Abstract
La crescente pressione della vita sociale moderna intensifica l’impatto dello stress sullo sviluppo delle malattie cardiovascolari, che includono la trombosi venosa profonda (TVP). La denervazione simpatica renale è stata applicata come uno degli approcci clinici per il trattamento dell’ipertensione resistente ai farmaci. Inoltre, la stretta relazione tra stress ossidativo e malattie cardiovascolari è stata ben documentata. Il presente studio è progettato per esplorare il meccanismo con cui il sistema nervoso simpatico renale e lo stress ossidativo influenzano il sistema di coagulazione del sangue nello sviluppo della TVP. Il modello di shock cronico del piede nei ratti è stato applicato per imitare uno stato di stress fisiologico simile agli esseri umani. I nostri risultati hanno mostrato che la procedura di shock cronico del piede potrebbe promuovere la TVP che può essere attraverso l’attivazione dell’aggregazione piastrinica. L’aggravamento della TVP e l’attivazione delle piastrine sono stati alleviati mediante denervazione simpatica renale o trattamento antiossidante (Tempol). Contemporaneamente, il trattamento di denervazione potrebbe anche ridurre i livelli di fattori di ossidazione circolanti nei ratti. Questi risultati dimostrano che sia il sistema nervoso simpatico renale che lo stress ossidativo contribuiscono allo sviluppo della TVP in risposta allo stress cronico, che può fornire una nuova strategia per il trattamento dei pazienti con TVP clinica.
1. Introduzione
La trombosi venosa profonda (TVP) è una comune malattia cardiovascolare associata a sequele, embolia polmonare, che è la terza causa più comune di morte per malattie cardiovascolari dopo infarto e ictus. Un flusso sanguigno lento, danni alla parete venosa e uno stato ipercoagulabile sono i tre principali fattori di rischio per lo sviluppo della TVP. Di conseguenza, anticoagulanti e trombolitici sono i due trattamenti principali per i pazienti con TVP clinica. La triade dei fattori di rischio che predispongono alla formazione di trombi, postulata da Virchow, include cambiamenti nel rapporto tra i componenti del sangue, l’integrità della parete del vaso e la velocità del flusso sanguigno. Il sistema di coagulazione del sangue svolge un ruolo chiave nella protezione dei mammiferi contro il sanguinamento letale. In tutte le forme di trombosi, la coagulazione e l’infiammazione sono le due vie principali che agiscono insieme per coordinare le risposte del corpo alla lesione .
Negli ultimi decenni, fattori psicologici, come lo stress e la depressione, sono stati riconosciuti come fattori importanti che influenzano la salute umana . Lunghi periodi di ansia indurranno lo sviluppo di malattie cardiovascolari. Inoltre, verificandosi simultaneamente, la depressione e l’ansia aggraveranno ulteriormente lo sviluppo delle malattie cardiovascolari. Inoltre, lo stress e altri fattori psicologici hanno dimostrato di essere strettamente correlati all’insorgenza di ictus e infarto miocardico . Numerosi studi hanno anche dimostrato che lo stress può causare danni strutturali duraturi a tessuti e organi . La procedura di shock elettrico cronico del piede è stata caratterizzata come un modello di stress psicologico incontrollabile e imprevedibile , che ha dimostrato di essere in grado di indurre un aumento della pressione arteriosa sistolica . Tuttavia, non esiste ancora alcun rapporto relativo agli effetti dello shock cronico sullo sviluppo della TVP.
Il ruolo del nervo renale simpatico nello sviluppo dell’ipertensione è stato dimostrato sia nelle osservazioni sperimentali che cliniche . Esistono due tipi di nervo renale simpatico: nervi afferenti renali e nervo efferente renale. Le fibre simpatiche afferenti provengono dai reni e modulando il deflusso simpatico centrale modificano direttamente l’ipertensione neurogena. Allo stesso tempo, il nervo efferente aumenta la ritenzione di sodio e acqua, stimola il rilascio di renina e altera il flusso sanguigno renale . In questo modo, sia la pressione sanguigna a breve che a lungo termine potrebbero essere influenzate dal nervo simpatico renale . Studi clinici hanno riportato gli effetti benefici della denervazione simpatica renale in pazienti con ipertensione refrattaria . Oltre all’effetto abbassante della denervazione sulla pressione sanguigna, sono stati riportati ulteriori benefici anche in malattie cardiovascolari, diabete , disfunzione renale, ipertrofia cardiaca , insufficienza cardiaca e aritmie . L’ipertensione, un importante fattore di rischio per molte malattie, può aumentare la disfunzione endoteliale e promuovere la trombosi ed è anche strettamente correlata all’incidenza delle malattie vascolari cardiocerebrali . Pertanto, la denervazione simpatica renale può fornire una nuova strategia nella prevenzione e nel trattamento delle malattie cardiovascolari in condizioni di stress elevato.
