l’Attivazione di Caspase e Specifico Scissione di Substrati dopo Coxsackievirus B3-Indotta Effetto Citopatico in Cellule HeLa

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ABSTRACT

Coxsackievirus B3 (CVB3), un enterovirus in familyPicornaviridae, induce citopatico cambiamenti nei sistemi di coltura di cellule e direttamente ferisce più suscettibili di organi e tessuti in vivo, tra cui il miocardio, subito dopo l’infezione. L’analisi biochimica della via di morte cellulare nelle cellule HELA infette da CVB3 ha dimostrato che la proforma 32-kDa della caspasi 3 viene scissa in seguito ai cambiamenti morfologici degenerativi osservati nelle cellule HeLa infette. I test di attivazione della caspasi confermano che la caspasi 3 scissa è proteoliticamente attiva. I substrati della caspasi 3 poli (ADP-ribosio) polimerasi, un enzima di riparazione del DNA, e il fattore di frammentazione del DNA, un inibitore citoplasmatico di un’endonucleasi responsabile della frammentazione del DNA, sono stati degradati a 9 h dopo l’infezione, producendo i loro caratteristici frammenti di scissione. Inibizione dell’attivazione della caspasi da parte del benzilossicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilchetone (ZVAD.fmk) non ha inibito l’effetto citopatico indotto dal virus, mentre l’inibizione dell’attivazione della caspasi da parte di ZVAD.fmk nelle cellule apoptotiche di controllo indotte dal trattamento con l’anello monoacido A del derivato benzoporfirina del fotosensibilizzatore della porfirina e la luce visibile ha inibito il fenotipo apoptotico. L’attivazione della caspasi e la scissione dei substrati potrebbero non essere responsabili del caratteristico effetto citopatico prodotto dall’infezione da picornavirus, ma potrebbero essere correlate ad alterazioni in fase avanzata dei processi omeostatici cellulari e dell’integrità strutturale.

Il Coxsackievirus B3 (CVB3) è un enterovirus della famiglia Picornaviridae. Dopo il legame con il recettore coxsackievirus e adenovirus (6, 64), l’RNA virale entra nel citoplasma, dove viene tradotto in una singola poliproteina dal macchinario di traslazione dell’ospite. La poliproteina viene quindi processata proteoliticamente dalle proteasi virali per produrre tutte le proteine strutturali e non strutturali virali. La RNA polimerasi RNA-dipendente codificata dal virus trascrive RNA virali a filamento negativo, che fungono da modelli per la sintesi di genomi di progenie multipli. Dopo il confezionamento virale, il virus viene rilasciato, potenzialmente sotto l’influenza della proteina 2B codificata dal virus (67). Durante il processo replicativo e il rilascio della progenie virale, si verifica l’effetto citopatico (CPE) e la cellula ospite viene ferita, con eventuale perdita di vitalità.

I processi cellulari ospite multipli sono alterati durante la parassitizzazione del picornavirus. La proteina virale 2Apro scinde direttamente il fattore di iniziazione eucariotico 4 gamma (eIF4G). La scissione di questo fattore di iniziazione della traduzione non solo abolisce la traduzione di mRNA cap-dipendente (19); si ritiene che i prodotti di scissione stimolino la traduzione di mRNA non cappato, come il genoma del picornavirus non cellulare (43), che utilizza un nuovo meccanismo di ingresso del ribosoma interno per iniziare la traduzione delle proteine (31, 76). Le proteine 2apro e 3Cprohave del poliovirus hanno indicato per fendere la proteina TATA-legante, con 3Cpro inoltre che interrompe la trascrizione delle RNA polimerasi I, II e III (11, 72, 74). I fattori di trascrizione TFIIIC (10), CREB (73) e Oct-1 (75) sono anche scissi da 3Cpro durante l’infezione da picornavirus. È stato dimostrato che la proteina CVB3 2B modifica il reticolo endoplasmatico e la permeabilità della membrana plasmatica (14), causando un aumento della concentrazione di calcio libero citosolico (28, 67) e delle lesioni della membrana che possono facilitare il rilascio di progenie virale. I gradienti ionici collassano (40, 52) e l’attività della fosfolipasi viene alterata (24, 29). L’infezione da CVB3 delle cellule HeLa provoca la fosforilazione della tirosina di due proteine cellulari a 4 ore di postinfezione e l’inibizione di queste fosforilazioni riduce significativamente la produzione di progenie virale (27). È chiaro che l’infezione è un processo cellulare dinamico in cui le interazioni tempestive fra le proteine virali e ospite determinano il risultato per sia il virus che le cellule ospiti.

