Per una cellula, le membrane compartimentalizzano la vita. La membrana cellulare, che avvolge l’intera cellula, separa fisicamente l’interno della cellula dallo spazio extracellulare. Ma non è solo una partizione – la membrana cellulare media il trasporto di ioni che regolano la cottura neuronale, fornisce un sito di attracco per le molecole di segnalazione che permettono alle cellule di comunicare tra loro e contiene molecole che permettono al sistema immunitario di identificare una cellula come “sé” piuttosto che “non-sé.”All’interno del complesso interno della cellula, i compartimenti legati alla membrana svolgono processi biochimici critici, come la lavorazione delle proteine e la produzione di energia.

Nonostante la loro importanza, c’è ancora molto da imparare sulle membrane. Poiché i lipidi e le proteine che formano le membrane si muovono costantemente, spostandosi e riorganizzandosi per soddisfare i bisogni della cellula, studiare le membrane è estremamente difficile. Questo dinamismo ostacola gli scienziati perché le tecniche sperimentali tradizionali, come la cristallografia, non funzionano bene con una membrana fluida, spiega il professore di fisica Mathias Lösche.

“Le membrane sono intrinsecamente disordinate. Se vuoi studiare qualcosa usando la cristallografia, devi cristallizzarlo per studiarlo con i raggi X. Quindi hai bisogno di una struttura ordinata che si ripeta più e più volte. Questo è qualcosa che non si può fare con le membrane, quindi è necessario escogitare nuove tecniche di caratterizzazione e nuovi approcci, sia in fisica sperimentale che teorica e biologia, al fine di studiare questi problemi.”

Gli scienziati MCS hanno inventato e stanno utilizzando una suite di strumenti per acquisire una conoscenza più approfondita delle proprietà molecolari delle membrane. Questo lavoro ha importanti implicazioni per comprendere il normale comportamento delle cellule e cosa va storto in malattie come l’HIV, il morbo di Alzheimer e malfunzionamenti di elaborazione delle proteine che portano a cancro e disturbi neurologici.

Furtivamente oltre la Sentinella cellulare

La membrana esterna della cellula agisce come un cancello, impedendo agli intrusi di invadere la cellula. Ma i virus, come l’HIV, riescono a intrufolarsi attraverso la barriera protettiva della cellula. Stephanie Tristram-Nagle, professore associato di ricerca in fisica biologica, e il suo collaboratore John Nagle, professore di fisica e scienze biologiche, ha recentemente fatto un’importante scoperta che aiuta la comprensione del perché l’HIV è in grado di accedere alle cellule immunitarie con tale apparente facilità.

Gli scienziati sanno da più di 20 anni che l’HIV si fonde con le cellule immunitarie tramite gp41, una proteina situata sulla superficie del virus. Sebbene gli scienziati abbiano immagini a raggi X di gp41 prima e dopo che si fonde con la membrana cellulare, capire esattamente cosa succede durante la fusione era un mistero, fino ad ora.

Tristram-Nagle e Nagle hanno preparato pile di migliaia di bilayer lipidici completamente idratati utilizzando un nuovo metodo sviluppato nel loro laboratorio. I lipidi nella parte inferiore della pila sono attaccati ad un supporto solido, dando alla membrana del modello la stabilità necessaria per essere studiata sperimentalmente, mentre i doppi strati lipidici nella parte superiore della pila mantengono la loro naturale fluidità, un requisito chiave per qualsiasi sistema modello biologicamente rilevante. Tristram-Nagle seminato le membrane artificiali con HIV fusion peptide 23 (FP-23), un breve tratto di gp41 noto per svolgere un ruolo chiave nella fusione virale. Usando la tecnica di scattering diffuso a raggi X, Tristram-Nagle e Nagle hanno quantificato le proprietà strutturali dei doppi strati lipidici in presenza di FP-23. Dopo aver analizzato i dati a raggi X diffusi, hanno scoperto che FP-23 diminuisce drasticamente l’energia necessaria per piegare la membrana, rendendo molto più facile per il virus fondersi con e infettare le cellule immunitarie.

“Nelle cellule, le membrane si piegano continuamente, il che richiede energia”, ha detto Tristram-Nagle. “Abbiamo scoperto che l’energia necessaria per piegare la membrana è notevolmente diminuita – fino a 13 volte – quando abbiamo aggiunto FP-23. Questo dovrebbe aiutare a spiegare, in parte, come l’infezione da HIV si verifica così facilmente.”