Recentemente, gli esperimenti mostrano che lo stress ossidativo potrebbe essere responsabile del cambiamento nella funzione endoteliale . L’aumento delle specie reattive dell’ossigeno prodotte dall’endotelio vascolare e dalle cellule del sangue circolanti comprometterà le funzioni di barriera vasomotoria ed endoteliale e migliorerà la formazione di trombi . Lo stress ossidativo è stato anche trovato per essere un determinante di attivazione piastrinica, che era il fattore di rischio per aterotrombosi. Tuttavia, se lo stress cronico potrebbe influenzare il sistema di coagulazione aumentando lo stress ossidativo è ancora sconosciuto.
Attualmente, nessun rapporto collega direttamente lo stress psicologico con il sistema di coagulazione e le malattie vascolari cardiocerebrali. Considerando che l’attivazione del sistema di coagulazione ha un’influenza importante sia sull’emostasi fisiologica che sulla trombosi patologica , abbiamo applicato il modello di stress da shock del piede nei ratti per esplorare se la cronica potrebbe influenzare lo sviluppo della TVP e dei possibili meccanismi coinvolti.
2. Materiali e metodi
2.1. Preparazione animale
I ratti Sprague-Dawley maschi di dieci settimane, ottenuti dal Shanghai Laboratory Animal Center, sono stati utilizzati in questo studio. Gli animali sono stati mantenuti in un ambiente a temperatura controllata di 25°C con un ciclo di luce : buio di 12 : 12 ore. I ratti esposti al protocollo di stress sono stati inseriti individualmente in una scatola di stress da shock del piede, dove hanno ricevuto una sessione di 4 ore di shock elettrico del piede attraverso un pavimento a griglia elettrificata che fornisce uno shock di 5 secondi di 0,15 mA ogni 30 secondi. Il nervo simpatico renale del ratto è stato reciso chirurgicamente mentre gli animali erano sotto un’anestesia indotta da idrato di cloralio al 10%. Dopo un periodo di recupero di una settimana, è stato avviato il protocollo di shock del piede. Tempol (10 mg / kg / die) è stato somministrato per iniezione intraperitoneale dopo l’inizio del protocollo di stress . La trombosi venosa è stata indotta in condizioni anestetizzate con idrato di cloralio al 10% come precedentemente descritto da Leung . In breve, l’addome è stato aperto e la vena cava inferiore (IVC), dopo essere stata accuratamente separata dai tessuti circostanti, è stata legata strettamente appena sotto la vena renale sinistra usando un filo di cotone. Quindi, l’addome è stato chiuso con un doppio strato di suture, chiudendo prima il peritoneo con i muscoli e poi la pelle separatamente. Dopo dodici ore, gli animali sono stati anestetizzati di nuovo, l’addome è stato riaperto e il plasma e il trombo sono stati raccolti per ulteriori analisi . Il presente studio è stato realizzato in conformità con la Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e altri scopi scientifici (Consiglio d’Europa numero 123, Strasburgo, 1985). Tutte le procedure chirurgiche sono state approvate dall’Università di Soochow ed eseguite in conformità con le linee guida per la cura e l’uso degli animali stabilite dall’Università di Soochow.
2.2. Misure dei livelli plasmatici di corticosterone
I livelli plasmatici di corticosterone sono stati misurati utilizzando un kit di analisi immunoassorbente enzimatico (ELISA) disponibile in commercio (TSZ Elisa, USA).
