Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC) che rappresenta il principale sottotipo istologico dei tumori primari del fegato, è il quinto cancro più frequente in tutto il mondo e la terza causa principale di mortalità per cancro (1,2). I tassi più elevati di cancro al fegato si riscontrano nei paesi in via di sviluppo, in particolare nell’Asia orientale/sudorientale e nell’Africa centro-occidentale, mentre i tassi sono bassi nell’Asia centro-meridionale,occidentale, nell’Europa settentrionale e orientale (3). Alterazione genetica ed epigeneticafattori ad alto rischio come l’infezione cronica da HBV o HCV,cirrosi epatica, malattia epatica alcolica e aflatossine rappresentanoper l’elevata morbilità di HCC (4-6).Tuttavia, il meccanismo molecolare accompagnato daepatocarcinogenesi e progressione è ancora in gran parte poco chiaro.Pertanto, è fondamentale per noi chiarire l’eziologia e investigare l’alterazione molecolare vitale alla base dell’iniziazione e della progressione dell’epatocellularcarcinoma e, in ultima analisi, migliorare i concetti attuali per la diagnosi, lo screening e il trattamento di questa malattia.

Durante il processo di hepatocarcinogenesis, theabrogation del ciclo cellulare checkpoint è un importante segno distintivo thatmay promuovere la formazione di cancro (2).Come uno dei regolatori del ciclo cellulare checkpoint, celldivision ciclo di 20 (CDC20) sembra agire come un di regolamentazione proteininteracting con la promozione anafase-complesso/cyclosome (APC/C), del ciclo delle cellule, che è richiesto per l’anafase iniziazione andlate mitosi uscita (7,8). Due fattori regolatori, CDC20 e CDH1 si legano direttamente all’APC e attivano la sua attività di ubiquitinazione della ciclina durante la mitosi e la fase G1 (9,10).È stato riportato che la proteina associata al recettore 80 (RAP80), che recluta BRCA1 nei siti di danno al DNA nella via di segnalazione ubiquitaria indotta dal danno al DNA, può essere degradata dal complesso di promozione dell’anafase (APC/C-Cdc20) o (APC/C-Cdh1) attraverso la poliubiquitinazione durante la mitosi alla fase G1 (11). L’esaurimento di RAP80 ha mostrato un controllo efficace del checkpoint di fase G2-M e ha promosso la progressione del ciclo mitoticcell.

L’espressione CDC20 può essere notevolmente soppressa dalla p53proteina che inibisce la trasformazione maligna attraverso la regolazione del ciclo cellulare, la senescenza cellulare e i geni correlati all’apoptosi(12). Alta espressione di CDC20 è stata riportata in vari tumori maligni tra cui adenocarcinoma pancreaticoduttale (13), carcinoma a cellule quamose orali, cancro gastrico (14), cancro cervicale (15) e varie cellule tumorali (14,16).Tuttavia, il modello di espressione di CDC20 e il suo significato clinico nel carcinoma epatocellulare umano non sono stati chiariti.

In questo studio, analizzando il set di dati microarray(accession no. GSE14520) dal Gene Expression Omnibus (GEO)database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), abbiamo scoperto che CDC20 era il nodo principale nelle reti di interazione molecolare HCC. Abbiamo esaminato il livello di espressione di CDC20 nei tessuti primari HCC e adiacenti non tumorali e valutato il suo significato clinicopatologico in 132 campioni di HCC archiviati. È stato anche studiato l’effetto dell’abbattimento di CDC20by siRNA sulla crescita e sul ciclo cellulare delle cellule tumorali del fegato. I nostri risultati suggeriscono che CDC20 può svolgere un ruolo significativo nello sviluppo di HCC.

