Abstract

Sono disponibili varie tecniche per l’isolamento della Candida all’interno della cavità orale. Tali metodi svolgono un ruolo importante nella diagnosi e nella gestione della candidosi orale. La crescente importanza della Candida è in parte correlata alla comparsa dell’infezione da HIV e all’uso più diffuso della chemioterapia immunosoppressiva. Insieme alla Candida albicans c’è stato un maggiore riconoscimento dell’importanza della specie Candida non albicans nella candidosi orale. Identificazione di ceppi infettanti di Candida è importante perché isolati di specie di Candida differiscono ampiamente, sia nella loro capacità di causare infezioni e anche nella loro suscettibilità agli agenti antifungini. Pertanto questa recensione fornisce una panoramica dei metodi affidabili di isolamento candidale e identificazione di isolati dalla cavità orale.

1. Introduzione

Il termine Candida deriva dalla parola latina candid, che significa bianco. Le spore di Candida sono una forma commensale e innocua di un fungo dimorfico che diventa pseudoiphe invasive e patogene quando c’è un disturbo nell’equilibrio della flora o nella debilitazione dell’ospite .

La traduzione di questo endogeno commensale al parassita che causa la malattia può essere associata a fattori diversi dagli attributi patogeni dell’organismo stesso, che è piuttosto unico rispetto alla maggior parte delle altre malattie infettive, dove la virulenza degli organismi considerati è il fattore chiave nella patogenesi. Quindi le specie di Candida sono strettamente opportunistiche. Si potrebbe affermare con che né le forme superficiali né sistemiche di infezioni da Candida potrebbero essere avviate in assenza di patologia sottostante .

Esistono molte specie di Candida (Tabella 1), ma la più diffusa che viene recuperata dal cavo orale, sia allo stato commensale che nei casi di candidosi orale, è C. albicans. Si stima che questa specie rappresenti oltre l ‘ 80% di tutti gli isolati di lievito orale.

Negli ultimi anni c’è stato un maggiore interesse per le infezioni causate dal patogeno opportunistico Candida. La crescente importanza della Candida è in parte correlata alla comparsa dell’infezione da HIV e all’uso più diffuso della chemioterapia immunosoppressiva . Identificazione di ceppi infettanti di Candida è importante perché isolati di specie di Candida differiscono ampiamente, sia nella loro capacità di causare infezioni e anche nella loro suscettibilità agli agenti antifungini .

Insieme al C. albicans c’è stato un maggiore riconoscimento dell’importanza della specie Candida non albicans nella malattia umana. C. glabrata e C. i krusei sono specie che hanno ricevuto attenzione a causa della loro maggiore resistenza a determinati agenti antifungini. C. dubliniensis è una specie patogena recentemente identificata, descritta per la prima volta nel 1995 quando è stata coisolata con C. albicans da casi di candidosi orale in individui infetti da HIV .

Questa recensione fornisce una panoramica dei metodi affidabili di isolamento candidale e identificazione di isolati dalla cavità orale.

2. Attributi patogeni di Candida

La transizione di Candida da un innocuo commensale a un organismo patogeno è complessa ed è correlata a sottili cambiamenti ambientali che portano all’espressione di una serie di fattori di virulenza (Tabella 2). È l’effetto combinato di fattori sia ospiti che candidali che alla fine contribuiscono allo sviluppo della candidosi orale .

Indipendentemente dal tipo di candidosi, la capacità delle specie di Candida di persistere sulle superfici mucose di individui sani è un fattore importante che contribuisce alla sua virulenza. Ciò è particolarmente importante nella cavità orale, dove l’organismo deve resistere all’azione meccanica di lavaggio di un flusso relativamente costante di saliva verso l’esofago .

Nessun singolo fattore di virulenza predominante per Candida è riconosciuto anche se ci sono una serie di fattori che sono stati implicati nel promuovere il processo di infezione. Questi includono attributi coinvolti nell’adesione della Candida alle superfici orali( ad esempio, idrofobicità relativa della superficie cellulare e presenza di specifiche molecole di adesina), la capacità di resistere ai meccanismi di difesa immunitaria dell’ospite (ad esempio, commutazione fenotipica ad alta frequenza e transizione morfologica) e il rilascio di enzimi idrolitici (ad esempio, proteinasi aspartil secrete e fosfolipasi) che possono indurre danni alle cellule ospiti .