2.3. Misure del peso del trombo
Dalla cavità addominale riaperta, il segmento legante della vena cava è stato rimosso e aperto longitudinalmente per rimuovere il trombo formato, che è stato risciacquato e pesato su carta da filtro.
2.4. L’analisi dei parametri di coagulazione del sangue
Tempo di protrombina (PT), tempo di tromboplastina parziale attivata (APPT) e tempo di trombina (TT) sono stati misurati utilizzando un analizzatore automatico di coagulazione del sangue (Sysmex Corporation CA-50, Giappone). Dalla cavità addominale riaperta, il sangue (4,5 mL) è stato raccolto dalla vena cava inferiore utilizzando una siringa monouso, contenente 0,5 ml di una soluzione di citrato di sodio al 3,8% e trasferito in provette da centrifuga autoclavate. Metà del sangue è stato centrifugato a 3000 giri / min per 10 min e il siero è stato raccolto. Un’aliquota sierica di 0,1 ml è stata combinata a 0.1 ml di reagente PT. Dopo il preriscaldamento per 20 min, il PT è stato misurato utilizzando un analizzatore automatico di coagulazione del sangue, come menzionato sopra. L’APPT e il TT sono stati misurati utilizzando lo stesso metodo del PT.
L’aggregazione piastrinica è stata misurata utilizzando un analizzatore di aggregazione piastrinica (Chrono-Log 560 Ca, Germania). Dopo la riapertura della cavità, 4,5 ml di sangue sono stati raccolti dalla vena cava inferiore utilizzando una siringa monouso contenuta con 0,5 ml di citrato di sodio (3,8%) e quindi trasferiti in provetta da centrifuga. La seconda metà del sangue è stata centrifugata a 1000 rpm per 10 min per ottenere il plasma ricco di piastrine. Il sangue rimasto nel tubo è stato centrifugato a 3000 giri / min per 10 min per preparare il plasma povero di piastrine. Quindi, la coagulazione dei campioni di plasma è stata stimolata utilizzando proteine di collagene e adenosina difosfato disodio (ADP) (1 mM, 10 mL) come agonisti piastrinici.
2.5. Determinazione della concentrazione plasmatica di noradrenalina (NA)
I livelli plasmatici di noradrenalina (NA) sono stati misurati utilizzando un kit ELISA (TSZ Elisa, USA) disponibile in commercio.
2.6. La misurazione dei livelli di perossidazione lipidica e dell’attività plasmatica di superossido dismutasi (SOD) e glutatione perossidasi (GSH-Px)
L’attività plasmatica di SOD e GSH-Px e i livelli di perossidazione lipidica (sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico, TBARS) sono stati misurati utilizzando i kit ELISA (TSZ Elisa, USA) disponibili in commercio.
2.7. Analisi statistiche
Tutti i dati sono stati presentati come media ± SEM. La significatività statistica dei confronti tra più di due gruppi è stata testata utilizzando un ANOVA a due vie seguito dal test Newman-Keuls o utilizzando un test dello studente a due code spaiato. valori< 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
3. Risultati
3.1. Effetto del trattamento con shock, denervazione e Tempol sulle concentrazioni plasmatiche di corticosterone
I livelli plasmatici di corticosterone (il marker dello stress) sono stati marcatamente aumentati nel gruppo shock del piede rispetto al gruppo di controllo (, Figura 1) e sono stati marcatamente soppressi sia nel gruppo denervazione più shock che nel gruppo Tempol più shock rispetto al gruppo shock del piede da solo (, Figura 1). Questo risultato ha indicato che lo shock cronico del piede aumentava significativamente il corticosterone plasmatico quando il corpo era sotto stress, e sia la denervazione che il trattamento con Tempolo potevano alleviare lo stato di stress.
3.2. Effetto dello shock, della denervazione e del trattamento con Tempol sul peso dei trombi indotti dalla legatura IVC
I trombi sono stati raccolti 12 ore dopo la legatura IVC e ponderati. Nel gruppo shock del piede, il peso del trombo è stato significativamente aumentato rispetto a quello del gruppo di controllo (, Figura 2). Tuttavia, il peso del trombo dei gruppi denervazione più shock e Tempol più shock è rimasto invariato rispetto ai trombi del gruppo di controllo, ma è stato significativamente diminuito rispetto ai trombi del gruppo shock del piede (Figura 2). Questi risultati suggeriscono che lo shock cronico potrebbe facilitare la formazione di TVP, mentre sia la denervazione che il trattamento con Tempolo potrebbero inibire l’aumento indotto dallo stress della formazione di TVP.