Materiali e metodi

Analisi bioinformatica

Il set di dati Microarray GSE14520 (17) è stato scaricato da GEO. In questo studio sono stati utilizzati un totale di183 HCC e 179 corrispondenti tessuti para-carcinoma che sono stati analizzati con GeneChips Affymetrix U133A da coorte 2 pazienti cinesi. I dati di profilazione dell’espressione genica sono stati riassunti utilizzando il metodo RMA (18) e i file CDF gene-centrici di Entrez(19) (invece dei file CDF originali di Affymetrix), che filtravano sonde non specifiche sui chip e fondevano più set di sonde che rappresentano lo stesso gene Entrez in un set di sonde. L’analisi di significatività del microarray (SAM) (20) è stata eseguita per identificare geni diversamente espressi tra HCC e corrispondenti tessuti paracarcinoma. Delta è stato impostato su 2.25 e la soglia ofFDR è stata impostata su 0.001. Geni sovraespressi in HCC che erano espressi in più di 50 tessuti HCC ma meno di 10correspondenti tessuti para-carcinoma sono stati studiati. I geni sono stati ulteriormente analizzati con il software GenCLiP (21) (http://ci.smu.edu.cn) per annotare le funzioni geniche e costruire reti di interazione molecolare.

Dichiarazione etica

I campioni clinici sono stati utilizzati solo per scopi di ricerca. L’approvazione è stata ottenuta dal comitato etico del ChinesePLA General Hospital (LREC 2012/40). Tutti i campioni sono stati raccolti sotto la condizione di un previo consenso informato scritto da parte dei pazienti.

Pazienti e campioni di tessuto

Sedici paia di HCC freschi e tessuti non tumorali adiacenti utilizzati per le analisi di PCR e western blot in tempo reale sono stati raccolti durante l’intervento chirurgico presso l’Ospedale generale cinese PLA(Pechino, Cina) da novembre 2012 a febbraio 2013. Tissueswere snap-congelato in azoto liquido fino all’uso. I tessuti non tumorali incorporati in paraffina,archiviati e adiacenti utilizzati perimmunoistochimica (IHC) sono stati ottenuti da 132 pazienti HCC che hanno effettuato una resezione epatica parziale nello stesso ospedale tra gennaio 2006 e dicembre 2007. L’età media dei pazientiera di 52 anni (intervallo 24-80 anni).

Coltura cellulare

Una linea di cellule epatiche normali (LO2) e tre linee cellulari HCC (HepG2, SMMC7721, Huh7) sono state acquistate dalla American TypeCulture Collection (ATCC, Manassas, VA) o dalla Chinese Academy ofScience Cell Bank e sono state mantenute nell’Istituto ofBiotechnology, Academy of Military Medical Sciences. Tutte le cellule sono state mantenute nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM, Invitrogen,CA) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS, Gibco, Carlsbad,CA) e 2 mm di L-glutammina, 100 U/ml di penicillina, 100 µg/mlstreptomicina a 37°C con 5% di CO2.

Estrazione di RNA, sintesi di cDNA e analisi PCR in tempo reale

L’RNA totale è stato estratto da linee cellulari e campioni di tessuti utilizzando il reagente trizolo (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Un totale di 2 µg di RNA è stato reversetranscribed utilizzando il TransScript e cDNA Synthesis Kit fromTransGen Biotech (Pechino, Cina). Real-time PCR was performed toexamine CDC20 mRNA level in cell lines and tissue samples by usinga Bio-Rad iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,Hercules, CA). β-actin was used as an internal control fornormalization. PCR primers were designed using the Primer Premier 5software and the sequences were: CDC20 forward,5′-TCGCATCTGGAATGTGTGCT-3′; and reverse,5′-CCCGGGATGTGTGACCTTTG-3′; β-actin forward,5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′; and reverse, 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′. I dati di espressione sono stati normalizzati alla media geometrica del gene di pulizia β-actina e calcolati con il ΔΔCt (22) e i risultati sono stati espressi con 2−ΔΔCt.

Analisi Western blot

L’analisi Western blot è stata eseguita secondo il protocollo standard. L’elettroforesi su gel SDS-poliacrilammide (10%) è stata utilizzata per separare la proteina che è stata poi elettrotrasferita dal gel a una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF). Afterblocking con latte scremato essiccato al 5% per 1 h, la membrana è stata incubata con anticorpo policlonale anti-umano CDC20 di coniglio (1: 1.000, tecnologia Bioworld, St. Louis Park, MN) per 1 ora a cameratemperatura. L’anticorpo monoclonale α-tubulina anti-umano del topo (1: 5.000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) è stato usato come controllo interno. Dopo il lavaggio con Tris-tamponata salina withTween-20 (TBST) tre volte, la membrana è stata incubata withsecondary rafano perossidasi-coniugato anticorpo contro rabbitor mouse (diluizione 1:5,000). La rilevazione chemiluminescente è stata eseguita con Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substratekit (Millipore Corporation, Billerica, MA).

