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Espressione di ALDH1 nel pancreas embrionale e adulto.
Sulla base di studi precedenti che documentano alti livelli di attività enzimatica ALDH1 nei progenitori epiteliali neurali, ematopoietici e mammari (17-19), abbiamo caratterizzato i modelli temporali e spaziali dell’espressione della proteina ALDH1 nel pancreas embrionale e adulto del topo (Fig. 1). Usando E-caderina come marker delle cellule epiteliali pancreatiche, abbiamo scoperto che la proteina ALDH1 è prima rilevabile all’interno dell’epitelio pancreatico in via di sviluppo su E12.5 (Fig. 1 BIS). A questo punto, l’espressione è limitata alle punte dei tubuli ramificati, recentemente proposti per rappresentare un dominio progenitore multipotenziale (20). Un modello simile di espressione è stato precedentemente riportato per le trascrizioni Aldh1a1 (21). L’espressione nelle punte tubolari (e non nei tronchi centrali) persiste attraverso E14.5 (Fig. 1 B e B’), ed è successivamente down-regolato nel differenziare le cellule acinari. Nel pancreas adulto, l’espressione epiteliale ALDH1 è più frequentemente osservata nelle cellule epiteliali duttali centroacinari e terminali (Fig. 1 E-V). Le cellule mesenchimali (E-caderina-negative) che esprimono ALDH1 sono state rilevate anche intorno alle isole endocrine e agli acini esocrini (Fig. S1).
Espressione di ALDH1 nel pancreas embrionale e adulto del topo. (A-C) Etichettatura immunofluorescente per la proteina ALDH1 (verde) in combinazione con E-caderina (rosso) per contrassegnare le strutture epiteliali in E12.5 (A), E14.5 (B e B’) e pancreas di topo adulto (C). L’immagine in (B’) rappresenta una vista ad ingrandimento maggiore dell’area indicata dalla casella in (B). Nota restrizione dell’espressione ALDH1 alle punte dei rami epiteliali (indicati dagli asterischi in B’) e non più-tronchi di ramo centrali (indicati da stella). Nel pancreas adulto (C), l’espressione di ALDH1 è limitata a un sottoinsieme di cellule centroacinari E-caderina-positive. (D ed E) Rilevazione immunoistochimica della proteina ALDH1 (marrone) in sottoinsiemi di cellule centroacinari (frecce) e dotti terminali (punta di freccia). (Barre di scala: 50 µM.)
Per caratterizzare ulteriormente l’espressione di ALDH1 e l’attività enzimatica di ALDH1 nelle cellule dotto / centroacinare terminali adulte, abbiamo utilizzato preparazioni di unità periferiche acinare-duttali appena isolate dal pancreas esocrino di topo digerito dalla collagenasi (22). È importante sottolineare che queste unità periferiche isolate acinare-duttali sono marcatamente esaurite di grandi dotti ed elementi endocrini. Rispetto al pancreas totale, le unità acinare-duttali periferiche hanno mostrato una deplezione >di 400 volte nei trascritti di insulina, come valutato da RT-PCR (Fig. S2A). Quando l’analisi FACS è stata eseguita su unità acinare-duttali periferiche raccolte da Ins1 transgenico: topi DsRed che esprimono proteine fluorescenti rosse nelle cellule β, solo 3 delle 10.000 cellule (0,03%) di questa preparazione sono risultate positive per DsRed.
Ulteriore caratterizzazione tridimensionale dell’espressione della proteina ALDH1 è stata realizzata utilizzando l’etichettatura fluorescente a montaggio intero di unità acinare-duttali periferiche isolate. La proteina ALDH1 è stata localizzata in combinazione con E-caderina come marker di cellule epiteliali e con agglutinina di Dolichos biflorus coniugata con FITC (DBA) o agglutinina di arachidi coniugata con FITC (PNA), marcatori di cellule duttali e acinari, rispettivamente. L’imaging multicanale ha confermato una posizione duttale prevalentemente centroacinare / terminale delle cellule epiteliali che esprimono ALDH1 nel pancreas adulto (Fig. S3). Le cellule che esprimono ALDH1 sono state più spesso interposte tra l’epitelio duttale terminale e le cellule acinari più periferiche. Inoltre, singole cellule epiteliali che esprimono ALDH1 sono state osservate immediatamente adiacenti all’epitelio duttale terminale (Fig. S3 A e B). Sono state identificate sia le cellule ALDH1-positive DBA-positive che DBA-negative, mentre le cellule PNA-positive ALDH1-positive sono state identificate solo raramente.