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3.3. Effetto dello shock, della denervazione e del trattamento con Tempol sui parametri di coagulazione del sangue
Dopo la raccolta del sangue dall’IVC, sono stati misurati i parametri ematici (PT, APPT, TT e aggregazione piastrinica). C’era una differenza significativa nei parametri PT, TT e aggregazione piastrinica tra il controllo e i gruppi di shock del piede. Il PT del gruppo shock del piede era inferiore a quello del gruppo di controllo; tuttavia, i parametri di TT e aggregazione piastrinica erano più alti nel gruppo shock del piede rispetto al gruppo di controllo. In parallelo, è stata osservata una diminuzione significativa nei parametri TT e aggregazione piastrinica dei gruppi denervazione più shock e Tempol più shock rispetto al gruppo shock del piede (Tabella 1 e Figura 3). Questi risultati rivelano che lo shock cronico potrebbe migliorare il sistema di coagulazione attivando l’aggregazione piastrinica.
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| PT, prothrombin time; APPT, activated partial thromboplastin time; TT, tempo di trombina; rispetto al gruppo di controllo; rispetto al gruppo di shock. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
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3.4. Effetto dello shock, della denervazione e del trattamento con Tempol sulle concentrazioni plasmatiche di noradrenalina (NA)
Lo shock del piede ha aumentato significativamente i livelli plasmatici di noradrenalina (NA) rispetto al gruppo di controllo (Figura 4). I livelli plasmatici di NA nel gruppo denervation plus shock e Tempol plus shock sono stati significativamente soppressi rispetto al gruppo foot shock (Figura 4). Questi risultati confermano il successo della procedura chirurgica di denervazione renale.
3.5. Effetto dello shock, della denervazione e del trattamento con Tempol sull’attività plasmatica di SOD e GSH-Px e sui livelli di TBARS
L’attività plasmatica di SOD nel gruppo di stress è stata notevolmente ridotta rispetto al gruppo di controllo (Figura 5(a)). L’attività plasmatica della SOD nei gruppi denervazione più shock e Tempol più shock è stata marcatamente elevata rispetto al gruppo shock del piede(Figura 5 (a)).
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Anche l’attività plasmatica di GSH-Px nel gruppo shock del piede era nettamente superiore a quella del gruppo di controllo (Figura 5(b)). L’attività plasmatica GSH-Px nei gruppi denervazione più shock e Tempol più shock è stata marcatamente elevata rispetto al gruppo shock del piede(Figura 5 (b)).
Lo shock del piede ha portato ad un marcato aumento dei livelli plasmatici di sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBAR) rispetto al gruppo di controllo (Figura 5(c)). I livelli plasmatici di TBARS nei gruppi denervation plus shock e Tempol plus shock sono stati marcatamente soppressi rispetto al gruppo foot shock (Figura 5(c)).
