che entrambi questi driver incrociati con la linea UAS-eve (Tin-GAL4 con penetranza inferiore) portano alla repressione dell’attività lb all’interno del cuore (Fig. 4 H e I). Nonostante i difetti di misspecification, primordia cardiaca si formano normalmente in UAS-eve guadagno di embrioni funzione (ref. 5 e Fig. 4B), che ci consente di monitorare COM e HANCs in un contesto in cui l’espressione cardiaca di lb è esaurita. I nostri dati mostrano che in tali embrioni impoveriti lb (vedi l’assenza di espressione lb cardiaca in Fig. 4 H e I) le COM non si attaccano alla punta del cuore. Abbiamo osservato che i COM si estendevano anteriormente e si attaccavano agli HANC invaginanti (Fig. 4 H e I), che non sono più in grado di ancorare correttamente la punta del cuore. Il ramo COM principale che normalmente si attacca alla regione di deflusso cardiaco (confrontare Fig. 4 E e F con H e I) era assente o fuso con il ramo che attaccava HANC. Pertanto, crediamo che la forma anormale di COM e una completa perdita del suo contatto con la punta del cuore siano causate dall’esaurimento cardiaco lb. Questa ipotesi è supportata dal fatto che gli stessi fenotipi sono stati osservati in embrioni con ectopica cardiaca (Tin-GAL4-driven) e cardiaca più muscolare (24B-GAL4-driven) espressione di eve (confrontare Fig. 4 H e I). Il contatto alterato e il posizionamento delle COM è apparso negli embrioni della fase 14 avanzata quando la catena pesante della miosina non è ancora rilevabile nei cardioblasti (Fig. 4 E e H). L’analisi degli embrioni di stadio 15 ha rivelato inoltre che la perdita di espressione lb cardiaca è accompagnata dalla down-regulation di β3-tubulina (confronta Fig. 4 F e I) nella regione di deflusso cardiaco, indicando che l’espressione lb all’interno del cuore ha un impatto importante sulla morfogenesi cardiaca finale. Questi dati completano rapporti recenti che descrivono ruoli morfogenetici di un membro della famiglia del recettore COUP-TF, Seven-up, espresso nella coppia posteriore di cardioblasti in ciascun segmento e richiesto per la formazione di ostia nei segmenti addominali A5–A7 (32, 33). In questo contesto, la dimostrazione del ruolo di lb nel pattern della regione di deflusso cardiaco aumenta la possibilità che nei segmenti addominali lb svolga un ruolo simile nello stabilire un contatto tra le cellule cardiache e i muscoli alari che ancorano il cuore. Questa ipotesi rimane da indagare.

Inoltre, i fenotipi presentati (Fig. 4) suggeriscono che l’espressione lb sperimentalmente esaurita all’interno del cuore influenza l’emissione o la ricezione di segnali attraenti da parte delle cellule cardiache e di conseguenza porta all’interruzione del contatto con le COM. È probabile che lo stesso o simile attrattivo muscolare sia prodotto o ricevuto da HANCS lb-positivi, suggerendo così che lb regola l’espressione dei geni coinvolti nel contatto cellula–cellula. È interessante notare che, in mouse lb homologue, il gene Lbx1 è stato trovato per essere richiesto per la migrazione diretta di un sottoinsieme di precursori muscolari (21, 22), indicando che i meccanismi di movimento cellulare conservati potrebbero esistere controllati da geni lb.

Presi insieme, attraverso l’analisi di embrioni in cui l’espressione cardiaca lb è stata espansa o sperimentalmente esaurita, abbiamo dimostrato che la lb è necessaria per il corretto attaccamento di HANCs e COMs e di conseguenza per il corretto pattern della regione di deflusso cardiaco. Questa scoperta fornisce approfondimenti sul significato funzionale della diversificazione antero–posteriore dei precursori cardiaci all’interno di ciascun segmento del cuore della Drosophila.

HANCs può rappresentare un prototipo di Drosophila di cellule della cresta neurale? La morfogenesi del cuore dei vertebrati coinvolge due diversi tipi di cellule, la primordia del cuore mesodermico e una sottopopolazione di cellule della cresta neurale che migrano dalla regione della testa. In questo articolo, abbiamo dimostrato che in Drosophila un gruppo di cellule nonmesodermiche provenienti dall’epidermide della testa (che abbiamo chiamato HANCs) contribuisce alla morfogenesi finale del cuore. Come nelle cellule della cresta neurale dei vertebrati, gli HANCs subiscono movimenti diretti, entrano in contatto con le cellule cardiache e partecipano allo schema della regione di deflusso cardiaco. Abbiamo dimostrato che i geni homeobox lb noti per essere coinvolti nella diversificazione dei precursori cardiaci (5, 11) sono espressi in HANCs e sono necessari per la loro specifica. Allo stesso modo, l’ortolog di lb, il gene Lbx1, è stato recentemente trovato necessario per la specificazione di un sottoinsieme di cellule della cresta neurale cardiaca nel topo (23), indicando che i geni lb/Lbx1 svolgono un ruolo conservato nella specificazione dei componenti nonmesodermici del cuore. In questa visione, gli HANCs potrebbero effettivamente essere confrontati con le cellule della cresta neurale dei vertebrati. Tuttavia, i nostri dati indicano anche che gli HANCs mostrano almeno due caratteristiche specifiche solo per la Drosophila: (i) si muovono come parte dell’ectoderma della testa piegata e non come cellule di cresta neurale delaminate; e (ii) formano un complesso funzionale con COM, che non hanno strutture omologhe nei vertebrati. Pertanto, sono necessarie ulteriori analisi per chiarire il ruolo esatto degli HANCs e le loro potenziali funzioni cellulari della cresta neurale.