Ora è chiaro che le proteasi della cisteina nella famiglia di enzimi caspasi sono molecole effettore chiave nella morte cellulare apoptotica. Una volta attivate, le caspasi scindono substrati specifici, tra cui poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) (35), fattore di frammentazione del DNA (DFF) (37), gelsolina (34), lamina A (58), proteine leganti gli elementi regolatori dello sterolo (68), α-fodrin (12, 66), chinasi di adesione focale (71) e mdm2 (18), tra molti altri. Tali eventi di scissione provocano importanti alterazioni ai normali processi cellulari omeostatici e ai corrispondenti cambiamenti morfologico-strutturali delle cellule.

Molti virus possiedono meccanismi biochimici per eludere e / o indurre l’apoptosi nelle cellule in cui risiedono (per le revisioni, vedere referenze49 e 60). Diversi virus interagiscono in diversi stadi del percorso di morte apoptotica. I virus hanno sviluppato strategie mirate al ligando Fas-Fas o al fattore di necrosi tumorale alfa (TNF–α)-complesso di segnalazione del recettore TNF, alla famiglia di regolatori Bcl-2 o alla famiglia caspasi dei carnefici (49, 60). I meccanismi di morte delle cellule infette da CVB3 rimangono da determinare; tuttavia, vi sono prove morfologiche limitate per quanto riguarda l’induzione dell’apoptosi nelle cellule infette da picornavirus. Le prove ottenute con il virus dell’encefalite murina di Theiler (32, 65) e il poliovirus (63) hanno indicato che le cellule infette da picornavirus subiscono apoptosi, sulla base di criteri morfologici tra cui la condensazione nucleare e la frammentazione del DNA.

Per determinare se le caspasi sono attivate e responsabili del CPE osservato dopo l’infezione da CVB3, le cellule HeLa (American Type Culture Collection, Rockville, Md.) sono stati infettati, a una molteplicità di infezione (MOI) di 5, con CVB3 (generosamente fornito da Charles Gauntt, University of Texas Health Sciences Center, San Antonio) o sham trattati con un mezzo minimo essenziale (MEM) privo di siero bovino fetale (FBS) per 45 min. Le cellule sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e la MEM completa contenente 10% FBS è stata quindi sostituita. Un controllo positivo dell’apoptosi consisteva in cellule HeLa trattate con l’anello monoacido A derivato della benzoporfirina fotosensibilizzante (BPD-MA) per 1 ora e quindi esposte alla luce visibile come descritto in precedenza (22, 23). Le colture sono state esaminate e raccolte a 0, 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e 12 ore di postinfezione. Le cellule sono state lavate due volte in PBS freddo e lisate in 1 ml di tampone di lisi (20 mm Tris , 137 mm NaCl, 10% glicerolo, 1% Nonidet P-40, 1 mm fenilmetilsolfonil fluoruro, 0,15 U di aprotinina per ml) per area di coltura di 75 cm2. Dopo un’incubazione di 20 minuti su ghiaccio, i supernatanti sono stati raccolti dopo centrifugazione a 10.000 ×g e conservati a -20°C per ulteriori analisi biochimiche.