4. Discussione
In questo studio, abbiamo identificato che la formazione della TVP è facilitata in condizioni di stress e che i cambiamenti nel sistema di coagulazione del sangue sono indotti dallo stress. I dati accumulati hanno dimostrato che lo stress psicologico cronico ha attivato due sistemi: uno è il sistema di corteccia ipotalamo-ipofisi-surrenale (HPA) che è stato principalmente mediato dal rilascio di catecolamina, cortisolo, vasopressina, endorfine e aldosterone ; l’altro è attraverso l’attivazione del sistema midollare simpatico-surrenale . Come mostrato nei dati, i livelli di corticosterone del gruppo di shock cronico sono stati significativamente aumentati, indicando che l’HPA è stata attivata. Qual è il ruolo del sistema nervoso simpatico in risposta allo stress? Poiché è stato dimostrato che l’attivazione del sistema simpatico renale è altamente correlata allo sviluppo dell’ipertensione e la denervazione renale è un nuovo trattamento clinico per i pazienti ipertesi refrattari, il sistema simpatico renale deve svolgere un ruolo importante nelle malattie cardiovascolari. Inoltre, recenti osservazioni mostrano che la condizione di stress elevato è altamente correlata alle malattie cardiovascolari, in particolare infarto cardiaco e cerebrale; pertanto, ipotizziamo se lo stress cronico attiverà il sistema di coagulazione attraverso l’attivazione del sistema nervoso simpatico renale. Nel presente studio, in primo luogo abbiamo scoperto che lo stress cronico potrebbe aggregare la formazione di TVP, suggerendo che lo stress aumenterà il rischio di malattie cardiovascolari. Inoltre, abbiamo misurato i parametri che definiscono l’attività del sistema di coagulazione del sangue, tra cui PT, APPT, TT e aggregazione piastrinica. I nostri dati hanno mostrato che c’è stato un cambiamento significativo nell’aggregazione piastrinica indotta sia dall’ADP che dal collagene, suggerendo che l’effetto aggravante dello stress sulla formazione della TVP è stato mediato dall’attivazione delle piastrine. I nostri risultati rivelano in primo luogo il meccanismo che collega la condizione di stress elevato e le malattie cardiovascolari. Sebbene i nostri dati attuali dimostrino chiaramente il ruolo del sistema nervoso simpatico renale nello sviluppo cronico indotto da shock della TVP, è difficile identificare se il nervo afferente o efferente gioca un ruolo importante a causa della limitazione della procedura chirurgica. Ipotizziamo che entrambi siano coinvolti in; la ragione è che il nervo afferente potrebbe influenzare il controllo neurogenico della pressione sanguigna che può contribuire allo sviluppo della TVP; e il nervo efferente potrebbe regolare la secrezione renale di noradrenalina che può anche contribuire allo sviluppo della TVP.
La presenza di endotelio danneggiato e fattori di coagulazione attivati o piastrine facilita lo sviluppo e la progressione della TVP . L’aggregazione piastrinica (cioè quando le piastrine aderiscono l’una all’altra) che si verificano nei siti di lesione vascolare è stata a lungo riconosciuta come critica per lo sviluppo di trombosi . Nel presente studio, ci siamo concentrati principalmente sulla funzione piastrinica nella TVP. I fenomeni di adesione, rilascio o aggregazione piastrinica sono noti anche come attivazione piastrinica . Le piastrine attivate svolgono un ruolo importante nel processo di trombosi. I nostri dati mostrano che l’aggregazione piastrinica è aumentata dopo il trattamento dello stress, insieme al miglioramento della formazione della TVP. La conta piastrinica è stata utilizzata per normalizzare la misura dell’attività piastrinica; tuttavia, non sono state eseguite statistiche sul numero di piastrine in ciascun gruppo.
Le nostre analisi dell’attività plasmatica di GSH-Px e SOD, così come il livello di TBARS plasmatici, hanno mostrato che il corpo è in uno stato di stress ossidativo indotto dal trattamento di shock cronico del piede, che è stato inibito dalla denervazione renale. Diversi rapporti hanno dimostrato che l’attività dell’ossidasi NAD(P)H potrebbe essere aumentata direttamente dai recettori α1 e β2 attraverso le catecolamine (CA) rilasciate dal nervo simpatico renale. Inoltre, gli antagonisti del recettore β1 hanno dimostrato di ridurre lo stress ossidativo vascolare causato dall’attivazione dell’ossidasi NAD(P)H. Pertanto, possiamo dire che l’innervazione simpatica renale aumenta direttamente i livelli di stress ossidativo. È stato riportato che l’aggregazione piastrinica, un ulteriore fattore di rischio per il trombo, è associata a stress ossidativo . Lo stress ossidativo potrebbe aumentare direttamente l’aggregazione piastrinica attraverso radicali liberi dall’ossigeno situati sulla superficie piastrinica . Prove solide hanno dimostrato che lo stress ossidativo potrebbe attivare direttamente le piastrine attraverso una varietà di modi. Come il prodotto dello stress ossidativo O2 – potrebbe reagire con piastrine o endotelio, quindi NON derivato da ONOO -, che è di particolare importanza per la trombosi vascolare, ha anche tali effetti. Diversi studi hanno dimostrato che O2− potrebbe ridurre la soglia per l’attivazione piastrinica a trombina, collagene o ADP e O2− potrebbe anche essere in grado di indurre l’aggregazione spontanea . La piastrina attivata potrebbe anche produrre ROS; il ruolo di questo ROS endogeno è simile al ROS esogeno nell’attivazione piastrinica. In generale, esistono diversi scenari che portano all’aggregazione piastrinica indotta da stress. Nel primo, il nervo simpatico renale viene attivato dallo stress, che porta ad un aumento dello stress ossidativo in tutto il corpo che viene poi seguito da un aumento dell’aggregazione piastrinica. Nell’altro scenario, lo stress innesca direttamente la produzione di stress ossidativo del corpo, che aumenta direttamente l’aggregazione piastrinica. La denervazione del nervo simpatico renale può influenzare direttamente l’attivazione piastrinica, tuttavia, il cui meccanismo rimane da esplorare.
