Risultati

In primo luogo abbiamo valutato se CD63 e la H,K-ATPasi risiedono nello stesso compartimento subcellulare nelle cellule parietali gastriche. Lavori precedenti hanno dimostrato che le cellule parietali di ratto esprimono alti livelli di CD63 (22). La microscopia a immunofluorescenza su sezioni congelate dello stomaco di ratto indica che il CD63 è presente nella maggior parte delle cellule dello stomaco di ratto, comprese le cellule parietali (Fig. 1 BIS). CD63 parzialmente colocalizza con l’HKa nelle cellule parietali. Inoltre, abbiamo analizzato una preparazione TVE altamente purificata da hog stomach (un gentile regalo di CT Okamoto). H, K-ATPasi contribuisce ≈50% del contenuto proteico in preparazioni simili (23). L’analisi Western blot indica che CD63 è abbondantemente presente in questa preparazione purificata di TVEs (Fig. 1 TER).

Per studiare una possibile interazione in situ tra CD63 e l’H,K-ATPasi, abbiamo eseguito esperimenti pull-down utilizzando lectina di pomodoro biotinilata. Studi precedenti hanno dimostrato che questa lectina si lega in modo specifico e univoco all’HKß nelle preparazioni gastriche (24-27). Abbiamo cancellato una preparazione TVE con anti-HKß mAb e lectina di pomodoro biotinilata per confermare che la lectina si associa specificamente con l’HKß glicosilato (Fig. 1C). Abbiamo quindi utilizzato la lectina di pomodoro biotinilata per isolare le proteine che interagiscono con l’HKß nella preparazione TVE. L’analisi Western blot indica che CD63 è precipitato dalla lectina di pomodoro (Fig. 1D), dimostrando che CD63 e l’H, K-ATPasi si associano in situ e suggerendo che questa associazione potrebbe essere fisiologicamente rilevante. Il pretrattamento del preparato TVE con SDS al 4%, seguito da una diluizione di 20 volte in tampone di lisi, ha ridotto significativamente la quantità di CD63 che è stata precipitata. La quantità di HKß che è stata precipitata non è stata alterata da questo trattamento (dati non mostrati). Questi dati suggeriscono che la presenza di CD63 nel pull-down è attribuibile alla sua associazione con HKß e non a un’associazione diretta tra CD63 e lectina di pomodoro.

Per indagare ulteriormente il significato funzionale dell’interazione tra CD63 e HKß, abbiamo trasfettato le cellule COS-7 con un coniglio codificante cDNA HKß singolarmente o insieme a un cDNA che codifica un costrutto CD63 contrassegnato con FLAG (CD63-FL). Abbiamo dimostrato che l’HKß non ha bisogno di assemblarsi con l’HKa per raggiungere la superficie cellulare nelle cellule COS transfettate (20). Abbiamo usato un costrutto CD63 che porta un tag epitopo di BANDIERA sul suo terminale N perché il terminale C di CD63 contiene un motivo a base di tirosina che è richiesto per il traffico intracellulare di questa tetraspanina (13).

Le cellule COS cotrasfettate con HKß e CD63-FL sono state sottoposte ad immunoprecipitazione utilizzando un pAb anti-FLAG. L’analisi Western blot del materiale immunoprecipitato indica che l’HKß coprecipita con CD63 (Fig. 2, HKß + CD63-FL). Le proteine CD63-FL e HKß coimmunoprecipitano in una varietà di detergenti, tra cui 2% CHAPS, 1% Brij 96 e 1% Triton X-100. L’associazione tra CD63 e HKß costituisce uno dei pochi complessi tetraspanici descritti che sopravvive alla solubilizzazione in Triton X-100 ed è quindi probabile che rappresenti un’interazione diretta (28). La subunità β ha due forme: ßm (maturo), che viene modificato con carboidrati complessi, e ßc (core), che viene modificato con carboidrati ad alto contenuto di mannosio (29). Entrambe le forme coprecipitano con CD63, anche se il rapporto tra ßc e ßm nel precipitato varia in funzione delle condizioni di solubilizzazione.

L’HKß non è stato rilevato nelle immunoprecipitazioni FLAG eseguite su cellule trasfettate con il solo HKß, dimostrando che il FLAG pAb non interagisce con la subunità β (Fig. 2, HKß). L’HKß non coimmunoprecipita con FLAG pAb da una miscela (50: 50, vol / vol) di lisati preparati da cellule trasfettate singolarmente con CD63-FL e la subunità β, confermando che l’interazione avviene in vivo (Fig. 2, seconda corsia). I campioni incubati con FLAG pAb non precipitano la proteina lisosomiale Lamp-1, indicando che l’interazione tra CD63-FL e HKß è specifica e non un artefatto di solubilizzazione incompleta del compartimento CD63 (Fig. 2).