Il modello temporale di produzione di proteine virali CVB3, virus progeny e l’evoluzione dei cambiamenti morfologici degenerativi delle cellule HeLa sono stati considerati in concomitanza con un esame delle proteine di morte delle cellule ospiti. I campioni di lisato cellulare sono stati separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide. Le proteine sono state trasferite alla nitrocellulosa (membrane di nitrocellulosa Hybond ECL; Amersham). Le membrane sono state incubate per 1 ora a temperatura ambiente in tampone di blocco (PBS con 0,1% tra 20 e 5% di latte magro in polvere). Dopo due lavaggi in tampone di lavaggio (PBS con 0.1% Tween 20), le membrane sono state incubate con anticorpi contro CVB3 (coniglio policlonale anti-CVB3, 1:1.000; Prodotti chimici accurati). Le membrane sono state lavate tre volte in tampone di lavaggio e incubate con un anticorpo secondario dell’immunoglobulina anti-coniglio dell’asino (Amersham). Le membrane sono state lavate tre volte e le immunoglobuline secondarie coniugate con perossidasi di rafano sono state rilevate con il metodo di chemiluminescenza potenziata (ECL, Amersham) ed esposte al film autoradiografico Iperfilm (Amersham). Aumenti significativi della sintesi proteica virale potrebbero essere rilevati tra 3 e 5 h postinfezione (Fig.1 TER). Le proteasi virali fendono le proteine virali come pure dell’ospite presto dopo l’infezione. Mediante analisi immunoblot con anti-eIF4G monoclonale di topo (1:1.000; Laboratori di trasduzione), è stato riscontrato che eIF4G viene scisso dalla proteasi virale 2A a partire da 1 h postinfezione, con ulteriore perdita di rilevamento della proteina 220-kDa da 5 h postinfezione (Fig. 1C). La quantità di CVB3 nel surnatante cellulare (virus rilasciato) è stata determinata su monostrati di cellule HeLa mediante il metodo di analisi della placca di sovrapposizione di agar come descritto in precedenza (3). In breve, il surnatante campione è stato diluito in serie 10 volte, le diluizioni sono state sovrapposte su monostrati confluenti dal 90 al 95% di cellule HeLa in piastre a sei pozzetti (Costar) e le cellule sovrapposte sono state incubate per 1 h (5% CO2, 37°C). Mezzo contenente virus nonbound è stato rimosso, e caldo MEM completo contenente 0,75% agar è stato sovrapposto in ogni pozzetto. Le piastre sono state incubate da 36 a 48 h (5% CO2, 37°C), fissate con il fissativo di Carnoy (95% di acido etanolo–acetico) e colorate con 1% di viola cristallina. Virus Progeny era presente nel surnatante a livelli basali tra 1 e 5 h. Da 6 h postinfezione c’era un aumento rilevabile nei livelli di virus surnatante, e la produzione esponenziale del virus è iniziata a 9 h postinfezione come determinato da saggi placca (Fig. 1 BIS). Le cellule HeLa hanno mostrato marcati cambiamenti nella morfologia, tra cui la condensazione cellulare, l’arrotondamento e il rilascio dal monostrato di coltura, tra 6 e 7 h dopo l’infezione, come notato dalla microscopia a contrasto (Fig. 1D).

iv xmlns:xhtml=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1.

Rilascio del virus CVB3 della progenie, produzione della cellula ospite di proteina virale CVB3, scissione della proteasi virale dell’ospite eIF4G e alterazioni della morfologia cellulare in seguito all’infezione da CVB3. (A) Il terreno di coltura è stato raccolto e analizzato per la ricerca di virus infettivi con il metodo di analisi della placca di sovrapposizione di agar. C’è stato un aumento della quantità di virus infettivo (in PFU per millilitro) rilasciato durante l’esperimento 12-h (B). Il lisato cellulare è stato raccolto dalle cellule HeLa infette da CVB3 e l’analisi immunoblot con un anticorpo policlonale CVB3 che riconosce le principali proteine virali è stata eseguita. (C) L’estratto citosolico è stato quindi analizzato per la presenza del componente 220-kDa eIF4G del complesso di iniziazione della traduzione. (D) È stata eseguita la microscopia a contrasto delle cellule HeLa a 1, 6, 7 e 12 ore di postinfezione. Si noti gli ampi cambiamenti citopatici che si sono verificati tra 6 e 7 h postinfezione.

