TESTO

La proteina CCAAT / enhancer-binding porta sequenza omologia e somiglianze funzionali alla proteina attivatore del fegato (LAP, o CEBPB; 189965) (Descombes et al., 1990). Vedi Landschulz et al. (1989).

Usando rat Cebp-alpha per schermare una libreria di cDNA del fegato umano, seguita da screening di una libreria genomica della placenta umana, Swart et al. (1997) clonato full-length CEBP-alpha. La proteina 357-amminoacido dedotta ha un dominio di transattivazione N-terminale e un dominio di dimerizzazione e legame del DNA C-terminale. L’analisi Northern blot ha rilevato un’elevata espressione di una trascrizione CEBP-alfa di 2,7 kb nella placenta umana, nel fegato e nella milza. L’espressione più bassa è stata rilevata nel colon, nella muscolatura liscia, nel polmone e nel midollo renale e nessuna espressione è stata rilevata nella corteccia renale. Il CEBP-alfa è stato espresso anche nella pelle umana normale e psoriasica, nei cheratinociti umani in coltura e nell’aorta e nel fegato di ratto. L’analisi immunoistochimica ha rilevato CEBP-alfa nei nuclei dei cheratinociti epidermici dalla pelle umana normale e dalla pelle psoriasica lesionale. La colorazione intensa è stata rilevata nelle cellule soprabasali, nei cheratinociti del follicolo pilifero e nei sebociti ghiandolari, ma non nelle cellule dell’infiltrato infiammatorio o dei capillari.

Swart et al. (1997) ha determinato che il gene CEBPA è intronless.

Mediante ibridi di cellule somatiche che segregano cromosomi umani o di ratto, Szpirer et al. (1992) ha mappato il gene CEBP sul cromosoma umano 19 e sul cromosoma 1 del ratto. Questi risultati hanno fornito ulteriori prove per la conservazione di synteny su questi cromosomi (e sul cromosoma 7 del topo). Utilizzando ibridi di cellule somatiche umane / criceto contenenti frammenti limitati del cromosoma umano 19, Hendricks-Taylor et al. (1992) mappato il gene CEBPA al cromosoma 19q13.1, tra i geni GPI (172400) e TGFB1 (190180). Questa posizione è stata confermata dall’ibridazione in situ della fluorescenza. Birkenmeier et al. (1989) mappato il gene Cebpa al cromosoma 7 del topo.

Miller et al. (1996) ha caratterizzato il promotore del gene umano che codifica la leptina (164160), un fattore di segnalazione espresso nel tessuto adiposo con un ruolo importante nell’omeostasi del peso corporeo. Hanno scoperto che CEBPA modula l’espressione della leptina e ha suggerito una funzione per CEBPA nel trattamento dell’obesità umana.

Wang et al. (2001) ha scoperto che CEBPA interagisce direttamente con CDK2 (116953) e CDK4 (123829) e arresta la proliferazione cellulare inibendo queste chinasi. Una regione compresa tra gli amminoacidi 175 e 187 del CEBPA è stata determinata come responsabile dell’inibizione diretta delle chinasi ciclina-dipendenti e ha causato l’arresto della crescita nelle cellule coltivate. CEBPA ha inibito l’attività di CDK2 bloccando l’associazione di CDK2 con le cicline. Le attività di Cdk4 e Cdk2 sono state aumentate nei fegati knockout di Cebpa di topo, portando ad un aumento della proliferazione.

Il fattore di trascrizione mieloide CEBPA è cruciale per la granulopoiesi normale e le mutazioni dominanti-negative del gene CEBPA si trovano in una percentuale significativa di cellule maligne da pazienti con sottotipi mieloblastici (M1 e M2) di leucemia mieloide acuta (AML; 601626). Pabst et al. (2001) ha dimostrato che la proteina di fusione AML1 (RUNX1; 151385)-ETO (CBFA2T1; 133435) sopprimeva l’espressione di CEBPA. Helbling et al. (2004) ha scoperto che la proteina di fusione leucemica AML1-MDS1-EAI1 (AME; vedi 151385) sopprimeva la proteina CEBPA. In contrasto con la fusione AML1-ETO, AME non è riuscito a sopprimere l’espressione di mRNA CEBPA. Helbling et al. (2004) ha trovato che un inibitore putativo della traduzione di CEBPA, calreticulin (CRT; 109091), è stato fortemente attivato dopo induzione di AME in un sistema sperimentale di linea cellulare (14,8 volte) e in campioni di pazienti AME (12,2 volte). Inoltre, l’inibizione della CRT da parte di piccoli RNA interferenti ha ripristinato i livelli di CEBPA. Questi risultati hanno identificato il CEBPA come un obiettivo chiave della proteina di fusione leucemica AME e hanno suggerito che la modulazione del CEBPA mediante CRT può rappresentare un meccanismo coinvolto nel blocco di differenziazione nelle leucemie AME.