Una nuova svolta su un dibattito secolare

Nel suo ruolo di gatekeeper, la membrana cellulare regola il traffico molecolare dentro e fuori la cellula attraverso proteine di membrana specializzate. I canali ionici, proteine che coprono la membrana cellulare, sono un esempio prominente. Regolando gli ioni che entrano ed escono dalla cellula, i canali ionici sono una componente vitale nell’iniziazione e nella propagazione degli impulsi elettrici nelle cellule nervose. Una disfunzione nel canale ionico stesso o nella membrana in cui risiede può causare una varietà di disturbi neurologici, tra cui il morbo di Alzheimer.

Nel cervello di coloro che soffrono di malattia di Alzheimer sono placche insolubili che contengono peptidi misfolded chiamati beta amiloide (Aß). Le placche Aß si accumulano tra le cellule nervose e sono state implicate nella malattia da quando Alois Alzheimer le ha scoperte per la prima volta 100 anni fa. Negli ultimi anni, gli scienziati hanno ipotizzato che gli oligomeri di Aß-aggregati di Aß intermedi tra il singolo peptide e le placche mature – interagiscano in qualche modo con le membrane delle cellule nervose, ma il meccanismo effettivo della tossicità cellulare rimane poco chiaro.

“Sappiamo che gli oligomeri Aß interagiscono fortemente con le membrane e interferiscono con la loro capacità di preservare i gradienti ionici tra l’interno e l’esterno della cellula. Tuttavia, rimane una sfida enorme determinare se gli oligomeri Aß effettivamente fanno un buco nella membrana, o se influenzano le proprietà della membrana quanto basta per alterare le proprietà critiche dei canali della membrana” spiega Lösche.

Con le tecniche di scattering neutronico, Lösche e colleghi del National Institute of Standards and Technology (NIST) stanno studiando come Aß interagisce con modelli di membrana sintetica chiamati “membrane lipidiche a doppio strato tethered” (tBLMs). I TBLM sono costituiti da un doppio strato lipidico chimicamente collegato a un substrato solido, ad esempio un wafer di silicio, tramite legami polimerici.

“Queste membrane tethered sono molto potenti perché sono estremamente stabili. Possiamo manipolarli e misurarli per lunghi periodi. Questo è straordinario per un opuscolo squisitamente fragile di materiale fluido di spessore di 5 nanometri”, ha affermato Lösche.

In collaborazione con i chimici dell’Università della California a Irvine, il team di Lösche ha incubato i TBLM con oligomeri Aß e ha studiato la risposta strutturale e funzionale della membrana presso il NIST Center for Neutron Research di Gaithersburg, Md. Hanno osservato una rottura delle proprietà isolanti del doppio strato lipidico, che fa sì che la membrana perda ioni. Ma la firma della perdita della membrana è distinta da quella di altre disfunzioni della membrana, che il gruppo di Lösche ha studiato in dettaglio. Ad esempio, alcuni batteri rilasciano una tossina, alfa-emolisina, che si inserisce nelle membrane delle cellule ospiti, formando canali che causano perdite di ioni pieni d’acqua. Nel confrontare la modalità di funzionamento dell’alfa-emolisina con quella di Aß, sta diventando chiaro che gli oligomeri di Aß non si limitano a “perforare” la membrana, secondo Lösche.

Il gruppo di Lösche ora estende questo lavoro in collaborazione con Markus Deserno, professore associato di fisica, che sviluppa modelli al computer di membrane cellulari.

“Si può fare tanto con gli esperimenti, ma a causa del disordine intrinseco della membrana biologica è impossibile guardare tutti gli aspetti del dettaglio atomico o della dinamica molecolare. Queste cose possono essere fatte su un computer”, spiega Deserno.

Deserno e colleghi del Max Planck Institute for Polymer Research di Mainz, in Germania, hanno creato una simulazione al computer che segue il comportamento di una membrana artificiale composta da 50.000 singole molecole lipidiche. Ogni molecola lipidica è semplicemente rappresentata come tre sfere.

“Il nostro modello è a grana grossa”, spiega Deserno. “Si può pensare ad esso come un dipinto impressionista. A distanza, tutto sembra a posto. Puoi vedere ninfee o ballerine. Ma da vicino, tutti i dettagli sono andati; vedi solo macchie di colore. Siamo interessati a ciò che sta accadendo con le ninfee, non le macchie di colore”, dice.

Con questo modello a grana grossa, Deserno può catturare caratteristiche importanti, come il modo in cui la membrana si piega e si curva, il che gli consente di porre domande che vanno oltre il livello atomico ma meno del livello su un’intera cellula. Il suo modello è anche versatile; può aggiungere proteine specifiche di interesse alla membrana lipidica e osservare come interagiscono. Il prossimo passo per Deserno e Lösche è quello di seminare la membrana artificiale nel modello computerizzato di Deserno con proteine Aß per ottenere ulteriori indizi su come Aß danneggia la membrana.

