Risultati

Identificazione della catena α del recettore IL-7 (CD127) come marker per le cellule T della memoria. Durante la ricerca di nuovi marcatori per definire effettori e sottoinsiemi di cellule T di memoria nel mouse, abbiamo analizzato l’espressione superficiale del recettore IL-7 α-chain / CD127 (Fig. 1 bis). Durante le risposte primarie alla Lm, si possono distinguere distinte sottopopolazioni di popolazioni di cellule T spleniche antigene-specifiche in base ai livelli di espressione di CD127. Le cellule a bassa espressione CD127 (CD127low) predominano durante la fase effettrice acuta. Durante la transizione nella fase delle cellule T di memoria, tuttavia, le cellule CD127low scompaiono gradualmente, mentre le popolazioni che esprimono livelli elevati (CD127high) rimangono notevolmente stabili nel tempo (Fig. 1 a e c). Questi valori cinetici distinti suggeriscono fortemente che l’espressione CD127 è una caratteristica selettiva per le cellule T a memoria lunga. Durante la fase effettuatrice, le cellule T CD127low CD8 + migrano preferenzialmente verso organi non linfoidi, mentre solo le cellule T CD127high CD8 + vengono rilevate in LN (Fig. 1 ter). La milza rappresenta un “organo intermedio” in cui tutte le diverse sottopopolazioni si trovano presto dopo l’immunizzazione (22, 23). Successivamente durante la fase di memoria, le cellule T antigene-specifiche in tutti gli organi sono caratterizzate da un fenotipo CD127alto (Fig. 1 b e c). Il confronto delle capacità delle cellule T specifiche dell’antigene CD127low e CD127high di proliferare in risposta alla stimolazione ha rivelato notevoli differenze tra i due sottoinsiemi. Come mostrato in Fig. 1d, le cellule T CD127high specifiche della Listeria purificate proliferano rapidamente dopo la stimolazione anti-CD3, mentre le cellule T CD127low proliferano male. È improbabile che queste differenze nella proliferazione riflettano un vantaggio delle cellule CD127-positive attraverso la stimolazione di IL-7R mediata da Ab, poiché diversi cloni di MAB con attività nota di attivazione o blocco di CD127 hanno dimostrato lo stesso effetto in saggi di stimolazione in vitro a breve termine (dati non mostrati).

Per dimostrare più direttamente che le cellule T a memoria lunga sono presenti esclusivamente nel compartimento ad alta espressione CD127 presto dopo l’adescamento in vivo, abbiamo eseguito studi di trasferimento adottivo utilizzando una tecnica di colorazione multimer reversibile MHC recentemente sviluppata (21) per isolare funzionalmente le cellule T specifiche dell’antigene direttamente ex vivo. Dopo il trasferimento adottivo di cellule T specifiche CD127high LLO91-99 da topi infettati per 10 giorni con Lm, le cellule trasferite erano ancora rilevabili diverse settimane dopo nella milza di topi riceventi ingenui (Fig. 2a), mentre i numeri di cella dopo il trasferimento delle cellule CD127low erano al limite di rilevamento. Questa osservazione non era dovuta a differenze di migrazione in vivo di cellule CD127 elevate e CD127 basse trasferite, perché abbiamo trovato differenze simili per il polmone (Fig. 2a ) e altri organi (LN e fegato, dati non mostrati). Per sostenere ulteriormente l’interpretazione che le cellule T CD127high mantengono esclusivamente cellule di memoria antigene-specifiche, i topi riceventi sono stati sfidati dopo il trasferimento adottivo con infezione da Listeria. Ancora una volta, solo nei topi che avevano ricevuto cellule T CD127high prima dell’infezione era rapida espansione delle cellule T LLO91–99-specifici trasferiti rilevabili (Fig. 2 ter). Ancora una volta, questo risultato non era dovuto a differenze nella migrazione perché il mantenimento o l’espansione delle cellule T CD127low trasferite non era rilevabile in nessun altro organo (Fig. 2b e dati non mostrati). Sebbene questi risultati degli studi di trasferimento adottivo sostengano fortemente l’ipotesi che le cellule T a memoria lunga siano presenti esclusivamente nel compartimento delle cellule T CD127high, abbiamo anche osservato limitazioni sostanziali di questo approccio sperimentale. In particolare, le cellule T di memoria con funzione effettuatrice immediata sembrano essere abbastanza sensibili agli esperimenti di trasferimento adottivo e muoiono rapidamente dopo la purificazione e l’applicazione endovenosa; sebbene sopravvivano per mesi o anni se rimangono intatte in vivo (11). Pertanto, sebbene i nostri risultati dal trasferimento adottivo siano conformi all’interpretazione che CD127 è un marker per le cellule T a memoria lunga, non possiamo escludere che anche i problemi intrinseci relativi alla sopravvivenza di distinte sottopopolazioni di cellule T contribuiscano al risultato di questi esperimenti.

