CRBN è degradato in modo efficiente da PROTAC eterodimerizzazione VHL-CRBN. A) Diagramma schematico del PROTAC contenente pomalidomide e il ligando VHL (VH032). (B) Struttura di TD-158, TD-165, TD-343 e TD-487. (C) Le cellule HEK293T sono state trattate con TD-158, TD-165, TD-343 o TD-487 (0,1, 1 e 10 µM) per 24 ore e i livelli di proteine VHL sono stati analizzati mediante immunoblotting. L. E. indica una lunga esposizione del Western blot. D) Grafico DC50 dei composti TD-158 e TD-165 (TD – 165, DC50 = 20,4 nM; TD-158, DC50 = 44,5 nM). E) HA-CRBN e Flag-VHL sono stati espressi in celle HEK293T. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con TD-158 (500 nM) per 24 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (F) Le cellule HEK293T sono state trattate con 500 nM TD-158 in diversi punti temporali e i livelli di CRBN sono stati analizzati mediante immunoblotting. L. E. indica una lunga esposizione del Western blot.

Dopo il trattamento con questi composti, abbiamo esaminato i livelli di VHL e CRBN mediante analisi Western blot. Il trattamento con TD-158, TD-165 o TD-343 ha causato una diminuzione dipendente dalla concentrazione del livello delle proteine CRBN (Fig. 1C, pannello superiore). I livelli di VHL long form e VHL short form, tuttavia, sono aumentati, presumibilmente a causa della stabilizzazione da parte dell’interazione chimico-proteica (Fig. 1C, superiore-medio e inferiore-medio pannelli)34. Nel caso di trattamento con 10 µM TD-158,i livelli di CRBN sono stati ripristinati; questo effetto “gancio” è una caratteristica tipica che si verifica nel contesto della degradazione proteica indotta da PROTAC ad alte dosi9,35,36, 37. Tuttavia, TD-487, uno stereoisomero di TD-165, non è riuscito a indurre la degradazione CRBN (Fig. 1C). TD-343 possedeva un’attività relativamente debole, il che implica che l’incorporazione di ossigeno nel linker inibisce l’attività PROTAC. Un’analisi quantitativa reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) ha indicato che la diminuzione del livello di CRBN indotta da PROTACS eterodimerizzanti VHL-CRBN non è il risultato di cambiamenti nell’mRNA (Fig. S1B). I valori della concentrazione di degradazione del 50% (DC50) e della degradazione massima (Dmax) sono stati misurati per tutti i composti sintetizzati. I valori calcolati DC50 e Dmax per TD-158 erano 44,5 nM e 97.1%, rispettivamente, ei valori corrispondenti per TD-165 erano 20,4 nM e 99,6% (Fig. 1D e supplementari Fig. S1D). Il più breve degradatore contenente linker TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) ha mostrato un’attività più debole rispetto al TD-165 (Fig. S1C). TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), con ossigeno incorporato nel linker, ha portato alla degradazione inefficiente di CRBN. Per testare l’effetto del legame con la talidomide, abbiamo esaminato la degradazione di CRBN mediante PROTAC eterodimerizzazione VHL-CRBN con un legame diverso. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), con un legame glicolico, e TD-033 (DC50 = 2546,1 nM), con un legame ammidico, ha mostrato una ridotta degradazione di CRBN, mentre TD-759 (DC50 = 28,8 nM), con un legame di glicina, ha mostrato una potenza simile a quella di TD-165. Per determinare se i livelli relativi della proteina potrebbero contribuire a questa degradazione parziale della proteina, abbiamo trattato le cellule che sovraesprimono VHL, CRBN, o entrambi con TD-158 ed abbiamo analizzato i livelli di CRBN e di VHL. In tutti i casi, i livelli di CRBN sono stati ridotti mentre i livelli di VHL sono rimasti simili o aumentati (Fig. 1E). Negli esperimenti a tempo, il TD-158 ha degradato il CRBN di oltre l ‘ 80% entro 3 ore e lo ha completamente degradato dopo 12 ore (Fig. 1F). La degradazione indotta da TD-158 CRBN è stata osservata anche in varie linee cellulari umane (Fig. S2A-D).