Immunoistochimica (IHC) andscoring

L’immunoistochimica per l’espressione di CDC20 in campioni non tumorali HCC e adiacenti è stata eseguita utilizzando metodi standard.Brevemente, sezioni di tessuto sono state incubate con coniglio anti-CDC20diluted 1:200 (tecnologia Bioworld) durante la notte a 4°C. Sieroalbumina bovina (1%; BSA) senza anticorpo primario è stato usato come negativecontrol. L’anticorpo IgG anti-coniglio secondario di poli-rafano perossidasi (HRP) (ZSGB-Bio, Pechino, Cina) è stato incubatoa temperatura ambiente per 20 min.

Tutte le sezioni immunostained sono state esaminate e controllate in modo indipendente da due patologi in cieco, senza conoscere le informazioni clinico-patologiche, basate sul metodo H-score, che considera l’intensità della colorazione insieme alla percentuale di cellule che colorano positivamente (23,24).Per il metodo H-score, 10 campi sono stati scelti casualmente a ×400magnification. L’intensità di colorazione nelle cellule è stata valutata come 0,1, 2 e 3 corrispondenti rispettivamente alla colorazione negativa, debole, intermedia eforte. In ogni campo sono stati contati il numero totale di celle e celle colorate ad ogni intensità. Il punteggio H è stato calcolato seguendo la formula: (%di cellule macchiate alla categoria di intensità 1×1) + (%di cellule macchiate alla categoria di intensità 2×2) + (%di cellule macchiate alla categoria di intensità 3×3). H-scoresvaried da 0 a 300 dove 300 ha rappresentato 100% delle celle stronglystained (3+) (24). L’alta espressione di CDC20 è stata definita come colorazione H-score di cellule ≥200.

Soppressione di CDC20 da piccolo interferingRNA (siRNA)

A doppio filamento, piccolo interfering RNA (siRNA) wassynthesized e purificato da GenePharma (Shanghai, Cina). Le sottosequenze corrispondenti alla regione codificante del CDC20 umano erano: sense, 5 ‘- GGAGCUCAUCUCAGGCCA UUU-3′; antisense, 5′-AUGGCCUGAGAUGAGCUCCUU-3’. Per il controllo negativo è stato usato un siRNA strapazzato non mirato. Questi siRNA sono stati disciolti indietil pirocarbonato (DEPC) acqua per raggiungere una concentrazione di 20µM. Cancro del fegato Le cellule HepG2 sono state trattate con siRNA CDC20 o siRNA di controllo negativo a 20 nM utilizzando il reagente di trasfezione interferina invitro siRNA (Poliplus Transfection, NewYork, NY).

PCR quantitativa in tempo reale e western blot analyseswere utilizzato per rilevare l’effetto di interferenza di siCDC20. Cellule non trattate o trattate con sirnaoligonucleotidi di controllo negativi erano i gruppi di controllo.

Test di proliferazione cellulare

Due flaconi di plastica da 25 cm2 sono stati ciascuno inoculati con 2×105 cellule tumorali epatiche (HepG2), che sono state poi trasfettate con siRNA di controllo negativo a 20 nM e CDC20siRNA, rispettivamente, per l’incubazione a 48 ore. Quindi, le cellule sono state digeritee seminato in piastre a 6 pozzetti contenenti 2 ml di terreno per pozzetto.Successivamente, le cellule di un pozzo sono state digerite e contate dal contatore cellulare automatizzato (Invitrogen) ogni 24 h fino al quinto giorno.

Fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento(FACS) test del ciclo cellulare

siRNA per CDC20 e il controllo negativo siRNAoligonucleotides erano transfected nelle cellule HepG2 con theINTERFERin in vitro siRNA reagente di trasfezione per 48 h.Dopo il trattamento con 2 µg/ml di timidina (Sigma-Aldrich, St. Louis,MO) per 24 ore, le cellule sono state raccolte in 0, 3, 6, 9, 12-h afterremoving timidina dal mezzo e fissa con alcol al 70%.Prima delle analisi, le cellule sono state lavate con PBS, trattate con 1 mg/mlRNasi A a 37°C per 30 min e poi colorate con ioduro di propidio(PI). Le analisi sono state eseguite da BD FACSCalibur (Becton-Dickinson,Franklin Lakes, NJ) e i risultati sono stati analizzati dal software WinMDI versione 2.9.