Isolamento di cellule duttali centroacinari e terminali che esprimono ALDH1.
Nella speranza di isolare le cellule che esprimono ALDH1 dal pancreas di topo adulto, abbiamo approfittato di un substrato fluorogenico noto come “Aldefluor” (tecnologie StemCell), che è stato precedentemente utilizzato nell’isolamento basato su FACS di cellule staminali epiteliali ematopoietiche, neurali e mammarie (17-19). Prima di tentare l’isolamento basato su FACS delle cellule epiteliali pancreatiche che esprimono ALDH1, abbiamo prima applicato questo reagente per visualizzare le cellule viventi che esprimono ALDH1 in unità acinare-duttali periferiche (Fig. 2). Come mostrato in Fig. 2 E ed F, questi studi hanno confermato la posizione duttale centroacinare/terminale delle cellule aldefluor-positive a bassa abbondanza nel pancreas adulto del topo. Le cellule duttali centroacinari/terminali aldefluor-positive sono state facilmente distinte dalle cellule acinari adiacenti in virtù delle loro piccole dimensioni e della mancanza di granuli di zimogeno. Ulteriori esempi di imaging di cellule vive utilizzando il reagente Aldefluor sono forniti in Fig. S4. Questi risultati implicavano che l’immunofluorescenza anti-ALDH1 e la citofluorescenza basata su Aldefluor stavano etichettando una popolazione duttale centroacinare/terminale simile e suggerivano inoltre che queste cellule potessero essere isolate con successo da FACS.
FACS isolamento delle cellule epiteliali duttali centroacinari/terminali che esprimono ALDH1 utilizzando il reagente Aldefluor. L’ordinamento FACS è stato eseguito su singole cellule isolate da unità periferiche acinare-duttali esaurite di elementi endocrini e di grandi condotti. (A e B) Gating delle cellule aldefluor-positive basate sull’attività enzimatica DEAB-sensibile ALDH1. l’asse y indica la dispersione laterale; l’asse x indica l’intensità del segnale Aldefluor (A) con e (B) senza DEAB. (B e C) Rilevazione dell’attività enzimatica ALDH1 (C) con e (D) senza DEAB, in combinazione con il rilevamento superficiale della proteina E-caderina. l’asse y rappresenta l’intensità dell’etichettatura con anticorpo anti-E-caderina coniugato APC; l’asse x indica l’intensità del segnale Aldefluor. FACS-ordinati popolazioni indicato dalla P2, P3, P4 e P5 in D corrispondono a Aldefluor-positivo, E-caderina-negativo (A+E−), Aldefluor-positivo, E-caderina-positivo (A+E+), Aldefluor-negativo, E-caderina-positivo (−E+), e Aldefluor-negativo, E-caderina-negativo (A−E), rispettivamente. (E e F) L’imaging del pancreas di topo digerito dalla collagenasi utilizzando il reagente Aldefluor conferma la localizzazione duttale centroacinare/terminale delle cellule aldefluor-positive, simile a quella osservata per l’immunofluorescenza ALDH1 (Figs. 1 e 2). Nota posizione duttale centroacinare/terminale e piccole dimensioni delle cellule aldefluor-positive rispetto alle cellule acinari più grandi, che sono facilmente identificabili dal citoplasma granulare corrispondente ai granuli di zimogeno apicale. (Barre di scala: 50 µM.) (G) Analisi quantitativa RT-PCR dell’espressione genica in cellule A+E+ (rosso), cellule A+E (bianco), cellule A+E (blu) e cellule A− E (nero). Rispetto alle cellule epiteliali A-E+ aldefluor-negative, le cellule epiteliali centroacinari/terminali duttali A + E + aldefluor-positive sono arricchite per i trascritti che codificano Aldh1a1, Aldh1a7, Sca1, Sdf1, c-Met, Nestin, Ptf1a e Sox9. (Barre di scala: 50 µM.)