Menard et al. (2002) ha dimostrato che il Cebpa è stato espresso nelle cellule progenitrici corticali del topo e potrebbe indurre l’espressione di un gene reporter contenente il promotore minimo di alfa-tubulina (TUBA1A; 602529), un gene neurone-specifico.

Skokowa et al. (2006) trovato significativamente diminuita o assente LEF1 (153245) espressione in promielociti arrestati da pazienti con neutropenia congenita (vedere 202700). Le analisi competitive di immunoprecipitazione della cromatina e del legame (ChIP) hanno indicato che LEF1 direttamente ha legato a e ha regolato CEBPA, suggerendo che il downregulation LEF1-dipendente di CEBPA nella neutropenia congenita conduce ad un blocco di maturazione in promielocytes simile a quello veduto in AML dominante-negativo di CEBPA.

Mediante analisi peptidica di proteine nucleari che hanno interagito con CEBPA, Bararia et al. (2008) identificato TIP60 (KAT5; 601409) come partner vincolante CEBPA. L’interazione è stata confermata da analisi di coprecipitazione e test di pull-down delle proteine. TIP60 ha migliorato la capacità di CEBPA di transattivare un promotore TK (TK1; 188300) contenente 2 siti CCAAT e l’attività dell’istone acetiltransferasi di TIP60 era necessaria per la sua cooperatività con CEBPA. L’analisi del dominio ha rivelato che TIP60 ha interagito con i domini di legame al DNA e di transattivazione di CEBPA. L’analisi di immunoprecipitazione ha mostrato che TIP60 è stato reclutato per i promotori di CEBPA e GCSFR (CSF3R; 138971) a seguito della differenziazione indotta da beta-estradiolo delle cellule di leucemia mieloide K562, che era concomitante con l’acetilazione dell’istone ai promotori CEBPA e GCSFR.

Reddy et al. (2009) ha mostrato che microRNA-661 (MIR661; 613716) espressione downregulated di MTA1 (603526), un gene che è upregulated in parecchi cancri. Hanno identificato siti di legame CEBP-alfa putativi nella regione promotrice del gene MIR661. Le analisi del gene reporter hanno mostrato che CEBP-alpha ha sovraregolato l’espressione MIR661 nelle cellule di cancro al seno HELA e MDA-231 trasfette. L’espressione di CEBP-alfa e MIR661 era inversamente proporzionale a quella di MTA1 nelle linee cellulari del cancro al seno e il livello della proteina MTA1 era progressivamente sovraregolato con un aumento del potenziale metastatico. La sovraespressione di MIR661 nelle cellule di cancro al seno MDA-231 ha inibito la motilità cellulare, l’invasività e la crescita indipendente dall’ancoraggio e ha ridotto la loro capacità di formare tumori in un modello di xenotrapianto. Reddy et al. (2009) ha concluso che CEBP-alpha riduce l’espressione MTA1 e la crescita delle cellule tumorali aumentando l’espressione di MIR661.

Di Ruscio et al. (2013) ha presentato dati che dimostrano che la trascrizione attiva regola i livelli di metilazione genomica. Hanno identificato un nuovo RNA non codificante nucleare nonpolyadenylated (ncRNA) derivante dal locus del gene CEBPA che è fondamentale nella regolazione del profilo di metilazione locale del DNA. Hanno chiamato questo ncRNA ‘extracoding CEBPA’ (ecCEBPA) perché comprende l’intera sequenza di mRNA nello stesso senso di orientamento. ecCEBPA lega a DNMT1 (126375) ed impedisce la metilazione del locus del gene di CEBPA. Il sequenziamento profondo dei trascritti associati a DNMT1 combinato con metilazione su scala genomica e profilazione dell’espressione ha esteso la generalità di questa scoperta a numerosi loci genici. Di Ruscio et al. (2013) ha concluso che questi risultati hanno delineato la natura delle interazioni DNMT1-RNA e suggerito strategie per la demetilazione gene-selettiva di bersagli terapeutici nelle malattie umane.