3. Candidosi orale

Samaranayake ha proposto una classificazione in cui le lesioni da candidosi orale sono state suddivise in due gruppi principali: Gruppo I, o candidosi orali primarie confinate a lesioni localizzate nella cavità orale senza coinvolgimento della pelle o di altre mucose; Gruppo II o candidosi orali secondarie, in cui le lesioni sono presenti nei siti orali ed extraorali come la pelle (Tabella 3). Le lesioni del gruppo I sono costituite dalla triade classica-varianti pseudomembranose, eritematose e iperplastiche-e alcune hanno suggerito un’ulteriore suddivisione di quest’ultima in tipi simili a placche e nodulari .

4. Diagnosi di candidosi orale

La diagnosi di candidosi orale può spesso essere fatta sulla natura delle caratteristiche cliniche che presentano anche se i campioni microbiologici dovrebbero essere presi, se possibile, al fine di identificare e quantificare qualsiasi Candida che può essere presente e fornire isolati per i test di sensibilità antifungina.

5. Metodi di isolamento

Le tecniche disponibili per l’isolamento della Candida all’interno della cavità orale includono l’uso di uno striscio, un tampone semplice , una coltura di impronta , la raccolta di saliva intera , il risciacquo orale concentrato e la biopsia della mucosa. Ogni metodo presenta particolari vantaggi e svantaggi e la scelta della tecnica di campionamento è principalmente governata dalla natura della lesione da indagare (Tabella 4). Quando una lesione accessibile e definita è evidente, un approccio diretto del campionamento quale l’uso di un tampone o di un’impronta è preferito spesso poichè questo fornirà le informazioni degli organismi presenti alla lesione stessa. Nei casi in cui non ci sono lesioni evidenti o nei casi in cui la lesione è di difficile accesso, è più accettabile un campione indiretto basato sulla coltura di campioni di saliva o un risciacquo orale.

La stima quantitativa del carico fungino può essere effettuata utilizzando impronte, risciacquo orale concentrato e coltura del risciacquo orale, come mezzo per differenziare tra trasporto commensale e esistenza patogena di Candida orale, con carichi più elevati considerati probabili in quest’ultimo .

6. Microscopia diretta

Le caratteristiche morfologiche delle specie di Candida (Tabella 5) devono essere esaminate per l’identificazione. Uno striscio è di valore nella differenziazione tra lievito e forme ifali, ma è meno sensibile rispetto ai metodi culturali . Idrossido di potassio (KOH) La preparazione del campione rivela hy settate non pigmentate con ramificazione dicotomica caratteristica (con un angolo di circa 45°) . In KOH-Calcofluor fluorescent-stain metodo caratteristiche fungine come hy, cellule di lievito, e altri elementi fungini sarà fluorescenza .

Uno striscio prelevato dal sito lesionale viene fissato su vetrini da microscopio e poi macchiato con la macchia di gram o con la tecnica periodica di Schiff acido (PAS). Utilizzando questi metodi, candid candidali e lieviti appaiono blu scuro (Gram-macchia) o rosso/viola (PAS) .

In caso di candidosi iperplastica cronica, è necessaria una biopsia della lesione per il successivo rilevamento dell’invasione della Candida mediante colorazione istologica utilizzando le macchie PAS o metenamina argento di Gomori. La dimostrazione degli elementi fungosi all’interno dei tessuti è fatta mentre sono tinti profondamente da queste macchie. La presenza di blastospore e pseud o pseudoiphe può consentire all’istopatologo di identificare il fungo come una specie di Candida e, data la presenza di altre caratteristiche istopatologiche, fare una diagnosi di candidosi iperplastica cronica .

7. Coltura di laboratorio

7.1. Tampone

Un tampone di un sito lesionale è un metodo relativamente semplice per rilevare la crescita e la stima semiquantitativa di Candida può essere ottenuto. L’approccio di campionamento consiste nel strofinare delicatamente un tampone di cotone sterile sul tessuto lesionale e successivamente inoculare un mezzo di isolamento primario come l’agar destrosio di Sabouraud (SDA) .

7.2. Risciacquo orale concentrato

La tecnica di risciacquo orale prevede che il paziente tenga 10 ml di soluzione salina tampone fosfato sterile (0,01 M, pH 7,2) in bocca per 1 minuto. La soluzione viene quindi concentrata (10 volte) mediante centrifugazione e un volume noto, solitamente 50 µL, inoculato su un mezzo di agar utilizzando un sistema di placcatura a spirale. Dopo 24-48 ore di incubazione a 37°C, la crescita viene valutata mediante enumerazione delle colonie ed espressa come unità formanti colonie candidali per mL (cfu mL-1) di risciacquo .

7.3. Coltura di impronta

Il metodo di impronta utilizza un tampone di schiuma sterile di dimensioni note (tipicamente 2,5 cm2), precedentemente immerso in un mezzo liquido appropriato, come il brodo di Sabouraud, immediatamente prima dell’uso. Il tampone viene quindi posizionato sul sito di destinazione (mucosa o protesi intraorale) per 30 secondi e quindi trasferito in un agar per la coltura .