Formazione, differenziazione e funzione delle pancreatosfere derivate da cellule duttali centroacinari/terminali aldefluor-positive. (A e B) Le cellule epiteliali duttali A+E+ centroacinar/terminali, ma non le cellule epiteliali A−E+, formano in modo efficiente le pancreatosfere nella coltura in sospensione. (C-G) Espressione di E-caderina (C), insulina C-peptide (D), amilasi (E), Sox9 (F), e ALDH1 (G) in giorno 7 pancreatosfere formate da A+E+ centroacinare/terminale duttale cellule epiteliali. (H) Proliferazione cellulare in pancreatosfere di giorno 7 come valutato mediante incorporazione notturna di EdU aggiunto il giorno 6 del periodo di coltura. (I) Saggio basato su ELISA di insulina C-peptide immagazzinata e secreta dopo incubazione notturna di pancreatosfere o cellule Ins-1 in concentrazioni variabili di glucosio. Si noti che le pancreatosfere mostrano una sensibilità al glucosio simile a quella osservata nelle cellule Ins-1 (cioè, increase aumento di 2 volte nel peptide C secreto in risposta al glucosio 0 vs. 11 mM). (Barre di scala: 100 µM.)
Abbiamo poi perseguito la caratterizzazione basata su FACS e l’ordinamento di singole cellule dissociate da unità acinare-duttali periferiche. Come mezzo iniziale per stabilire un gating specifico delle cellule che esprimono ALDH1, abbiamo impiegato un inibitore farmacologico dell’attività enzimatica ALDH1 (DEAB). Come raffigurato in Fig. 2 A-D, questa strategia ha permesso l’isolamento di una popolazione cellulare a bassa abbondanza caratterizzata da alti livelli di attività enzimatica ALDH1 sensibile al DEAB, comprendente 0,9% ± 0.2% di tutte le cellule ordinate nel pancreas adulto del topo. Utilizzando un anticorpo E-caderina per identificare simultaneamente le cellule epiteliali, le cellule di Aldefluor (+) E-caderina (+) rappresentano lo 0,5% ± 0,13% di tutte le cellule ordinate nel pancreas di topo adulto (Fig. 2D).
l’Utilizzo di RT-PCR quantitativa per confrontare il Aldefluor-positivo, E-caderina-positivo (A+E+), Aldefluor-negativo, E-caderina-positivo (−E+), Aldefluor-positivo, E-caderina-negativo (A+E−), e Aldefluor-negativo, E-caderina-negativo (A−E) popolazioni isolate da adult mouse pancreas, abbiamo trovato le Un+E+ popolazione per essere arricchito in modo significativo per le trascrizioni di codifica Aldh1a1 e Aldh1a7, e impoverito di trascrizioni per altri due ALDH1 isoforme, Aldh1a2 e Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 non è stato rilevato in nessuno dei campioni. Rispetto ad E+ popolazione+E+ le cellule sono state modestamente impoverito di trascrizioni per Pdx1 (P < 0.09), Amilasi (P < 0.001), e Citocheratina 19 (P < 0.01) (marcatori espressi in differenziato β-cellule, le cellule acinose, e le cellule dei dotti, rispettivamente). Al contrario, le cellule A+E + erano caratterizzate da un’espressione ad alto livello di Ptf1a, nonostante fossero esaurite sia dei trascritti dell’amilasi che della proteina amilasi (Fig. 3G e Fig. S5). Inoltre, queste cellule sono state arricchite per trascritti che codificano Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1 e Hey2, marcatori precedentemente associati a popolazioni progenitrici nel pancreas e in altri tessuti. Utilizzando l’etichettatura immunofluorescente sui preparati cytospin di cellule classificate FACS, abbiamo confermato un marcato arricchimento per la proteina ALDH1 e Sox9 e l’esaurimento dell’amilasi nelle cellule A + E + (Fig. S5). Inoltre, abbiamo anche eseguito l’analisi FACS per determinare la frequenza con cui le cellule di Aldefluor (+) erano anche positive per i marcatori di cellule staminali come CD133 e la proteina Sca-1, e abbiamo osservato che oltre il 90% delle cellule di Aldefluor (+) coespresse entrambi questi marcatori di cellule staminali. Al contrario, solo lo 0,11% delle cellule di Aldefluor (+) era positivo anche per il marcatore endoteliale vascolare PECAM, mentre lo 0,08% era positivo per il marcatore ematopoietico CD45. Quando l’analisi FACS è stata eseguita su unità periferiche acinare-duttali raccolte da topi transgenici Ins1-DsRed che esprimono proteine fluorescenti rosse in cellule β, tutte le cellule Aldefluor (+) sono risultate negative per dsRed.