Abbiamo quindi esaminato se l’interazione tra HKß e CD63 influisce sulla localizzazione subcellulare della subunità β. L’HKß è presente sulla superficie cellulare in cellule COS transitoriamente trasfette (Fig. 3 A-C). C’è una ridistribuzione pronunciata della subunità β in vescicole intracellulari contenenti CD63 quando le cellule COS sono cotrasfettate sia con HKß che con CD63-FL (Fig. 3 D-F). Per escludere la possibilità che questa localizzazione alterata possa essere un effetto non specifico della sovraespressione CD63, abbiamo studiato l’effetto dell’espressione CD63 sulla distribuzione di AQP4. AQP4 è un canale d’acqua presente nelle membrane plasmatiche basolaterali delle cellule parietali. Non subisce endocitosi ed esocitosi regolate con H,K-ATPasi (30, 31). Questo canale non coimmunoprecipita con CD63-FL in un Tritone X-100 lisato di cellule COS cotransfected (Fig. 4 BIS). Quando le cellule cotrasfettate vengono visualizzate mediante microscopia confocale a immunofluorescenza, AQP4 non è presente nel compartimento contenente CD63 (Fig. 4B), indicando che la ridistribuzione indotta da CD63 alle vescicole intracellulari è specifica per le proteine che interagiscono con questa tetraspanina.

Per indagare i meccanismi della ridistribuzione mediata da CD63 dell’HKß, abbiamo approfittato del recente lavoro che ha caratterizzato il traffico intracellulare di CD63. Rous et al. (13) ha dimostrato che il motivo a base di tirosina presente all’estremità C estrema di CD63 interagisce con le subunità μ2 e μ3 dell’adattatore. La proteina μ2 è un membro del complesso AP-2 eterotetramerico. Questo complesso è presente sulla membrana plasmatica e collega le proteine del carico con il mantello di clatrina, mediando la loro endocitosi (14). La proteina μ3 è un membro del complesso AP-3 eterotetramerico. Questo complesso partecipa al targeting lisosomiale e si trova sia nella rete trans-Golgi che in un compartimento vescicolare che parzialmente colocalizza con gli endosomi (12). Quando il motivo a base di tirosina YEVM di CD63 viene mutato in AEVM, CD63 non è in grado di interagire con μ2 o μ3 ed è espresso principalmente sulla superficie cellulare (13). Quando l’HKß è coespresso con il costrutto CD63-AEVM contrassegnato con FLAG, sia CD63-AEVM che la subunità β sono distribuiti sulla superficie cellulare (Fig. 3 G-I). Pertanto, la distribuzione intracellulare dell’HKß è influenzata dai segnali di traffico incorporati all’interno della coda citoplasmatica CD63.

Quando la sequenza YEVM nella coda di CD63 viene mutata in YEVI, il motivo modificato continua a interagire con μ3 ma non si associa più a μ2 (13). CD63-YEVI è localizzato principalmente nel compartimento endosomiale–lisosomiale tardivo, molto probabilmente perché la proteina tetraspanina alterata si sposta direttamente in questo compartimento dopo il suo passaggio biosintetico iniziale attraverso il Golgi (13). La piccola popolazione di CD63-YEVI che raggiunge la membrana plasmatica presenta una ridotta internalizzazione perché non può più interagire con μ2 (13). Quando l’HKß e un costrutto CD63-YEVI contrassegnato con BANDIERA sono coespressi nelle cellule COS, gran parte del CD63-YEVI è localizzato nel compartimento endosomiale–lisosomiale tardivo; tuttavia, la subunità β rimane sulla superficie cellulare e non viene ridistribuita in un compartimento intracellulare (Fig. 3 J-L). L’analisi di coimmunoprecipitazione conferma che l’HKß può associarsi sia a CD63-YEVI che a CD63-AEVM (dati non mostrati). Questi dati suggeriscono che per distribuire l’HKß in un compartimento intracellulare CD63-positivo, queste proteine devono interagire sulla superficie cellulare ed essere endocytosed come un complesso.