8. Terreno di coltura

Il mezzo di isolamento primario più frequentemente utilizzato per Candida è SDA che, pur consentendo la crescita di Candida, sopprime la crescita di molte specie di batteri orali a causa del suo basso pH. Incorporazione di antibiotici in SDA aumenterà ulteriormente la sua selettività . Tipicamente SDA è incubato aerobicamente a 37°C per 24-48 ore. La candida si sviluppa come colonie convesse crema, lisce e pastose su SDA e la differenziazione tra le specie è raramente possibile . Si stima che più di una specie di Candida si verifichi in circa il 10% dei campioni orali e negli ultimi anni la capacità di rilevare specie non albicans è diventata sempre più importante .

Negli ultimi anni sono stati sviluppati altri mezzi differenziali che consentono l’identificazione di alcune specie di Candida in base all’aspetto e al colore della colonia dopo la coltura primaria. Il vantaggio di tali mezzi è che la presenza di più specie di Candida in una singola infezione può essere determinata che può essere importante nella selezione delle opzioni di trattamento successive . Esempi di questi includono l’agar Pagano-Levin o gli agar cromogenici disponibili in commercio, vale a dire CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate o Candichrom albicans .

Pagano-Levin agar distingue tra le specie di Candida in base alla riduzione del cloruro di trifeniltetrazolio. Il mezzo produce colonie di colore chiaro di C. albicans, mentre le colonie di altre specie di Candida presentano vari gradi di colorazione rosa. Pagano – Levin agar ha una sensibilità simile a SDA, ma è superiore per la rilevazione di più di una specie nel campione, CHROMagar Candida identifica C. albicans, C. tropicalis e C. krusei basati sul colore e l’aspetto della colonia, mentre l’ID Albicans e il Fluroplate si sono dimostrati utili per la presunta identificazione di C. albicans . La specificità dell’identificazione è riportata per essere 95% per CHROMagar Candida e 98.6% per Albicans ID e agar Fluroplate . L’uso di CHROMagar Candida come agar di isolamento primario è stato citato come un approccio che consente la discriminazione della C. dubliniensis recentemente descritta da C. albicans. Su CHROMagar Candida, C. dubliniensis si sviluppa come colonie verdi più scure rispetto a quelle di C. albicans . Tuttavia, la discriminazione tra queste due specie utilizzando CHROMagar sembra diminuire su sottocultura e stoccaggio di isolati. Il fallimento di C. dubliniensis di crescere su terreni agar alla temperatura di incubazione elevata di 45°C è stato recentemente suggerito come test alternativo per discriminare tra queste due specie .

9. Identificazione delle specie di Candida

L’identificazione dei lieviti sulla base dei terreni di coltura primari può essere confermata attraverso una serie di test supplementari tradizionalmente basati sulle caratteristiche morfologiche (Tabella 5) e fisiologiche degli isolati.

9.1. Criteri morfologici

Il test in provetta germinale è il metodo standard di laboratorio per identificare C. albicans. Il test prevede l’induzione di escrescenzeph (provette germinali) quando sottoculturate in siero di cavallo a 37°C per 2-4 ore. Circa il 95% degli isolati di C. albicans produce tubi germinali, proprietà condivisa anche da C. stellatoidea e C. dubliniensis .

C. albicans e C. dubliniensis possono anche essere identificati da altre specie in base alla loro capacità di produrre caratteristiche morfologiche note come chlamydospores. Le clamidospore sono strutture rifrattili e sferiche generate ai termini delleph dopo la coltura di isolati su un mezzo nutrizionalmente povero come l’agar di farina di mais. Gli isolati vengono inoculati in un modello di tratteggio incrociato sull’agar e sovrapposti con un coprioggetto sterile. Gli agari vengono incubati per 24-48 ore a 37°C e quindi esaminati microscopicamente per la presenza di chlamydospore .

9.2. Criteri fisiologici / Identificazione biochimica

L’identificazione biochimica delle specie di Candida si basa in gran parte sull’utilizzo di carboidrati. I test tradizionali avrebbero coinvolto la coltura di isolati di prova su un agar basale privo di una fonte di carbonio. Le soluzioni di carboidrati sarebbero quindi collocate all’interno dei pozzetti dell’agar seminato o su dischi di carta da filtro situati sulla superficie dell’agar. La crescita in prossimità della fonte di carbonio indicherebbe l’utilizzo. I sistemi commerciali si basano sullo stesso principio, ma i carboidrati di prova sono alloggiati in pozzetti di plastica situati su una striscia reattiva. La crescita in ogni pozzetto viene letta dai cambiamenti nella torbidità o dai cambiamenti di colore in alcuni sistemi di kit. I codici numerici ottenuti dai risultati del test sono utilizzati per identificare l’organismo di prova in base al confronto di database .