Analisi della pancreatosfera della funzione progenitrice endocrina ed esocrina.
Come schermata iniziale per l’attività progenitrice, abbiamo analizzato le cellule Aldefluor (+) e Aldefluor (-) per la capacità di formare pancreatosfere (Fig. 3), simile al test di neurosfera comunemente usato per identificare i progenitori neurali (23). In questi test, le cellule duttali centroacinari/terminali A+ E + sono state in grado di formare sfere in coltura di sospensione. Le celle A + E + mostravano un’efficienza di formazione della sfera > 100 volte quella delle loro controparti A−E+ (Fig. 3 A e B e Tabella S1). Con minori efficienze, singole celle A + E + erano persino in grado di formare sfere quando placcate a densità clonale (una cella per pozzetto) in piastre a 96 pozzetti (Tabella S1). Nessuna delle popolazioni E-caderina-negative ha mostrato una significativa capacità di formazione della sfera. Quando coltivate in un periodo da 5 a 7 giorni, le pancreatosfere derivate da cellule A+E + hanno mostrato una forte espressione di E-caderina (Fig. 3C), confermando la loro identità epiteliale, e le singole cellule all’interno delle sfere cominciarono ad accumulare quantità considerevoli di amilasi o insulina e insulina C-peptide (Fig. 3 D ed E). A 5 giorni, ≈50% delle pancreatosfere ha mostrato l’espressione di amilasi, mentre circa il 30% ha mostrato l’immunoreattività all’insulina C-peptide. Le singole sfere erano generalmente positive per insulina o amilasi, ma non entrambe. Piccoli sottoinsiemi di cellule all’interno delle sfere mantenevano l’espressione ALDH1 durante il periodo di coltura e dimostravano anche l’espressione nucleare della proteina Sox9 (Fig. 3 F e G), suggerendo l’eventuale mantenimento di un pool progenitore auto-rinnovante. Questa apparente capacità di auto-rinnovamento è stata ulteriormente supportata dal fatto che le pancreatosfere generate dalle cellule duttali centroacinari/terminali Aldefluor (+) potrebbero essere sottoposte a dissociazione enzimatica seriale, mantenendo la loro capacità di formazione della sfera su un minimo di tre passaggi sequenziali a intervalli di 7 giorni. Inoltre, le cellule all’interno delle sfere erano altamente proliferative, come valutato dall’incorporazione notturna di EdU aggiunto all’inizio o alla fine del periodo di coltura (Fig. 3H).
Sulla base delle distinte capacità progenitrici visualizzate dalle cellule A+E+, abbiamo ulteriormente esaminato le popolazioni cellulari ordinate per l’espressione di Ngn3, un marker delle cellule progenitrici endocrine (Fig. S2B). Coerentemente con studi precedenti (7), non siamo stati in grado di rilevare un’espressione significativa di Ngn3 nel pancreas adulto totale o in una qualsiasi delle popolazioni cellulari appena ordinate. Tuttavia, una volta che le cellule A+E+ sono state poste in coltura, hanno iniziato a generare un’espressione rilevabile di Ngn3 immediatamente precedente l’inizio dell’espressione dell’insulina, confermando ulteriormente la capacità progenitrice endocrina delle cellule epiteliali centroacinari e duttali terminali che esprimono ALDH1.
Le pancreatosfere derivate da Aldefluor (+) Cellule terminali duttali / centroacinari mostrano la secrezione di insulina che risponde al glucosio.