Per determinare se il macchinario per la morte delle cellule ospiti è attivato in seguito all’infezione da CVB3, è stata eseguita l’analisi immunoblot del lisato raccolto in specifici punti temporali. La caspasi 3, che è presente nelle cellule come proteina precursore con una massa molecolare di 32 kDa, è una molecola primaria coinvolta nell’esecuzione della morte cellulare. Utilizzando mouse monoclonale anti-caspasi 3 (1: 1.000; Laboratori di trasduzione), è stato determinato che le cellule non infette contenevano la proteina precursore 32-kDa. Dopo l’infezione da CVB3, il livello della proteina precursore 32-kDa ha iniziato a diminuire tra 7 e 8 h postinfezione, ed era quasi completamente non rilevabile da 12 h postinfezione (Fig.2). Per determinare se la pro-caspasi 3 impoverita fosse stata trattata proteoliticamente da uno zimogeno a catena singola al suo enzima attivo a due catene, i lisati delle cellule HeLa sono stati incubati con substrati fluorescenti della caspasi 3 come descritto in precedenza (23). Brevemente, i lisati cellulari sono stati incubati con tampone di reazione (20 mm Tris , 137 mm NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% glicerolo) contenente 100 µM caspase 3 substrato acetil-Asp-Glu-Val-Asp–7-ammino-4-metilcoumarina (Ac-DEVD-AMC) (Calbiochem, Cambridge, Mass.) o Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluorometilcumarina (Z-DEVD-AFC) (Enzyme Systems Products, Livermore, Calif.). La miscela di reazione è stata incubata a 37°C per 2 h e l’eccitazione a fluorescenza di AMC o AFC a 380 o 400 nm, rispettivamente, è stata misurata a 460 o 505 nm, rispettivamente, con un citofluorometro 2350 cytofluorometer (Perseptive Biosystems, Burlington, Ontario, Canada). Utilizzando questo approccio, l’attività della caspasi 3 è stata evidente dalla postinfezione di 5 ore. L’aumento dell’attività della caspasi 3 da 7 a 10 ore di postinfezione, quando è stato raggiunto il livello massimo di attivazione, è stato mantenuto fino a 12 ore di postinfezione (Fig. 2). Questo saggio sulla proteasi ha dimostrato che la caspasi 3 era in forma attiva nelle cellule infette e che era in grado di processare proteoliticamente altre caspasi e substrati.

Fig. 2.

Attivazione della caspasi 3 e scissione della proforma 32-kDa in seguito all’infezione da CVB3 delle cellule HeLa. A) Dieci microgrammi di lisato cellulare sono stati incubati in 150 µl di tampone di reazione contenente il substrato specifico della caspasi 3 Ac-DEVD-AMC. Dopo incubazione a 37°C per 1 h, i livelli di fluorescenza sono stati determinati con una lunghezza d’onda di eccitazione di 380 nm e una lunghezza d’onda di emissione di 460 nm. Si noti l’aumento della fluorescenza, che rappresenta l’attività della caspasi, che inizia dopo 7 ore di postinfezione e aumenta fino ai livelli massimi di 10 ore di postinfezione. (B) I lisati delle cellule di HeLa sono stati separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e trasferiti alla nitrocellulosa. Immunoblotting per la presenza del proforma 32-kDa di caspasi 3 dimostra che questa proteina viene processata tra 7 e 12 h postinfection.

La caspasi 3 scinde substrati specifici a residui di acido aspartico (42). PARP, una proteina nucleare coinvolta nella riparazione del DNA (13, 69), ha dimostrato di essere un substrato per la caspasi 3 attivata e per altre caspasi (35). Nelle cellule apoptotiche, il PARP viene scisso da una proteina 116-kDa, producendo frammenti di 85 e 25 kDa, determinati con anticorpi per l’ammino e il carbossile termini della proteina, rispettivamente. Nelle cellule HeLa infette da CVB3, la degradazione PARP, con la comparsa di un frammento di 85-kDa, è stata rilevabile da 9 h postinfezione, con ulteriore riduzione dei livelli del peptide 116-kDa da 10 e 12 h postinfezione, come determinato dall’analisi immunoblot con anti-PARP monoclonale di topo (1: 2,000; Biomol) (Fig. 3).

Fig. 3.

Scissione specifica dei substrati di PARP e DFF da parte della caspasi 3 a seguito di infezione da CVB3. (A) Il lisato cellulare è stato raccolto dalle cellule HELA infette da CVB3 e l’analisi immunoblot è stata eseguita con un anticorpo anti-PARP che riconosce un frammento di scissione 85-kDa. Si noti che la scissione di PARP è iniziata a 9 h dopo l’infezione, con una marcata perdita della proteina nativa 116-kDa che si verifica da 10 h postinfezione. (B) Il lisato cellulare è stato analizzato allo stesso modo per la scissione DFF mediante immunoblotting a seguito dell’infezione da CVB3. Si noti la modifica dello stato DFF a partire da 9 h postinfection, con la comparsa di un frammento di 30 kDa.

La DFF è una proteina citosolica che può essere scissa dalla caspasi 3 (37). Una volta scissa, questa proteina rilascia un’endonucleasi che migra verso il nucleo, dove può scindere il DNA nei siti internucleosomiali, con conseguente frammentazione del DNA (16). In precedenza è stato dimostrato che la degradazione del DNA internucleosomiale è una caratteristica cellulare dell’infezione da picornavirus (32). Come determinato utilizzando il coniglio policlonale anti-DFF (generosamente fornito da Xiaodong Wang, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas), DFF è scisso da una proteina 45-kDa, producendo un frammento di 30-kDa a partire da 9 h dopo l’infezione, con continua elaborazione e perdita della proteina 45-kDa tra 10 e 12 h postinfection (Fig. 3).