Degradazione di CRBN da VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs dipende da CRL2VHL

Per verificare che la degradazione di CRBN da TD-158 dipendesse da UPS o Cullin-RING ubiquitin ligases (CRL), abbiamo testato bortezomib, un inibitore del proteasoma, e MLN4924, un inibitore della neddilazione. Il co-trattamento con TD-158 e bortezomib o MLN4924 ha impedito la degradazione di CRBN (Fig. 2A e Fig. S3A). Come previsto, la formazione della catena di poli-ubiquitina è aumentata notevolmente in presenza di TD-158 (Fig. 2 TER). Inoltre, l’abbattimento di VHL da parte di piccoli RNA interferenti (siRNA) ha attenuato la degradazione di CRBN indotta da TD-158 nelle cellule HEK293T (Fig. 2 QUATER). Al contrario, l’espressione di VHL nelle cellule 786-O, una linea cellulare di carcinoma renale carente di VHL, ha ripristinato la degradazione di CRBN indotta da TD-158 (Fig. 2D). In linea con questi risultati, l’abbattimento mediato da siRNA di Cullin2, una proteina di scaffolding del complesso CRL2VHL, ha impedito la degradazione di CRBN indotta da TD-158 (Fig. 2E). Collettivamente, questi risultati indicano che la degradazione CRBN da PROTAC eterodimerizzazione VHL-CRBN dipende dal complesso CRL2VHL.

La degradazione di CRBN mediante PROTAC eterodimerizzazione di VHL-CRBN dipende da CRL2VHL. (A) Le cellule HEK293T sono state trattate con TD-165 (1 µM) per 12 h, seguita dall’aggiunta di bortezomib (20 nM) o DMSO per 8 h. I lisati a cellule intere sono stati sottoposti ad analisi immunoblot per le proteine indicate. (B) CRBN contrassegnato con FLAG (CRBN-Flag) e Ubiquitina contrassegnata con HA (HA-Ub) sono state espresse in cellule HEK293T. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con TD-158 (500 nM) e bortezomib (20 nM), o DMSO e bortezomib (20 nM), per 12 h. I lisati e le proteine a cellule intere immunoprecipitati utilizzando le perle magnetiche Flag M2 sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (C) Le cellule HEK293T sono state trasfettate con siRNA specifico per VHL o scrambled (controllo) siRNA. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con TD-158 (500 nM) per 24 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (D) le cellule 786-O e le cellule 786-O che esprimono VHL (786-O + VHL) sono state trattate con TD-158 (500 nM) per 24 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (E) Le cellule HEK293T e CUL2 – knockdowned HEK293T sono state trattate con TD-165 (1 µM) o TD-487 (1 µM) per 24 ore e i lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting. (F) CRBN-Flag è stato espresso in celle HEK293T. Dopo 36 h, le cellule sono state trattate con TD-158 (1 µM) e bortezomib (20 nM), o DMSO e bortezomib (20 nM), per 12 h. I lisati e le proteine a cellule intere immunoprecipitati utilizzando le perle magnetiche Flag M2 sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. G) Le proteine del complesso CRBN e VHL/ELOB/ELOC purificate sono state mescolate e aliquote in quattro provette. TD-158 e perle di glutatione sono stati aggiunti come indicato e incubato per 3 h. Dopo l’incubazione, perle di glutatione sono stati lavati e analizzati da immunoblotting e Coomassie colorazione blu.

La degradazione efficiente da parte di PROTACs richiede la formazione di un complesso ternario con la proteina target e la E3 ligase9,38. Per testare questo, abbiamo eseguito esperimenti di co-immunoprecipitazione. Abbiamo scoperto che esogenamente espresso Flag-tagged CRBN co-immunoprecipitato endogeno VHL in presenza di TD-158, ma non in sua assenza (Fig. 2 SEPTIES). Gli esperimenti di pull-down GST che utilizzano proteine purificate hanno mostrato che CRBN interagiva direttamente con il complesso VHL-Elongin B/C in presenza di TD-158 (Fig. 2G). Inoltre, l’aggiunta di pomalidomide in eccesso o ligando VHL inibito TD-158-indotta CRBN degradazione (Fig supplementare. S3B, C). Exogenously espresso CRBN Y384 / W386A (AA), un pomalidomide-binding–difettoso mutant16, non è stato degradato da TD-158 (supplementare Fig. S3D). Pertanto, questi dati suggeriscono che la formazione di un complesso ternario tra CRBN, VHL e TD-158 è un prerequisito per la degradazione di CRBN.