Nelle cellule B primarie di topo, Di Stefano et al. (2014) ha scoperto che l’espressione transitoria di CEBPA seguita da Oct4 (164177), Sox2 (184429), Klf4 (602253) e Myc (190080) (collettivamente nota come OSKM) induce un aumento di 100 volte nell’efficienza di riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), coinvolgendo il 95% della popolazione. Durante questa conversione, la pluripotenza e i geni di transizione epiteliale-mesenchimale diventano marcatamente sovraregolati e il 60% delle cellule esprime Oct4 entro 2 giorni. CEBPA agisce come un pathbreaker in quanto rende transitoriamente la cromatina dei geni di pluripotenza più accessibile a DNaseI (125505). CEBPA induce anche l’espressione della diossigenasi Tet2 (612839) e promuove la sua traslocazione al nucleo dove si lega alle regioni regolatorie dei geni di pluripotenza che diventano demetilati dopo induzione OSKM. In linea con questi risultati, la sovraespressione di Tet2 migliora la riprogrammazione delle cellule B indotta da OSKM. Poiché l’enzima è anche necessario per un’efficiente conversione delle cellule immunitarie indotta da CEBPA, i dati di Di Stefano et al. (2014) ha indicato che TET2 fornisce un collegamento meccanicistico tra la riprogrammazione delle cellule iPS e la transdifferenziazione delle cellule B.

Leucemia mieloide acuta

In membri affetti di una famiglia con leucemia mieloide acuta (AML; 601626), Smith et al. (2004) ha identificato una delezione germinale 1-bp (212delC) nel gene CEBPA, con conseguente presenza di 5 residui di citosina in una regione in cui 6 residui di citosina sono presenti nella sequenza wildtype. La leucemia palese si è sviluppata nel padre all’età di 10 anni, nel figlio primogenito all’età di 30 anni e nell’ultima figlia nata all’età di 18 anni.

Mutazioni somatiche

Pabst et al. (2001) ha osservato che nel sistema ematopoietico, il CEBPA è espresso esclusivamente nelle cellule mielomonocitiche. È specificamente sovraregolato durante la differenziazione granulocitica. Non si osservano granulociti maturi nei topi Cebpa-mutanti, mentre tutti gli altri tipi di cellule del sangue sono presenti in proporzioni normali. Nella leucemia mieloide acuta (601626), l’anomalia più prominente è un blocco nella differenziazione delle esplosioni granulocitiche. Con queste informazioni di base, Pabst et al. (2001) ha studiato campioni da pazienti con AML e ha dimostrato che CEBPA è mutato nel 16% dei pazienti con AML-M2 che mancano dell ‘ 8;21 traslocazione (ETO, 133435; RUNX1, 151385). Hanno scoperto che 5 mutazioni nel terminale N troncavano la proteina a lunghezza intera, ma non influenzavano la proteina 30-kD avviata più a valle. Le proteine mutate hanno bloccato il legame del DNA wildtype C / EBP-alfa e la transattivazione dei geni bersaglio dei granulociti in modo dominante-negativo e non sono riusciti a indurre la differenziazione granulocitica. Questo è stato il primo rapporto di mutazioni di CEBPA nella neoplasia umana. Pabst et al. (2001) ha rilevato 5 delezioni, 2 inserzioni e 4 mutazioni puntiformi nel gene CEBPA (vedi, ad esempio, 116897.0001-116897.0003). Tutte le eliminazioni hanno causato uno spostamento nello stesso frame di lettura alternativo, poiché il numero di basepairs mancanti era (3n+1). L’età media alla diagnosi dei pazienti con mutazioni di CEBPA era di 66 anni. Mutazioni di CEBPA sono state riscontrate nel 7,3% dei pazienti affetti da LMA.

Snaddon et al. (2003) ha dichiarato che la traslocazione t (8;21) si riscontra nel 10-15% dei casi di LMA, in particolare quelli del sottotipo M2, dove rappresenta il 40% dei casi. Utilizzando un approccio PCR-SSCP e sequenziamento, sono stati sottoposti a screening per mutazioni CEBPA in 99 pazienti con AML di tipo M1 o M2. Hanno identificato 9 mutazioni somatiche di CEBPA in 8 pazienti. Tutte le mutazioni sono state raggruppate verso il terminale C della proteina. Due pazienti portavano mutazioni bialleliche: uno era omozigote per un inserimento di 57 bp al nucleotide 1137 (116897.0004) e l’altro era eterozigote composto per un inserimento di 27 bp al nucleotide 1096 (116897.0005) e un inserimento di 4 bp (GGCC) al nucleotide 363 (116897.0006).