Per determinare se le caspasi producono direttamente il CPE caratteristico che si verifica in seguito all’infezione da picornavirus o sono attivate in seguito alle alterazioni morfologiche, le cellule sono state trattate con l’inibitore generale della caspasi benzilossicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilchetone (ZVAD.fmk). Una soluzione madre (100 mm in dimetilsolfossido) di ZVAD.fmk (Bachem) è stato diluito in MEM completo a concentrazioni comprese tra 0 e 200 µM e le diluizioni sono state incubate con cellule per 30 min prima dell’infezione o del trattamento leggero. Dopo l’infezione da CVB3, le cellule sono state lavate con PBS e MEM completa contenente 10% FBS e ZVAD fresco.fmk (da 0 a 200 µM) è stato quindi sostituito. Questo peptide ha dimostrato di inibire l’induzione di alterazioni morfologiche da stimoli apoptotici multipli (46, 54). ZVAD.fmk a concentrazioni di 50, 100 e 200 µM ha bloccato sia l’attività della caspasi che la scissione di PARP e DFF nelle cellule HeLa BPD – MA-e trattate con luce (controllo positivo per l’apoptosi) (Fig. 4). Nelle cellule HeLa infette da CVB3, la scissione di PARP e DFF è stata parzialmente prevenuta dall’inibitore a concentrazioni di 50 e 100 µM (Fig. 4). Alla più alta concentrazione dell’inibitore (200 µM), non c’era evidenza di frammenti di scissione PARP o DFF nelle cellule trattate con CVB3 a 10 h dopo l’infezione. La scissione della caspasi di proteine strutturali come actina, gelsolina, lamina B e chinasi di adesione focale è responsabile delle alterazioni morfologiche osservate dopo l’induzione dell’apoptosi (42, 45). A 2 h dopo la fotoattivazione di BPD-MA, le cellule HeLa erano condensate, avevano un’ampia blebbing della membrana e si stavano rilasciando dal monostrato (Fig.5). A concentrazioni crescenti di ZVAD.fmk, questo fenotipo apoptotico non era evidente, con le cellule che mantengono una morfologia simile a quella delle cellule di controllo(Fig. 5). Le cellule HeLa infette da CVB3 sono state condensate e rilasciate dal monostrato, ma non hanno mostrato blebbing della membrana a 10 h dopo l’infezione (Fig. 5). Blocco dell’attività della caspasi da parte di ZVAD.fmk a concentrazioni fino a 200 µM non ha alterato il fenotipo citopatico anche se la scissione dei substrati (DFF e PARP) è stata inibita.

Fig. 4.

ZVAD-fmk inibisce l’attivazione della caspasi e la scissione di PARP e DFF dopo l’infezione da CVB3 o l’induzione dell’apoptosi mediante trattamento delle cellule HeLa con BPD-MA e light. (A) Il lisato cellulare è stato incubato in un tampone di reazione contenente il substrato specifico della caspasi 3 Ac-DEVD-AFC. Dopo incubazione a 37°C per 1 h, i livelli di fluorescenza sono stati determinati con una lunghezza d’onda di eccitazione di 400 nm e una lunghezza d’onda di emissione di 505 nm. Si noti la mancanza di attivazione della caspasi nelle cellule HeLa trattate con ZVAD-fmk (da 50 a 200 µM) a 10 ore dopo l’infezione da CVB3 e a 2 ore dopo il trattamento con BPD-MA e light. (B) Il lisato cellulare è stato raccolto dalle cellule HELA trattate e l’analisi immunoblot è stata eseguita con un anticorpo anti-PARP. Si noti la scissione equivalente di PARP nelle cellule HeLa infette da CVB3 senza ZVAD.fmk e le cellule HeLa BPD – MA-e trattate con luce senza ZVAD.fmk. ZVAD.il trattamento con fmk (da 50 a 200 µM) delle cellule HeLa ha impedito il trattamento PARP nelle cellule HeLa trattate con BPD-MA e trattate con luce, mentre nelle cellule HeLa trattate con CVB3 il trattamento PARP è stato limitato, ma non completamente inibito, dal trattamento con ZVAD.fmk a 50 o 100 µM. (C) L’analisi immunoblot della scissione DFF a 10 ore dopo l’infezione da CVB3 e a 2 ore dopo il trattamento con BPD-MA e light ha mostrato che il pattern di scissione era simile a quello di PARP. Le culture infette da sham sono state trattate allo stesso modo delle culture infette, senza virus.