Un’analisi proteomica globale rivela che TD-158 induce la degradazione di CRBN

Per esaminare la degradazione di CRBN in modo imparziale, abbiamo eseguito un’analisi proteomica quantitativa. Per ridurre al minimo gli effetti secondari della degradazione di CRBN, abbiamo trattato le cellule di Jurkat, che esprimevano substrati CRBN e IMID neo, con TD-158 o DMSO (controllo del veicolo) per 12 h. Le proteine di ciascun campione sono state digerite e i peptidi digeriti sono stati etichettati per l’etichettatura isobarica accoppiata alla cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem. Questa analisi ha identificato 7.148 proteine contenenti più di tre peptidi unici non ridondanti (Tabella supplementare S1). Solo tre proteine-CRBN, CNIH1 e LMBRD2-hanno soddisfatto i criteri di un valore P = 0,05 e più di un cambiamento di 1,5 volte. Tra questi, CRBN era l’unica proteina che è cambiata di oltre 2 volte (Fig. 3 BIS). Tuttavia, i livelli di altri componenti dei complessi CRL4CRBN (CUL4A, CUL4B, DDB1 e RBX1) e dei complessi CRL2VHL (elongin C , elongin B, CUL2 e RBX1) sono rimasti invariati (Fig. 3 TER, lettera C). È interessante notare che i livelli di neo-substrati di IMIDI precedentemente riportati, inclusi IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 e ZNF653, non sono stati modificati dopo il trattamento con TD-158 (Fig. 3B) 39,40,41. Questi risultati sono stati confermati da immunoblotting in Jurkat e varie linee cellulari di mieloma multiplo (Fig. 3D e supplementari Fig. S2A-D).

Cambiamenti proteomici globali al trattamento con TD-158. (A) Trama vulcano di proteine identificate da analisi proteomiche quantitative, confrontando lisati da cellule Jurkat trattati per 12 h con 1 µM TD-158 o DMSO. I dati rappresentano tre repliche biologiche. L’asse x rappresenta il cambiamento di piega nei livelli di proteine nella scala logaritmica e l’asse y rappresenta il valore P nella scala logaritmica. (B) Abbondanza relativa del complesso CRL4CRBN, del complesso CRL2VHL e del neo-substrato di CRBN (*P < 0.05, **P < 0.1). La linea rossa indica una differenza di 1,5 volte. (C) Le cellule di Jurkat sono state trattate con TD-158 (1 µM) o DMSO per 24 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine complesse CRL4CRBN. (D) Le cellule di Jurkat sono state trattate con o senza DMSO, TD-158 (1 µM), pomalidomide (1 µM) o ligando VHL (1 µM) per 24 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate.

CRBN degradazione da VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs ricapitola una carenza di CRBN

Un substrato endogeno di CRL4CRBN è la glutammina sintetasi GLUL, che è un enzima chiave nella biogenesi della glutammina. L’acetiltransferasi CBP / p300 acetila due residui di lisina N-terminale del LEGNO lamellare in condizioni di alti livelli di glutammina e il legno LAMELLARE acetilato risultante viene catturato e ubiquitinato da CRL4CRBN e successivamente rimosso dai proteasomi22. Per esaminare l’effetto di TD-158 sui livelli di LEGNO LAMELLARE, abbiamo affamato le cellule Hep3B di glutammina per 48 h e poi rifornito glutammina in presenza o assenza di TD-158. TD-158 ha indotto la degradazione del CRBN indipendentemente dallo stato della glutammina e i livelli di LEGNO LAMELLARE sono diminuiti più lentamente nel tempo in presenza di TD-158 che in sua assenza (Fig. 4 BIS, lettera B). Inoltre, i test di ubiquitinazione in vivo hanno mostrato che l’ubiquitinazione del legno LAMELLARE diminuiva in presenza di TD-158 (Fig. 4 QUATER). Abbiamo anche studiato se il trattamento TD-165 conferisce resistenza cellulare all’IMiD. Due linee cellulari sensibili all’IMiD, WSU-DLCL2 e RPMI8226, sono state pretrattate con TD-165 o DMSO per 24 h e quindi trattate con pomalidomide, TD-165 o entrambe per 3 d. Il pretrattamento con TD-165 ha ridotto gli effetti anti-proliferativi di pomalidomide in entrambe le linee cellulari (Fig. 4D, E). Presi insieme, questi dati indicano che la degradazione di CRBN mediante PROTAC eterodimerizzazione VHL-CRBN riassume una carenza di CRBN.