Analisi statistiche

Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il pacchetto software statistico IBMSPSS 20.0. L’analisi unidirezionale ofvariance (ANOVA) è stata usata per confrontare l’espressione di CDC20 mRNAnormalized a β-actina in linee cellulari. Lo stesso metodo è stato ancheoperformato nel confrontare la differenziazione istologica nei tessuti tumorali normalizzati con campioni di fegato normali. I confronti dei dati in duegruppi sono stati eseguiti dal t-test dello studente. Il test χ2 è stato utilizzato per analizzare la relazione tra espressione CDC20 e caratteristiche cliniche patologiche. Le correlazioni bivariate trale variabili sono state calcolate dai coefficienti di correlazione di Spearman.Il livello di significatività statistica è stato impostato su P< 0.05 per alltests.

Risultati

CDC20 è il nodo principale nelle reti molecolari di interazione HCC

L’analisi SAM ha identificato 4.358 geni sovraespressi inHCC, in cui 137 geni sono stati espressi in più di 50 tessuti HCC,ma in meno di 10 tessuti para-carcinoma. L’analisi GenCLiP ha mostrato che tra i 137 geni, 72 geni erano correlati al ciclo cellulare(P=1.238 e-15, mediante test χ2), 19 geni erano correlati all’assemblaggio del perno (P=2.172 e-55, mediante test χ2) e 26 geni erano correlati alla segregazione cromosomica (P=5.472 e-55, mediante test x2). Tra le reti molecolari costruite con i 137 geni, CDC20 era il nodo principale che non è stato precedentemente segnalato per essere correlato con HCC. Nove geni (NEK2, E2F1,BUB1, BUB1B, AURKB, CCNB1, CCNB2, UBE2C e CDKN2A) sono noti perinteragire con CDC20, in cui 7 geni erano correlati con spindleassembly checkpoint (SAC) (Fig.1). L’obiettivo del SAC è CDC20 (25). Quindi, abbiamo dedotto che in HCC, la sovraespressione di CDC20 porta all’assenza di SAC e le cellule rapidamente diventano aneuploidi.

CDC20 è sovraespresso in HCC

La PCR quantitativa in tempo reale è stata utilizzata per esaminare il livello di trascrizione di CDC20 in tre linee cellulari HCC (HepG2, SMMC-7721 e Huh7) e una linea cellulare epatica normale (LO2). CDC20 mRNA levelwas superiore in tutte le tre linee cellulari HCC rispetto a quello nella linea normalcell (Fig. 2).

Al fine di determinare se la sovraregolazione diCDC20 nelle linee cellulari HCC è simile nei pazienti HCC, abbiamo eseguito una PCR in tempo reale quantitativa su 16 coppie di tessuti epatici HCC e adiacenti corrispondenti. Come mostrato in Fig.3A, CDC20 è risultato essere differenzialmente sovraespresso in 14 di tutti i campioni HCC primari umani esaminati rispetto ai campioni non cancerosi degli stessi pazienti. Inoltre, il rapporto tumore / non tumore (T/NT) dell’espressione di mRNA CDC20 era almeno >2 volte in tutti questi 14 campioni sovraregolati e il rapporto più alto era addirittura fino a circa 40 volte. Il livello proteico di CDC20 è stato confermato in tuttoi 16 campioni di tessuto accoppiati mediante analisi western blot. Immagine Il software J1.47v è stato utilizzato per quantizzare il livello di grigio di ogni banda e calcolare il rapporto CDC20 T / NT di ciascun paziente normalizzandosi con la tubulina. I risultati hanno rivelato che tutti i campioni di HCC esaminati hanno mostrato un livello di espressione superiore della proteina CDC20 ad eccezione del campione 1 e del campione 4, che era coerente con il livello di mRNA (Fig. 3 TER). Questi risultati hanno indicato CHECDC20 era comunemente sovraregolato nei tessuti HCC o nelle linee cellulari.