Fig. 5.

Effetti di ZVAD.trattamento di fmk sui cambiamenti morfologici delle cellule dopo l’infezione di CVB3 o BPD-MA e trattamento leggero delle cellule di HeLa. Le cellule HeLa sono state trattate con ZVAD.fmk a 0-200 µM e poi infettato con CVB3 o trattato con BPD-MA e luce. A 10 ore di postinfezione, le caspasi sono state processate e i substrati sono stati scissi in cellule infette da virus, e a 2 ore di trattamento post-light, le caspasi sono state processate e i substrati sono stati scissi in cellule trattate con BPD-MA. Si noti la differenza nelle apparenze morfologiche delle cellule HeLa infette da CVB3 e trattate fotodinamicamente. Le cellule HeLa infette da CVB3 apparivano arrotondate, con superfici cellulari lisce, mentre le cellule HeLa trattate con BPD-MA e luce mostravano ampi blebbing e restringimento della membrana, con eterogeneità cellulare. A concentrazioni più elevate di ZVAD-fmk, i cambiamenti morfologici prodotti da BPD-MA e dal trattamento della luce sono stati inibiti e l’aspetto cellulare era simile a quello delle cellule HeLa di controllo (trattate con BPD-MA più assenza di luce). Nelle cellule HeLa infette da CVB3, i cambiamenti morfologici non sono stati inibiti con l’aumento delle concentrazioni di ZVAD.fmk, suggerendo che le alterazioni morfologiche erano indipendenti dalla lavorazione della caspasi e dalla scissione dei substrati.

Una caratteristica classica dei virus della famiglia Picornaviridae è il CPE cellulare dopo l’infezione. Dalla scoperta di una tecnica di coltura cellulare extraneurale per la moltiplicazione del poliovirus (17), sono stati notati cambiamenti degenerativi nella morfologia cellulare. Descritto per la prima volta da Robbins et al. (48) nel 1950, questi cambiamenti citopatici includono restringimento nucleare, condensazione della cromatina, arrotondamento cellulare e rilascio dal monostrato, con eventuale progressione a citoplasma acidofilo, picnosi nucleare e frammentazione della cromatina nucleare (karyorrhexis) (47).

La recente comprensione dei meccanismi di morte cellulare pone le basi per l’esame delle proteine di morte delle cellule ospiti e il loro possibile ruolo nel CPE dell’infezione da CVB3. Molti virus inibiscono o attivano la morte cellulare, strategie che trasmettono aspetti distintivi della lesione cellulare, risposte infiammatorie o persistenza virale. Come notato sopra, precedenti studi sul picornavirus hanno rivelato le caratteristiche morfologiche della morte cellulare apoptotica, tra cui il restringimento delle cellule, la frammentazione del DNA e la condensazione nucleare (21, 32, 47).

La caspasi 3, una proteasi della cisteina con omologia alla proteina Ced-3 (77) di theCaenorhabditis elegans, è considerata una delle proteine chiave coinvolte nella fase di esecuzione della morte cellulare. L’apoptosi indotta da stimoli multipli, tra cui Fas, TNF, etoposide, staurosporina, terapia fotodinamica, radiazioni ionizzanti e ritiro del fattore di crescita, comporta l’elaborazione della pro-caspasi 3 e la successiva attivazione (15, 23, 30, 33, 51). A partire da 7 a 8 ore di postinfezione con CVB3, la pro-caspasi 3 è esaurita e i test di attivazione della caspasi hanno dimostrato che questa proteina è scissa nella sua forma attiva. Diverse proteine possono attivare la caspasi 3, tra cui la caspasi 8 (tramite segnalazione attraverso i recettori TNF o Fas) (55), il granzyme B dai linfociti citotossici (62) e la caspasi 9 (tramite rilascio del citocromo c mitocondriale e assemblaggio dei fattori di attivazione della proteasi apoptotica) (36). Una volta attivato, caspase 3 può degradare substrati specifici, che a sua volta si traduce in alterazioni strutturali e perdita di regolazione omeostatica dei processi cellulari. Numerose proteine hanno dimostrato di essere scisse da caspasi attivate. Coerentemente con l’attivazione della caspasi 3, sia PARP che DFF vengono scissi in seguito all’infezione da CVB3. L’attivazione della caspasi e la frammentazione del DNA sono direttamente collegate attraverso la scissione di DFF (37). DFF è un fattore citosolico umano costituito da due subunità di 45 e 40 kDa, la più grande delle quali è degradata in polipeptidi più piccoli dalla caspasi 3. In recenti studi di Enari et al. (16) utilizzando cellule di linfoma murino, è stata isolata un’endonucleasi, dnasi attivata dalla caspasi (CAD). L’equivalente murino della proteina DFF è stato isolato e definito inibitore del CAD (50). La scissione della caspasi 3 dell’inibitore del CAD (DFF) consente la traslocazione nucleare CAD e la degradazione del DNA. DFF viene scisso a partire da 9 h postinfezione, risultando in un frammento di 30-kDa (Fig. 3) che può essere ulteriormente elaborato in un frammento 11-kDa (37). PARP si trova nel nucleo ed è coinvolto nella riparazione del DNA. La scissione di PARP inizia a 9 h dopo l’infezione, suggerendo che una volta attivate le caspasi nel citosol, sono in grado di accedere ai substrati localizzati nel nucleo.