Per determinare se l’HKß rilevato nelle vescicole intracellulari corrisponde alla proteina che è stata endocytosed dalla superficie della cellula, abbiamo osservato l’internalizzazione della subunità β in presenza e assenza di espressione esogena CD63. Le cellule COS sono state cotrasfettate con HKß e CD63-FL. Le cellule sono state quindi raffreddate a 4°C per fermare l’endocitosi e la superficie etichettata con HKß mAb. Le cellule marcate sono state incubate a 37 ° C per 40 min per consentire la ripresa dell’endocitosi. Dopo l’incubazione, le cellule sono state raffreddate a 4°C e la superficie etichettata con IgG anti-topo di capra coniugato Cy5. Le cellule sono state fissate e incubate con pAb anti-FLAG e sono state quindi etichettate con IgG anti-topo di capra coniugato con isotiocianato di fluoresceina e IgG anti-coniglio di capra coniugato con rodamina. Pertanto, l’HKß rimasto sulla superficie è stato visualizzato sul canale Cy5, l’HKß interiorizzato è stato visualizzato sul canale isotiocianato di fluoresceina e CD63-FL è stato visualizzato sul canale rodamina. Questa analisi ha dimostrato che la subunità β interiorizzata colocalizza con CD63, suggerendo che il pool di HKß che è colocalizzato con CD63 è derivato attraverso l’endocitosi dalla membrana cellulare (Fig. 5 E-H). Le cellule che non sovraesprimono CD63 presentano una subunità β molto meno interiorizzata dopo un’incubazione di 40 minuti (Fig. 5 D. C.).

Per quantificare l’internalizzazione dell’HKß e verificare ulteriormente che l’HKß e il CD63 si associno alla superficie della cellula, abbiamo eseguito esperimenti di biotinilazione cellulare-superficie. Nel primo esperimento, le cellule COS sono state trasfettate con la sola subunità β e biotinilate con estere biotina-SS-N-idrossisuccinimmide a 4°C. I campioni duplicati sono stati quindi incubati a 37°C per vari periodi di tempo per consentire la ripresa dell’endocitosi. Le cellule sono state restituite a 4°C e una piastra da ogni punto temporale è stata spogliata della biotina rimanente della superficie cellulare mediante esposizione all’agente riducente impermeabile alla membrana MesNa. Le cellule sono state lisate e incubate con perline di streptavidina. Le proteine associate alle perle di streptavidina sono state separate da SDS / PAGE e le membrane sono state sondate con HKß mAb (Fig. 6 BIS). La frazione di β-subunità sulla superficie cellulare non cambia sensibilmente come procede l’internalizzazione 37°C. Dopo i primi 10 minuti, una piccola frazione dell’HKß etichettato in superficie viene sequestrata all’interno della cella e il rapporto tra superficie e HKß interiorizzato rimane elevato. Questi dati suggeriscono che la subunità β non associata a CD63 interiorizza molto lentamente o viene interiorizzata ma riciclata rapidamente in superficie, proprio come il recettore della transferrina.

Abbiamo quindi cercato di caratterizzare il comportamento dell’HKß che si associa a CD63. Le cellule COS sono state cotrasfettate con HKß e CD63-FL. Le cellule sono state biotinilate e spogliate come descritto sopra. Per isolare la popolazione di HKß associata a CD63, il lisato cellulare è stato incubato con FLAG pAb e perline di agarosio coniugato con la proteina A. Il materiale immunoprecipitato è stato eluito con una piccola quantità di tampone contenente 3% SDS, diluito 30 volte con 1% Triton X-100 e incubato con perline di streptavidina. Le proteine associate alle perle di streptavidina sono state separate da SDS / PAGE e sondate con HKß mAb (Fig. 6 TER). Per le cellule che non sono state sottoposte a un protocollo di stripping, il segnale rilevato in questo Western blot rappresenta il pool totale di subunità β con etichetta superficiale associata a CD63, inclusi complessi che erano ancora nella membrana plasmatica e complessi che erano stati interiorizzati in vescicole. Per le cellule che sono state sottoposte a un protocollo di stripping, il segnale rappresenta la popolazione di subunità β associata a CD63 che era presente sulla superficie cellulare durante la biotinilazione ed è stata successivamente interiorizzata e protetta dalla striscia MesNa.

Al punto di tempo 0-min, l’HKß biotinilato è prontamente rilevato in immunoprecipitati anti-FLAG da cellule non schiacciate, dimostrando che l’HKß e il CD63 sono in grado di associarsi alla superficie cellulare. Tutto l’HKß biotinilato recuperato al punto di tempo 0-min è sensibile alla striscia MesNa. La quantità di subunità β biotinilata associata a CD63 protetta dal reagente MesNa aumenta man mano che le cellule possono incubare a 37°C. Infatti, la quantità di HKß presente sulla superficie e associata a CD63 a 0 min è approssimativamente uguale alla quantità di HKß associata a CD63 e protetta dallo stripping a 45 min. Questi risultati suggeriscono che la subunità β associata a CD63 è interiorizzata e non ritorna alla superficie cellulare.