CRBN degradation by VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs ricapitola una carenza di CRBN. (A) Le cellule Hep3B sono state affamate di glutammina e trattate con TD-158 (500 nM) per 48 h. Le cellule sono state quindi trattate con glutammina (4 mM) in diversi punti temporali. La degradazione del legno lamellare è stata analizzata mediante immunoblotting. B) Risultati quantitativi di tre esperimenti indipendenti. (C) GLUL-Myc e V5-Ub sono stati espressi in celle HEK293T. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con TD-158 (500 nM) o DMSO per 12 h e quindi trattate con bortezomib (100 nM) o DMSO per 12 h. I lisati e le proteine a cellule intere immunoprecipitati utilizzando le perle magnetiche Myc sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (D,E) Le cellule WSU-DLCL2 (D) e RPMI8226 (E) sono state pretrattate con TD-165 (1 µM) o DMSO per 24 h e, dopo la raccolta, sono state divise in quattro gruppi. Ogni gruppo è stato quindi trattato con pomalidomide (1 µM) e DMSO, o pomalidomide (1 µM) e TD-165 (1 µM), per 3 d. La vitalità cellulare è stata misurata utilizzando CellTiter-Glo (**P < 0.001, *P < 0.01).

Per studiare gli effetti in vivo dei PROTAC eterodimerizzanti VHL-CRBN, abbiamo tentato di determinare se TD-165 può indurre la degradazione di CRBN in modelli animali. Sebbene i residui aminoacidici nel CRBN di topo (mCRBN) importanti per la teratogenicità non siano conservati, mCRBN è stato nettamente degradato, anche se in misura leggermente minore, da TD-165 nei fibroblasti embrionali di topo (Fig. S4A). Abbiamo quindi somministrato TD-165 per via intraperitoneale ai topi per determinare se TD-165 induce la degradazione CRBN in vivo. Tuttavia, i livelli di CRBN non sono stati modificati nella milza, nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o nel fegato (Fig. S4B). Dato che la farmacocinetica di TD-165 è ragionevole (Tabella supplementare S2), questa assenza di un effetto potrebbe essere attribuibile all’elevato legame alle proteine plasmatiche (99,9%) di TD-165 (Tabella supplementare S3).

N-terminally troncato CRBN non è degradato da VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs

Per determinare quale dominio di CRBN è importante per la degradazione CRBN mediata da TD-165, abbiamo generato una serie di mutanti di cancellazione CRBN (D1–D4), come illustrato in Fig. 5A. Le cellule che esprimono CRBN a lunghezza intera o mutanti di delezione individuali sono state trattate con DMSO o TD-165 e i lisati cellulari sono stati esaminati per la degradazione dopo il trattamento TD-165. Sorprendentemente, nessuno dei quattro mutanti di delezione CRBN è stato degradato da TD-165, mentre il CRBN a lunghezza intera è stato degradato in modo efficiente (Fig. 5 TER). In particolare, i livelli di VHL erano leggermente elevati presumibilmente a causa della stabilizzazione dell’interazione chimico-proteica in presenza di TD-165, ma non alterati dall’espressione di mutanti CRBN troncati in presenza di TD-165 (Fig. 5 TER). Una possibile spiegazione per questo sarebbe l’incapacità dei mutanti di delezione di formare un complesso ternario. Tuttavia, il mutante D1 ha formato un complesso ternario con TD-165 e VHL (Fig. 5C), e l’ubiquitinazione di D1 aumentata in presenza di TD-165 (Fig. 5D). Abbiamo quindi ipotizzato che i residui di lisina amino-terminale di CRBN siano necessari per l’ubiquitinazione. Per testare questa idea, abbiamo sostituito tutti e tre i residui di lisina all’interno dell’N-terminale di CRBN (a.a. 1-80) con arginina, individualmente e in combinazione, e quindi abbiamo esaminato i lisati cellulari per la degradazione di CRBN. TD-158 degradato in modo efficiente tutti i mutanti nella stessa misura come wild-type CRBN (Fig. 5E), indicando che i tre residui di lisina all’estremità N di CRBN non sono necessari per la degradazione indotta dai PROTAC eterodimerizzanti VHL-CRBN.