Il rilevamento di cellule che esprimono insulina e insulina C-peptide in pancreatosfere coltivate ha indotto a valutare se queste cellule fossero capaci di secrezione di insulina sensibile al glucosio, una caratteristica delle cellule β funzionali. Come controllo positivo, abbiamo utilizzato cellule Ins-1 (clone 832/13) una linea di cellule β immortalate comunemente utilizzate per studi sulla secrezione di insulina in risposta a concentrazioni fisiologiche di glucosio. Dopo l’incubazione notturna di pancreatosfere o cellule Ins-1 in glucosio 0, 5 e 11 mm, sia i surnatanti dei terreni di coltura che i lisati cellulari sono stati raccolti e analizzati per il peptide C-insulina secreto e cellulare utilizzando un test basato su ELISA. Pancreatosfere derivate da Aldefluor ( + ) cellule duttali centroacinari/terminali secernevano C-peptide in modo glucosio-dipendente, con sensibilità al glucosio simile a quella visualizzata dalle cellule Ins-1 (Fig. 3I).
Aldefluor (+) Le cellule duttali / centroacinari terminali adulte possono contribuire ai lignaggi endocrini ed esocrini embrionali.
Come test ancora più rigoroso per l’attività del progenitore pancreatico, abbiamo microiniettato le cellule isolate di Aldefluor (+) e Aldefluor (–) in gemme pancreatiche dorsali microdissettate isolate da embrioni di topo E12.5 e testato per una capacità di contribuire in modo produttivo ai lignaggi endocrini ed esocrini in via di sviluppo (Fig. 4). Questo approccio è stato recentemente utilizzato per documentare l’attività progenitrice per le cellule che esprimono Ngn3 derivanti dalla legatura del dotto pancreatico (7). Per tracciare il lignaggio delle cellule donatrici derivate da adulti e distinguerle dalle loro controparti derivate da embrioni, abbiamo isolato Aldefluor ( + ) e Aldefluor ( – ) cellule dal pancreas di topi che trasportano un pCAG ubiquitamente espresso:mCherry transgene, come schematicamente raffigurato in Fig. 4A (pCAG:i topi mCherry sono stati gentilmente forniti da Michael Wolfgang, Johns Hopkins University). Rispetto alle cellule di Aldefluor ( – ), le cellule di Aldefluor ( + ) hanno un potenziale notevolmente migliorato di contribuire alle linee endocrine emergenti all’interno delle gemme dorsali in maturazione, come dimostrato dalla coespressione di mCherry con entrambi i peptidi C (Fig. 4 B-E) o glucagone (Fig. 4 F-I). Utilizzando l’etichettatura E-caderina sovrapposta per consentire il conteggio delle singole cellule mCherry-positive, abbiamo valutato quantitativamente la capacità delle cellule adulte di Aldefluor (+) e Aldefluor (−) di entrare in lignaggi embrionali. Sette giorni dopo la microiniezione delle cellule di Aldefluor (+) in E12.5 gemme dorsali, l’espressione del glucagone è stata osservata nell’11,7% delle cellule positive mCherry residue, con l’espressione del peptide C dell’insulina osservata in un ulteriore 11,6% (Fig. 5N). Al contrario, il 2,4% delle cellule residue di Aldefluor (-) mCherry − positivo espresse glucagone e solo lo 0,2% espresse insulina C-peptide. È interessante notare che le popolazioni di Aldefluor (+) e Aldefluor (–) mostravano capacità equivalenti di entrare in lignaggi epiteliali non endocrini, forse riflettendo il fatto che la maggior parte della popolazione di Aldefluor (–) era composta da cellule acinari già differenziate. Frequenze simili di positività di E-caderina, amilasi e PNA sono state osservate in cellule residue mCherry-positive derivate dalla popolazione di Aldefluor (+) o Aldefluor ( – ) (Fig. 4 G–N).