I nostri dati hanno mostrato che il trattamento dello stress cronico non ha alcun effetto significativo su APPT o PT, suggerendo che la TVP facilitata dallo stress potrebbe non essere associata al sistema di coagulazione estrinseco o intrinseco. Tuttavia, il trattamento dello stress cronico potrebbe aumentare notevolmente la TT, il che indica che il tempo di conversione del fibrinogeno in fibrina è stato prolungato a causa di un’iperfibrinolisi. Quindi, ipotizziamo che l’iperfibrinolisi fibrinolitica fosse dovuta a una maggiore coagulazione del sangue in condizioni di stress cronico. Contemporaneamente, la denervazione renale e il trattamento antiossidante potrebbero ridurre l’aggregazione piastrinica, che a sua volta sopprimeva la coagulazione del sangue. Sulla base dei nostri dati, abbiamo potuto osservare che il TT tendeva verso un tasso normale in queste due condizioni rispetto al gruppo di shock.
Va notato che, nella nostra presente osservazione, abbiamo scoperto che il trattamento con Tempol potrebbe ridurre l’aumento cronico indotto dallo stress dei livelli di corticosterone, suggerendo il coinvolgimento dello stress ossidativo nel rilascio di ormoni indotti dall’attivazione HPA, indicando che il trattamento antiossidante può fornire alcuni effetti benefici nella lesione d’organo indotta dall’attivazione HAP. Tuttavia, non abbiamo trovato alcuna differenza tra denervazione e trattamenti antiossidanti in nessun parametro, indicando che il nervo simpatico e lo stress ossidativo possono contribuire indipendentemente allo sviluppo della TVP indotta da shock cronico.
In conclusione, lo stress cronico potrebbe aumentare l’aggregazione piastrinica direttamente tramite l’attivazione del nervo simpatico renale e l’aumento dello stress ossidativo. Quindi, la TVP viene facilitata dall’aumento dell’aggregazione piastrinica. Numerosi studi hanno dimostrato che l’aterosclerosi e altre malattie cardiovascolari sono strettamente associate allo stress ossidativo e che i pazienti spesso presentano bassi livelli di antiossidanti nel sangue e livelli migliorati di marcatori dello stress ossidativo . Quindi, in considerazione delle malattie vascolari cardiocerebrali e della TVP, possiamo prevenire e curare queste malattie indirizzando la terapia ai livelli ormonali e antiossidanti. Oltre a questo, è un nuovo modo di terapia attraverso il nervo simpatico renale.
Conflitto di interessi
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Contributo degli autori
Guo-Xing Zhang ha ideato e progettato gli esperimenti. Tao Dong, Yu-Wen Cheng, Pei-Wen Sun e Chen-Jie Zhu eseguirono gli esperimenti. Fei Yang ha assistito all’aggregazione piastrinica. Guo-Xing Zhang ha contribuito reagenti / materiali e ha analizzato i dati. Guo-Xing Zhang, Tao Dong e Yu-Wen Cheng hanno scritto il giornale.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati al professor Li Zhu e ad altri membri del laboratorio Zhu per la consulenza e l’assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81270316, 814170563) e dal programma di ricerca della Soochow University (Q413400111).