La regione disordinata N-terminale di CRBN è necessaria per la degradazione, ma non per l’ubiquitinazione, mediante PROTAC eterodimerizzazione VHL-CRBN. (A) Diagramma schematico che illustra i mutanti di troncamento CRBN. LON, dominio della proteasi Lon; TB, dominio di legame della talidomide. (B) Xpress-tagged full-length CRBN o D1, D2, D3, o D4 mutanti di delezione sono stati espressi in cellule HEK293T. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con TD-165 (3 µM) o DMSO per 24 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (C) Plasmidi codifica Xpress-tagged D1 e His-SBP–tagged VHL sono stati trasfettati in cellule HEK293T. Dopo 48 h, le cellule sono state trattate con TD-165 (1 µM) o DMSO per 24 h. I lisati a cellule intere e le proteine pull-downed usando perline di streptavidina sono stati analizzati immunoblotting per le proteine indicate. (D) Plasmidi codifica Xpress-tagged CRBN, K39R, K42/43 R, o K39/42/43 R mutanti sono stati trasfettati in cellule HEK293T. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con TD-158 (2 µM) o DMSO per 24 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate.

La regione disordinata della proteina mirata è necessaria per un’efficiente degradazione indotta da PROTAC

Abbiamo quindi cercato di determinare le differenze strutturali tra CRBN a lunghezza intera e il mutante di delezione CRBN D1. L’N-terminale di CRBN (a.a. 1-80) è stato previsto per contenere una regione dispiegata o intrinsecamente disordinata, sulla base di un’analisi IUPred2A (Fig. S5A). Questa regione disordinata (a. a. 1-48) era infatti indiscernibile nella struttura cristallina CRL4CRBN a causa della sua flessibilità (ingresso PDB; 6BN7). È stato dimostrato che la regione intrinsecamente disordinata è uno dei componenti principali del degron proteasomale e funge da iniziatore per la proteolisi proteasomale25. In alternativa, nel caso di proteine globulari senza una regione disordinata, il complesso proteico contenente p97/valosina (p97/VCP) può dispiegare la struttura secondaria, facilitando la degradazione proteasomica delle proteine. Per esaminare la relazione tra la degradazione proteica indotta da PROTAC e il complesso p97/VCP, abbiamo testato l’effetto di N2,N4-dibenzilquinazolina-2,4-diammina (DBeQ), un inibitore p97/VCP, sulla degradazione CRBN indotta da TD-165. Questi esperimenti hanno dimostrato che la degradazione CRBN non è stata influenzata dal trattamento DBeQ (Fig. 6 BIS). I livelli di trascrizione inducibile con danno al DNA 3 (DDIT-3; CHOP) e LC-3II lipidati, utilizzati come controlli positivi, sono stati elevati al trattamento con DBeQ. L’abbattimento di p97 da parte del trattamento siRNA o DBeQ ha compromesso le vie ERAD e autofagia, portando all’upregulation di CHOP, un marker UPR ben consolidato e all’accumulo di LC-3II, un marker rappresentativo di autofagia, rispettivamente (Fig. 6 BIS) 42. Pertanto, per indagare se la regione disordinata di CRBN facilita la degradazione proteasomica indotta da PROTAC, abbiamo collegato la regione disordinata (a.a. 1-80) di CRBN ai mutanti D2, D3 e D4 ed esaminato le proteine chimeriche per la degradazione. Tutte le proteine chimeriche, in particolare la chimera D4, sono state degradate da TD-165 in modo dipendente dalla concentrazione (Fig. 6 TER). Tuttavia, l’introduzione di una regione disordinata CRBN all’estremità N o C di VHL non ha indotto la degradazione della proteina di fusione (Fig. 6C), indicando che l’attaccamento della regione disordinata non è sufficiente per tutte le proteine mirate. Per estendere questa idea alla degradazione indotta da altri PROTACs, abbiamo testato ARCC4, un recettore degli androgeni precedentemente riportato (AR) PROTAC43, perché AR ospita anche una regione dispiegata all’N-terminale (a.a. 1-330), come determinato utilizzando lo strumento di analisi IUPred2A (Fig. S5B). Dopo il trattamento con ARCC4, l’AR senza la regione disordinata N-terminale (ΔN330) è stata degradata in modo meno efficiente rispetto all’AR a tutta lunghezza. Curiosamente, l’attaccamento della regione disordinata CRBN (a. a. 1-80) all’AR ΔN330 ha aumentato l’efficienza di degradazione (Fig. 6D e supplementari Fig. S5C). In linea con questo, l’attaccamento della regione disordinata AR (a. a. 1-170) al mutante CRBN D1 ha anche promosso la proteolisi da parte di TD-165 (Fig. 6E e supplementari Fig. S5D).