Membrana legata

La membrana esterna della cellula non è l’unica membrana che svolge processi critici e vitali. Le cellule compartimentalizzano i loro interni in organelli legati alla membrana, come il reticolo endoplasmatico (ER) e l’apparato di Golgi, per eseguire vari compiti, come la produzione di proteine, in modo più efficiente.

Ma la membrana di un organello è molto più di una semplice barriera. Le membrane svolgono un ruolo chiave nel trasporto delle proteine dal pronto soccorso all’apparato del Golgi, all’interno del Golgi e poi dal Golgi alla loro destinazione finale all’interno della cellula.

“Molte malattie si verificano quando c’è un malfunzionamento nel traffico di membrane”, ha detto Adam Linstedt, professore di scienze biologiche. I ricercatori hanno scoperto che decine di malattie genetiche umane derivano da difetti nel traffico di membrane, tra cui diverse malattie neurodegenerative e disturbi dello sviluppo.

Linstedt, insieme a Christina Lee, assistente professore di scienze biologiche, sta studiando i percorsi di traffico delle membrane nel Golgi e nel pronto soccorso e imparando molto sulla struttura degli organelli lungo il percorso.

Linstedt ha identificato un gruppo di proteine coinvolte nella formazione del nastro del Golgi, una struttura complessa di sottocomparti del Golgi, o pile, interconnessi da tubuli. Le pile e gli enzimi al loro interno funzionano come una catena di montaggio, elaborando migliaia di proteine e lipidi appena sintetizzati che si muovono attraverso il Golgi. Mentre una proteina appena sintetizzata si muove all’interno di una pila, gli enzimi modificano la proteina aggiungendo componenti come carboidrati o fosfati. Nel momento in cui la proteina lascia il Golgi, è stata completamente elaborata. Utilizzando una tecnica chiamata RNA interference, Linstedt ha inibito l’espressione delle proteine Golgi GM130 e GRASP 65 e ha scoperto che le pile di Golgi non si sono riunite in un nastro. Nelle cellule senza nastro, Linstedt ha scoperto che alcune delle pile non collegate avevano livelli più alti di enzimi mentre altre avevano livelli più bassi, a differenza di quando le pile sono orientate in un nastro e hanno una distribuzione uguale di enzimi Golgi. Livelli enzimatici uniformi potrebbero essere critici, secondo Linstedt, perché le cellule con un nastro di Golgi non collegato avevano proteine sotto-elaborate. L’elaborazione alterata può portare a gravi difetti dello sviluppo in una varietà di organismi, dai topi agli esseri umani.

“Nessuno sapeva a cosa servisse il nastro,” ex – plains Linstedt. “Ora abbiamo una spiegazione: il nastro è importante per equilibrare la concentrazione enzimatica attraverso l’intera rete di membrana ed è necessario per una corretta elaborazione delle proteine.”

Il Golgi svolge un ruolo importante nell’elaborazione finale delle proteine, ma le proteine sono inizialmente assemblate nell’ER, una singola rete membranosa continua che si estende dal nucleo alla membrana cellulare. Lee adotta un approccio biochimico allo studio dell’ER, rompendo le cellule aperte e lavando con il sale, che rimuove le molecole elettrostaticamente legate alla membrana ER. Dopo aver testato queste molecole una alla volta per vedere il loro effetto sulla membrana ER, Lee ha identificato un fattore chiave coinvolto nella formazione di una rete ER estesa. Il fattore, una variante dell’enzima nucleoside difosfato chinasi (NDKB), era già noto per funzionare nelle cellule ma non era stato collegato alla morfologia della membrana. Si scopre che NDKB si lega direttamente ai fosfolipidi acidi nella membrana ER e può assemblare per formare un’impalcatura che stabilizza la rete di membrana estesa.

“C’è un enorme flusso di membrana che inizia nel pronto soccorso e si sposta verso la superficie cellulare”, spiega Linstedt. “Gran parte di questo flusso di membrana è generato dalle vescicole che si formano da un compartimento e si fondono con il compartimento successivo. In teoria, se comprendessimo meglio questi processi, potremmo indirizzare i percorsi del traffico di membrane per combattere le malattie.”

Mentre gli scienziati MCS utilizzano gli strumenti della biologia per comprendere la funzione cellulare di base e gli strumenti della fisica per stuzzicare le proprietà fisiche delle membrane, si avvicinano di un passo alla comprensione di come funzionano le membrane in salute e malattia.

“Credo che se biologi, fisici, ingegneri e matematici si confrontano tutti insieme, arriveremo a nuove intuizioni molto più velocemente e con maggiore sicurezza”, ha detto Deserno.