Le cellule pancreatiche adulte aldefluor-positive entrano sia nei lignaggi endocrini che esocrini nel pancreas embrionale coltivato. (A) Schema dell’esperimento. Per tracciare il lignaggio delle cellule adulte, le cellule Aldefluor (+) e Aldefluor (–) sono state isolate da CAG adulto:pancreas transgenico di topo mCherry, microiniettato in gemme pancreatiche dorsali microdissettate isolate da E12.5 embrioni di topo non transgenici, e testati per la capacità di contribuire in modo produttivo allo sviluppo di lignaggi endocrini ed esocrini. (B-J) La coespressione di mCherry e insulina C–peptide (B–E) e mCherry e glucagone (F – I) conferma la capacità delle cellule adulte di Aldefluor ( + ) di contribuire ai lignaggi embrionali delle cellule β e α, mentre l’etichettatura delle singole cellule positive di mCherry con PNA coniugato con FITC (J-M) conferma la capacità di contribuire al lignaggio acinare embrionale. (N) Frequenze con cui le cellule adulte Aldeflouor ( + ) e Aldefluor (-) residue mCherry − positive etichettano per insulina C-peptide, glucagone, E-caderina e PNA 7 giorni dopo la microiniezione in gemme pancreatiche dorsali microdissettate E12.5. Tutti i conteggi delle cellule sono stati determinati usando l’etichettatura di E-cadherin per delineare il confine delle singole cellule. Si noti che la capacità di differenziazione endocrina è prevalentemente limitata alla popolazione di Aldefluor ( + ), mentre entrambe le cellule di Aldefluor (+) e Aldefluor (−) possono contribuire in modo produttivo ai lignaggi esocrini in via di sviluppo. (Barre di scala: 50 µM.)
Espansione delle cellule epiteliali duttali centroacinari e terminali che esprimono ALDH1 nell’ambito dell’infiammazione cronica e della metaplasia epiteliale rigenerativa. Dopo il recupero dell’antigene, la proteina ALDH1 è stata rilevata utilizzando immunoistochimica su tessuto pancreatico da pancreas adulto normale (A e B) e pancreas raccolto da topi con pancreatite cronica indotta da tre iniezioni settimanali di caeruleina (C–H). (A e B) Etichettatura a bassa frequenza per ALDH1 in cellule epiteliali duttali terminali (TD) da pancreas adulto normale. (C and D) Expansion of ALDH1-expressing terminal ductal epithelium following sequential caerulein administration. (E and F) Similar expansion of ALDH1-expressing centroacinar cells (CAC) following sequential caerulein administration. (G and H) Expression of ALDH1 in caerulein-induced metaplastic type 2 (TC2; H), but not type 1 (TC1; G) tubular complexes.
Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.
Per valutare il comportamento in vivo delle cellule centroacinari e terminali che esprimono ALDH1, abbiamo valutato i modelli di espressione di ALDH1 nell’ambito dell’infiammazione cronica e della metaplasia rigenerativa indotta dalla somministrazione sequenziale di caeruleina a basso dosaggio. Come riportato in precedenza (15), il trattamento di topi adulti con tre iniezioni di caeruleina (50 µg/kg) a settimana per 3 settimane consecutive ha indotto uno stato di pancreatite cronica seguito da rigenerazione e riparazione quasi completa. Questo processo è caratterizzato da infiltrati infiammatori, espansione stromale e formazione di complessi tubolari metaplastici rigenerativi, che includono complessi tubolari di tipo 1 precedentemente dimostrati derivati da cellule acinari e complessi tubolari di tipo 2 (TC2), precedentemente dimostrati derivati nonacinari e presumibilmente derivanti da cellule terminali proliferanti (15). In contrasto con l’abbondanza relativamente bassa di dotto terminale che esprime ALDH1 e cellule centroacinari osservate nel pancreas adulto normale (Fig. 5 A e B), canale terminale che esprime ALDH1 (Fig. 5 C e D) e centroacinare (Fig. 5 E ed F) le cellule sono state marcatamente espanse nell’ambito della pancreatite cronica indotta da caeruleina. Da notare, i complessi tubolari di tipo 2 erano costituiti prevalentemente da cellule che esprimono ALDH1 (Fig. 5H), mentre i complessi tubolari di tipo 1 non hanno mostrato alcuna evidenza di espressione di ALDH1 (Fig. 5G).