Il costo delle popolazioni di cellule T antigene-specifiche con CD127 e CD62L consente la discriminazione tra le sottopopolazioni di cellule T di memoria. Un’ulteriore caratterizzazione della popolazione di cellule T CD127high ha mostrato che può essere suddivisa in sottopopolazioni che esprimono livelli alti e bassi di CD62L (Fig. 3). L’analisi funzionale diretta ex vivo (21) delle cellule T purificate (10-12 giorni dopo l’infezione, quando tutte le sottopopolazioni sono simultaneamente rilevabili nella milza) ha scoperto ulteriori differenze funzionali. Mentre i sottoinsiemi di cellule T CD62Llow mostrano un’attività citolitica ex vivo vigorosa e immediata, le cellule T CD127high/ CD62Lhigh dimostrano una lisi molto scarsa delle cellule bersaglio rivestite di peptidi (Fig. 3). La colorazione intracellulare delle citochine delle sottopopolazioni ordinate ha rivelato che le cellule T CD127high/CD62Llow, come il sottoinsieme CD127low/CD62Llow, producono le citochine effettrici INF-γ e il fattore di necrosi tumorale α; al contrario, il sottoinsieme CD127high/CD62Lhigh produce IL-2 ma non IFN-γ e il fattore di necrosi tumorale α. Pertanto, la combinazione marker di CD127 e CD62L consente l’identificazione di sottopopolazioni di cellule T con caratteristiche molto simili a quelle descritte in precedenza nell’uomo. Le cellule T CD127low/ CD62Llow dimostrano tutte le caratteristiche note di una popolazione di cellule T effettori reali (TE, scarsa attività proliferativa, limitata sopravvivenza in vivo e funzione effettore immediata). Il sottoinsieme CD127high / CD62Lhigh corrisponde alle caratteristiche di TCM, e il CD127high / Cd62low celle T misura la descrizione di TEM.

La generazione di distinte sottopopolazioni di cellule T a memoria dipende dall’aiuto delle cellule T mediato da CD40L. Poiché abbiamo ritenuto che potrebbe essere problematico basare esclusivamente l’interpretazione che l’espressione CD127 può essere utilizzata come marker per distinguere tra cellule T effettore e memoria longeva su esperimenti di trasferimento cellulare adottivo, abbiamo deciso di analizzare le linee mutanti del mouse con difetti nella generazione di memoria delle cellule T. Se CD127 è davvero un marcatore di cellule T di memoria “precoce”, dovremmo essere in grado di identificare le differenze durante i punti di tempo precoce e tardivo all’interno dei sottoinsiemi CD127-positivi nei topi con difetti di memoria.

Poiché studi recenti hanno dimostrato l’importanza dell’aiuto delle cellule T per la generazione di risposte di memoria di lunga durata (2-4), abbiamo deciso di determinare se la presenza o l’assenza di aiuto delle cellule T CD4+ durante l’adescamento delle cellule T CD8+ porta a differenze nelle composizioni del sottoinsieme di cellule T antigene-specifiche rilevate I topi MHC II-carenti, che mancano di cellule T CD4 + convenzionali, hanno una risposta di memoria CD8+ difettosa e la qualità della protezione diminuisce nel tempo (2-4). La colorazione per le sottopopolazioni delle cellule T 10 giorni dopo l’infezione primaria ha rivelato che il sottoinsieme CD127high/CD62Llow è quasi completamente assente nei topi MHC II–/– (Fig. 4a); le altre sottopopolazioni sono presenti a frequenze simili a quelle dei topi WT C57BL/6. Questi dati dimostrano che l’assenza di aiuto delle cellule T impedisce la generazione efficiente di un sottoinsieme di cellule T con un fenotipo di memoria effettore, che sembra essere cruciale per una rapida espansione in vivo e la funzione effettore.