9.3. Sierologia

I test sierologici sono frequentemente utilizzati per accertare il significato clinico degli isolati di specie di Candida. L’aumento dei titoli di anticorpi lgG contro C. albicans può riflettere la candidosi invasiva in individui immunocompetenti. Il rilevamento di anticorpi IgA e IgM è importante per identificare un’infezione acuta. Gli individui immunosoppressi mostrano spesso variabilità nella produzione di anticorpi e in tal caso si raccomanda l’uso di un test di rilevamento dell’antigene. Test come enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) e radio immuno assay (RIA) per la rilevazione di antigene candidiale, mannano della parete cellulare o costituenti citoplasmatici sono ora disponibili nei paesi sviluppati .

La diagnosi sierologica è spesso ritardata e i test mancano ancora di sensibilità e specificità. Inoltre, la produzione di anticorpi nei pazienti immunocompromessi è variabile, rendendo la diagnosi complicata . Ciò è dovuto al fatto che antigeni fungini e metaboliti vengono spesso eliminati rapidamente dalla circolazione e la presenza di anticorpi non sempre implica un’infezione da Candida, specialmente nei pazienti con grave malattia di base o che assumono farmaci immunosoppressori .

I test sierologici non sono normalmente uno strumento diagnostico per la candidosi orale. Tuttavia, tali test possono essere uno strumento prognostico in pazienti con grave candidosi orale che rispondono male alla terapia antimicotica .

9.4. Metodi di identificazione basati su molecole

L’identificazione mediante analisi della variabilità genetica è un approccio più stabile rispetto all’utilizzo di metodi basati su criteri fenotipici. Per l’identificazione della Candida basata sulla variazione genetica sono analisi delle differenze di cariotipo elettroforetico e polimorfismi di lunghezza del frammento di restrizione (RFLPs) utilizzando elettroforesi su gel o ibridazione DNA-DNA .

Approcci PCR specie-specifici sono stati utilizzati anche per l’identificazione delle specie di Candida. Diversi geni bersaglio sono stati segnalati per la discriminazione delle specie Candida, anche se quelli più frequentemente amplificati sono le sequenze dell’operone RNA ribosomiale. L’identificazione può essere ottenuta in base alle dimensioni del prodotto PCR ottenute in seguito alla risoluzione dell’elettroforesi su gel o alla variazione della sequenza del prodotto PCR determinata mediante sequenziamento diretto o mediante l’uso di analisi dei frammenti di restrizione dopo il taglio di sequenze PCR con endonucleasi di restrizione .

L’ibridazione in situ a fluorescenza con il metodo dell’acido nucleico peptidico (PNA Fish) è una nuova tecnica di rilevamento che si rivolge a sequenze specie-specifiche altamente conservate nell’abbondante rRNA di C. albicans vivente. Le singole celle possono essere rilevate direttamente senza la necessità di amplificazione . Questa tecnica raggiunge una sensibilità del 98,7-100%, con una specificità del 100%, consentendo la discriminazione di C. albicans dalla C. dubliniensis fenotipicamente simile .

La tecnologia a base molecolare può anche essere utilizzata per identificare ceppi di specie di Candida, sebbene l’uso di tecniche come l’elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE), l’analisi del DNA polimorfico amplificato casuale (RAPD) e la PCR di amplificazione a sequenza ripetuta (REP) siano in gran parte riservate alle indagini epidemiologiche nella ricerca della candidosi orale .

10. Conclusione

Negli ultimi anni è stata data maggiore enfasi all’identificazione affidabile delle specie di Candida da campioni clinici umani. Una rappresentazione schematica per l’isolamento candidale e l’identificazione è presentata in Figura 1. Poiché la Candida è la microflora residente, sono necessari metodi di isolamento appropriati per accertare la presenza in bocca insieme al loro numero. È anche importante identificare i ceppi infettanti di Candida perché isolati di specie di Candida differiscono ampiamente, sia nella loro capacità di causare infezioni e anche nella loro suscettibilità agli agenti antifungini. Sono disponibili varie tecniche fenotipiche per l’identificazione di Candida isolata, tra cui l’utilizzo di test di coltura morfologica, mezzi di agar differenziali e test di assimilazione biochimica. Questi metodi sono integrati con recenti tecniche molecolari in gran parte riservate alle indagini epidemiologiche.

Figura 1

Rappresentazione schematica dell’isolamento e dell’identificazione delle specie di Candida dalla cavità orale.