Da notare l’inibizione della caspasi con l’inibitore generale della caspasi ZVAD.fmk non ha impedito la CPE indotta da CVB3 dopo l’infezione. Tra le 6 e le 7 ore di postinfezione, il CPE è diventato evidente mediante microscopia a contrasto nel nostro modello di infezione CVB3. Il tempo tra l’infezione e la comparsa del CPE, come osservato mediante microscopia a contrasto, è stato coerente a ZVAD.concentrazioni di fmk da 50 a 200 µM. Oltre a non influenzare il tempo di CPE, ZVAD.il trattamento con fmk ha portato a cellule con un aspetto morfologico simile a quello delle cellule infette non trattate (Fig. 5). Abbiamo usato il trattamento con BPD-MA e light come metodo alternativo per indurre l’apoptosi nelle cellule HeLa (22, 23). Inibizione dell’attivazione della caspasi con l’inibitore ZVAD.fmk ha impedito il fenotipo apoptotico (Fig. 5). Da questi risultati, concludiamo che l’attività della caspasi e la scissione dei substrati non tengono conto del CPE caratteristico associato all’infezione da picornavirus, ma sono invece attivati in seguito ai cambiamenti morfologici.

Resta da determinare il punto di intersezione del ciclo replicativo virale e l’attivazione della via di morte della cellula ospite. L’infezione da Picornavirus provoca presto l’inibizione dell’RNA cellulare e della sintesi proteica (19, 74). I primi studi sulle relazioni tra alterazioni metaboliche indotte dal picornavirus e CPE indotta dal virus hanno indicato che l’inibizione della sintesi di proteine e RNA non era direttamente correlata ai cambiamenti morfologici delle cellule (4). Gli inibitori della sintesi di proteine e RNA hanno ritardato la morte cellulare, ma le cellule hanno mostrato meno cambiamenti morfologici rispetto alle cellule infette da picornavirus (5). L’inibizione della sintesi di proteine e RNA con uno qualsiasi degli agenti multipli, come l’actinomicina D, la puromicina e la tossina difterica, provoca l’apoptosi (39). I primi studi condotti nei sistemi di infezione da poliovirus hanno dimostrato che la puromicina, un inibitore della traduzione delle proteine virali e dell’ospite, ritarda l’insorgenza di alterazioni citopatiche, suggerendo che alcune proteine virali possono essere direttamente citotossiche (4). L’aumento del MOI porta ad una più rapida insorgenza di CPE (osservazioni inedite), sebbene quasi tutta la traduzione delle proteine ospiti sia interrotta entro 3 h a un MOI relativamente basso (25) come quello utilizzato in questo studio (MOI = 5). Recentemente è stato dimostrato che la proteina 2B codificata da coxsackievirus e poliovirus si associa a frazioni di membrana cellulare, incluso il plasmalemma e il reticolo endoplasmatico, e interrompe il movimento degli ioni, incluso il movimento di Ca2+ al citosol (1, 67). L’afflusso di Ca2 + si verifica nell’apoptosi (7, 44), ma non è chiaro se l’afflusso si verifica prima o dopo l’attivazione della caspasi. Esaminando i requisiti ionici delle caspasi, è stato determinato che la concentrazione di ioni calcio ha scarso effetto sull’attività delle caspasi (56). Un afflusso precoce di calcio in seguito all’infezione da coxsackievirus potrebbe derivare dall’influenza della proteina 2B sulla permeabilità della membrana, e il grande afflusso tardivo di calcio osservato (>6 h postinfezione) (67) potrebbe essere un effetto a valle dell’attivazione della caspasi.