Poiché importanti meccanismi di aiuto delle cellule T CD4+ sono mediati attraverso l’interazione di CD40 e CD40L (24-26), abbiamo studiato se i topi CD40L– / – mostrano un fenotipo simile a quello dei topi MHC II–/–. In accordo con altri studi recenti (27), i topi CD40L–/– non dimostrano differenze nella carica batterica o nella clearance batterica dopo l’infezione primaria da Listeria (dati non mostrati) e hanno normali risposte primarie delle cellule CD8+ T a una dose subletale di Lm (Fig. 4 quater). Tuttavia, la loro capacità di eliminare rapidamente la reinfezione con una dose più elevata di Lm (≈10 × LD50) è ridotta (Fig. 4b), in correlazione con le risposte compromesse delle cellule T della memoria CD8+ (Fig. 4c ) e un sottoinsieme CD127high/CD62Llow molto ridotto (Fig. 4 e ed f) durante la prima fase post-operatoria. Durante la reinfezione con Listeria, la proliferazione delle cellule T rispondenti nei topi CD40L–/– è equivalente a quella delle popolazioni cellulari nei topi WT, indicando che il fenotipo non è dovuto a un difetto generale nella capacità proliferativa delle cellule T di memoria (Fig. 4d) ma piuttosto a un numero ridotto di cellule T di memoria in grado di rispondere immediatamente all’antigene reencounter. Questo fenotipo è stato dimostrato da esperimenti di etichettatura in vivo in cui BrdUrd è stato incorporato durante l’intera fase di espansione (Fig. 4d ) e da studi in vivo BRDURD pulse–chase che monitorano la perdita di etichetta sulla proliferazione (dati non mostrati).

La generazione ridotta di sottoinsiemi di cellule T con un fenotipo di memoria effettore all’inizio dopo l’innesco viene trasmessa nel pool di cellule T di memoria tardiva. I nostri dati mostrano che in assenza di cellule T CD4+ o CD40L, il sottoinsieme di cellule T CD127high/CD62Llow viene significativamente ridotto presto dopo l’adescamento. Inoltre, noi (Fig. 4b) e altri (3-5) hanno dimostrato che l’aiuto alterato delle cellule T durante l’adescamento delle cellule T porta a cambiamenti nella qualità dell’immunità protettiva verso la reinfezione con Lm o il virus della coriomeningite linfocitica. Per collegare più chiaramente il difetto osservato nella prima generazione di cellule T CD127high / CD62Llow con la qualità della successiva memoria delle cellule T in questi topi, abbiamo analizzato le popolazioni di cellule T specifiche dell’antigene durante la fase di memoria (5 wk dopo l’infezione primaria da Listeria) in modo più dettagliato. A questo punto, l’analisi delle cellule T antigene-specifiche deve essere eseguita su cellule derivate da diversi tessuti a causa del loro comportamento migratorio distinto. Oltre alla milza, abbiamo scelto LN come tessuto rappresentativo per gli organi linfoidi e il polmone come tipico compartimento periferico non linfoide. In questo momento, le cellule T specifiche dell’antigene in questi organi sono quasi tutte CD127high (Fig. 1b); le cellule nel polmone sono CD62Llow (dati non mostrati), mentre la maggior parte delle cellule T di memoria antigene-specifiche nel LN sono CD62Lhigh (Fig. 5 ter). Per determinare il numero di cellule T a memoria antigene-specifica con chiara funzione effettrice immediata nei diversi organi, abbiamo eseguito la colorazione intracellulare delle citochine per IFN-γ. Come mostrato in Fig. 5a, i topi CD40L–/– sono caratterizzati da un numero sostanzialmente diminuito di cellule T di memoria antigene-specifiche con funzione effettore immediata rispetto ai topi WT. Questo risultato è vero sul livello delle frequenze (percentuale) all’interno del compartimento delle cellule T CD8+ e in numeri assoluti (Fig. 5 bis). Tuttavia, la colorazione del tetramero MHC dei linfociti derivati da LN (Fig. 5b) ha rivelato un numero quasi identico di cellule T antigene-specifiche con un fenotipo CD62Lhigh. Alcune cellule T specifiche dell’antigene CD62Llow sono rilevabili anche in LNs di topi WT, in correlazione con le frequenze delle cellule produttrici di IFN-γ (Fig. 5 bis). Questa popolazione è fondamentalmente assente in LNs di topi CD40L–/–; l’intero sottoinsieme CD8+/ CD62Llow è ridotto nei topi CD40L–/ -, suggerendo un difetto generale nella generazione di questo sottoinsieme di cellule T. In sintesi, i nostri dati mostrano che l’assenza di CD40L-dipendente CD4+ aiuto delle cellule T durante il periodo di priming si traduce in differenze quantitative nelle sottopopolazioni di cellule T CD8+ antigene-specifici, con un numero notevolmente ridotto di cellule che presentano un fenotipo di memoria effettore (CD127high/CD62Llow). Queste differenze quantitative nelle cellule con funzione effettore precoce immediata vengono trasmesse nella fase di memoria e influenzano la qualità dell’immunità protettiva.