Per esplorare l’evoluzione della regolazione genica, Schmidt et al. (2010) ha usato l’immunoprecipitazione della cromatina con sequenziamento ad alto throughput (ChIP-seq) per determinare sperimentalmente l’occupazione genomica di 2 fattori di trascrizione, CEBPA e HNF4A (600281), nei fegati di 5 vertebrati: Homo sapiens, Mus musculus, Canis familiaris, Monodelphis domesticus (opossum dalla coda corta) e Gallus gallus. Sebbene ogni fattore di trascrizione mostrasse preferenze di legame del DNA altamente conservate, la maggior parte del legame era specie-specifico e gli eventi di legame allineati presenti in tutte e 5 le specie erano rari. Le regioni vicine ai geni con livelli di espressione che dipendono da un fattore di trascrizione sono state spesso vincolate dal fattore di trascrizione in più specie, ma non hanno mostrato alcun vincolo di sequenza del DNA migliorato. La divergenza di legame tra le specie può essere in gran parte spiegata da cambiamenti di sequenza ai motivi legati. Tra gli eventi di binding persi in un lignaggio, solo la metà viene recuperata da un altro evento di binding entro 10 kb. Schmidt et al. (2010) ha concluso che i loro risultati hanno rivelato grandi differenze interspecie nella regolamentazione trascrizionale e hanno fornito informazioni sull’evoluzione normativa.

Secondo la nomenclatura proposta da Cao et al. (1991), la proteina CCAAT/enhancer-binding è C/EBP-alfa e NF-IL6 (LAP) è C/EBP-beta, con i geni corrispondenti che sono CEBPA e CEBPB (189965). CEBPB era precedentemente simboleggiato TCF5.

Wang et al. (1995) ha scoperto che i topi omozigoti per la delezione mirata del gene Cebpa non immagazzinavano glicogeno epatico e morivano di ipoglicemia entro 8 ore dalla nascita. In questi topi mutanti, le quantità di mRNA glicogeno sintasi (138571) erano dal 50 al 70% del normale e l’induzione trascrizionale dei geni per 2 enzimi gluconeogeni, fosfoenolpiruvato carbossichinasi (261680) e glucosio-6-fosfatasi (613742), è stata ritardata. Gli epatociti e gli adipociti dei topi mutanti non sono riusciti ad accumulare lipidi e l’espressione del gene per la proteina di disaccoppiamento (113730), il marcatore che definisce il tessuto adiposo bruno, è stata ridotta. I risultati hanno dimostrato che C / EBP-alfa è fondamentale per la creazione e il mantenimento dell’omeostasi energetica nei neonati.

Flodby et al. (1996) realizzato topi knockout transgenici in cui il gene CEBPA è stato selettivamente interrotto. I topi Cebpa -/- mutanti omozigoti morivano, di solito entro le prime 20 ore dopo la nascita e presentavano difetti nel controllo della crescita epatica e dello sviluppo polmonare. L’analisi istologica ha rivelato che questi animali avevano gravemente disturbato l’architettura del fegato, con formazione di acinare, in un modello suggestivo di fegato rigenerante o carcinoma epatocellulare. L’istologia polmonare ha mostrato iperproliferazione di pneumociti di tipo II e architettura alveolare disturbata. L’analisi molecolare ha mostrato che l’accumulo di glicogeno e lipidi nel fegato e nel tessuto adiposo è compromesso e che gli animali mutanti sono gravemente ipoglicemici. Gli autori hanno scoperto dall’analisi Northern blot che i livelli di RNA c-myc e c-jun sono specificamente indotti da diverse volte nei fegati di questi animali che indicano uno stato proliferativo attivo. Hanno scoperto da immunoistologia che le cellule macchiate di ciclina sono presenti nel fegato di topi Cebpa -/- a una frequenza da 5 a 10 volte superiore rispetto al normale, indicando anche una proliferazione anormalmente attiva. Flodby et al. (1996) ha suggerito che il CEBPA può avere un ruolo importante nell’acquisizione e nel mantenimento della differenziazione terminale negli epatociti.

I topi carenti di Cebpa hanno uno sviluppo difettoso del tessuto adiposo. Wu et al. (1999) fibroblasti utilizzati da topi Cebpa -/- in combinazione con vettori retrovirali che esprimono Cebpa e recettore-gamma attivato dal proliferatore del perossisoma (PPARG; 601487) per determinare il ruolo preciso del CEBPA nell’adipogenesi. Gli autori hanno scoperto che i fibroblasti Cebpa -/- hanno subito differenziazione adiposa attraverso l’espressione e l’attivazione di Pparg. Gli adipociti Cebpa-carenti hanno accumulato meno lipidi e non hanno indotto Pparg endogeno, indicando che la regolazione incrociata tra CEBPA e PPARG è importante per mantenere lo stato differenziato. Le cellule hanno anche mostrato una completa assenza di insulina (INS; 176730)-stimolato il trasporto del glucosio, secondario alla ridotta espressione genica e alla fosforilazione della tirosina per il recettore Ins (147670) e il substrato del recettore Ins-1 (147545). Wu et al. (1999) ha concluso che CEBPA ha molteplici ruoli nell’adipogenesi e che la regolazione incrociata tra PPARG e CEBPA è una componente chiave del controllo trascrizionale di questo lignaggio cellulare.