Durante le prime fasi dell’infezione, sarebbe vantaggioso per il virus inibire la morte delle cellule ospiti, consentendo così la massima produzione di progenie virale. Nelle ultime fasi del ciclo di vita virale, sarebbe anche utile per il virus indurre l’apoptosi piuttosto che la necrosi. Tale meccanismo di morte è un potenziale mezzo di evasione del sistema immunitario ospite da parte del virus durante il suo rilascio al tessuto circostante. L’apoptosi è caratterizzata dalla rapida fagocitosi delle cellule colpite senza il rilascio di citochine proinfiammatorie (53).

I virus hanno dimostrato di interagire a vari livelli della via apoptotica. Diversi gammaherpesvirus (incluso l’herpesvirus umano associato al sarcoma di Kaposi 8) e il virus tumorigenic molluscum contagiosum contengono proteine inibitorie del FLICE che interagiscono con la proteina adattatore Fas FADD e competono per inibire il reclutamento della caspasi 8 e la successiva attivazione (61). L’espressione del virus del vaiolo bovino serpin CRMA blocca l’attivazione mediata dalla caspasi 8 delle caspasi a valle come la caspasi 1 e la caspasi 3 (55). Le proteine IAP (per inibitori dell’apoptosi) costituiscono una famiglia di proteine, espresse dai baculovirus, che bloccano l’apoptosi indotta dall’infezione virale o dalla caspasi 1 (78). Inoltre, sono stati scoperti diversi omologhi virali della famiglia di proteine Bcl-2(2, 8, 20, 70). L’adenovirus (9, 20, 57), il virus della peste suina africana (41) e il virus Epstein-Barr (26, 41, 59) codificano proteine (E1B-19K, LMWS-HL e BHRF1, rispettivamente) che presentano omologia di sequenza ai geni pro-sopravvivenza della famiglia Bcl-2.

L’identificazione delle proteine virali che inducono direttamente l’apoptosi non è così ampiamente documentata come quella delle proteine virali che inibiscono la morte cellulare. Il lentivirus virus dell’immunodeficienza umana e il virus della leucemia a cellule T umane di tipo 1 codificano i regolatori di trascrizione Tat e Tax, che hanno dimostrato di aumentare l’espressione del ligando Fas diminuendo l’espressione dei membri della famiglia Bcl-2 (79, 80). I prodotti del gene umano codificato da adenovirus E1A, E3 ed E4 causano la morte cellulare dopo l’espressione nella coltura cellulare. I geni che inducono la morte dell’adenovirus sono espressi in ritardo nel ciclo di infezione e alla fine sopraffanno i geni che inibiscono la morte codificati dal virus (38).

I nostri dati dimostrano che l’attivazione della caspasi 3 segue, piuttosto che precede, i cambiamenti morfologici degenerativi indotti da CVB3 nelle cellule HeLa infette. Le caspasi attivate processano substrati specifici, inclusi PARP e DFF. Tuttavia, l’inibizione dell’attività della caspasi non elimina l’aspetto morfologico (CPE) delle cellule infette da virus, come determinato dalla microscopia a contrasto. Il trattamento delle caspasi e la scissione dei substrati possono essere importanti nell’alterazione finale dei normali processi omeostatici nelle cellule infette e possono facilitare la clearance finale delle cellule infette da virus. Le proteasi virali 2A, 3C e 3CD possono fendere specifiche proteine strutturali, con conseguente alterazioni morfologiche coerenti con CPE, in modo analogo all’azione delle caspasi, che fendono substrati separati per ottenere un fenotipo apoptotico distinto.

RINGRAZIAMENTI

Apprezziamo profondamente il supporto tecnico di Lubos Bohunek. Ringraziamo Xiaodong Wang (University of Texas Southwestern Medical School, Dallas) per il generoso dono dell’anticorpo DFF.

Questi studi sono stati supportati da Heart and Stroke Foundation of British Columbia e Yukon (B. M. M., C. M. C., D. J. G. e K. A. W.), il Medical Research Council del Canada (D. Y. e B. M. M.), e la B. C. Health Research Foundation (D. Y.)

NOTE

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