La regione disordinata della proteina mirata è necessaria per una degradazione efficiente da parte dei PROTAC. (A) Le cellule HEK293T sono state trattate con TD-165 (1 µM), l’inibitore p97/VCP DBeQ (10 µM), o entrambi per 6 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (B) N – terminale CRBN (a.a. 1-80) è stato inserito nel N-o C-terminale di His–SBP-tagged VHL plasmide, e plasmidi sono stati espressi in cellule HEK293T. Dopo 8 h, le cellule sono state raccolte e divise in quattro gruppi. Ogni gruppo è stato quindi trattato con concentrazioni crescenti di TD-165 per 48 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (C) I plasmidi che esprimono l’N-terminale di CRBN (a.a. 1-80) fusi in D2, D3 o D4 sono stati trasfettati in cellule HEK293T. Dopo 8 h, le cellule sono state raccolte e divise in quattro gruppi. Ogni gruppo è stato quindi trattato con concentrazioni crescenti di TD-165 per 48 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (D) I plasmidi che esprimono l’AR a lunghezza intera, l’AR N-terminale eliminato (ΔN330) o l’N-terminale di CRBN (a.a. 1-80) fuso a ΔN330 (CRBN (a.a. 1-80) +ΔN330) sono stati trasfettati in cellule HEK293T. Dopo 8 h, le cellule sono state raccolte e divise in quattro gruppi. Ogni gruppo è stato quindi trattato con concentrazioni crescenti di ARCC4 per 24 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate. (E) Plasmidi che esprimono CRBN a lunghezza intera, mutante di delezione D1 o N-terminale di AR (a.a. 1-170) fuso a D1 (AR (1-170) +D1) sono stati trasfettati in cellule HEK293T. Dopo 8 h, le cellule sono state raccolte e divise in quattro gruppi. Ogni gruppo è stato quindi trattato con concentrazioni crescenti di TD-165 per 48 h. I lisati a cellule intere sono stati analizzati mediante immunoblotting per le proteine indicate.

Per rafforzare ulteriormente questi risultati, abbiamo selezionato PROTACs con elevata potenza (DC50 < 1 µM) sulla base di una ricerca di letteratura, e quindi analizzate per una regione intrinsecamente disordinata utilizzando il IUPred2A strumento. È interessante notare che due terzi delle proteine mirate a PROTAC selezionate sono state trovate in possesso di una regione disordinata di oltre 40 aminoacidi, sia in uno dei loro termini o internamente (Tabella 1)44, sebbene la predizione basata sulla sequenza di aminoacidi di regioni disordinate o non strutturate non prenda in considerazione altri fattori, come l’interazione proteina-proteina o le modifiche post-traduzionali, in considerazione44,45,46. In linea con questo, VHL-Homo-PROTAC ha dimostrato di indurre la degradazione della forma lunga VHL, che ospita una regione disordinata al suo N-terminale, ma non la forma corta VHL47. Pertanto, questo supporta la nostra idea che la regione disordinata delle proteine mirate sia necessaria per una degradazione efficiente da parte dei PROTAC.