Immunoistochimica colorazione di cdc20proteina

Immunoistochimica (IHC) è stata eseguita per analyzethe espressione proteica e localizzazione di CDC20 in 132paraffin-embedded archiviato HCC campioni di tessuto, tra cui 14 casesof ben differenziato, 78 casi di moderata differenziato e 40cases di tumori differenziati poveri. La proteina CDC20 è stata sovraregolata (punteggio H ≥200) in 90 (68,18%) di 132 tessuti HCC. Come mostrato inFig. 4A, alti livelli di CDC20 erano presenti nelle lesioni HCC primarie e la colorazione positiva principalmente localizzata nel citoplasma e nei nuclei. Al contrario, CDC20 eranonegativamente o debolmente macchiato nei corrispondenti tessuti non tumorali. Confrontando quantitativamente i punteggi di colorazione CDC20 tra 132 HCC archiviati e tessuti non tumorali adiacenti( principalmente includendo epatocirrosi ed epatite), i punteggi di colorazione CDC20 sono aumentati significativamente nei campioni di HCC rispetto ai campioni peritumorali (Fig. 4 TER). Inoltre, i punteggi di colorazione CDC20 sono stati significativamente aumentati insieme ala progressione della differenziazione istologica tumorale da tessuti ben differenziati (Fig.5).

Correlazione tra aumento dell’espressione di CDC20 e parametri clinicopatologici di HCC

È stata ulteriormente analizzata la relazione tra l’espressione della proteina CDC20 e le caratteristiche clinicopatoligiche di 132 pazienti HCC. Come riassunto nella Tabella I, l’espressione CDC20 erasignificativamente associata al genere (P=0,013), alla differenza tumorale (P=0,000), allo stadio TNM (P=0,012), P53 e Ki-67espressione (P=0,023 e P=0,007, rispettivamente). Tuttavia, l’associazione nostatistically significativa è stata trovata fra l’alta CDC20expression ed altre caratteristiche clinicopatological includingage, dimensione del tumore, infezione di HBV, livello di AFP del siero,cirrosi epatica, invasione vascolare e metastasi epatiche intra/extra. Spearmancorrelation analisi ha rivelato che l’alta espressione di CDC20 wasclosely correlati con il sesso (R=0.215, P=0,013), più poveri tumordifferentiation (R=0.421, P<0.001), avanzata stadiazione TNM(R=0.218, P=0,012), un più elevato livello di espressione di p53 (R=0.212,P=0.014) e Ki-67 (R=0.235, P=0.007) (Tabella II). Nel loro insieme, questi risultati hanno indicato che il CDC20 era altamente espresso nei tessuti HCC e la sua espressione era strettamente correlata alla differenziazione e alla progressione dell’HCC.

Soppressione dell’espressione di CDC20 da parte dello Spirna

La PCR quantitativa in tempo reale ha rivelato la soppressione del livello trascrizionale del 90% di CDC20 a 48 ore dopo la trasfezione con siCDC20, confrontando con o cellstransfected con controllo negativo siRNA (Fig. 6A) (P < 0.0001). L’analisi western blot ha anche mostrato un’evidente soppressione del livello di proteina CDC20 a 48 h dopo trasfezione con siCDC20 (Fig. 6 TER). L’espressione alterata della proteina inibitore della chinasi 1A (p21) dipendente dalla ciclina è stata esaminata anche dall’analisi western blot, e i risultati hanno mostrato che il livello di proteine P21 era notevolmente sovraregolato a causa della soppressione del CDC20 (Fig. 6 TER).

Effetto della soppressione del CDC20 sulla proliferazione cellulare e sul ciclo cellulare

Il test di proliferazione cellulare ha rivelato che la crescita cellulare delle cellule trasfettate da siRNA CDC20 era notevolmente inibita rispetto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo negativo(Fig. 6 QUATER). Ci si aspettava che l’inibizione della proliferazione cellulare da parte di siCDC20 fosse accompagnata da un aumento della metafase del ciclo cellulare. Con il test di citometria a flusso, è stato osservato un maggior numero di cellule nella fase G2/M nelle cellule trasformate SICDC20 rispetto alle cellule trasfettate con siRNA di controllo negativo (Fig. 6D). Thesedata ha indicato che la soppressione di CDC20 ha inibito la crescita delle cellule byinducing l’arresto di fase di G2 / M.

Discussione

Attraverso l’analisi bioinformatica di un microarraydataset dal database GEO, abbiamo identificato CDC20 che era il majornode nelle reti di interazione molecolare HCC, era correlato con il checkpoint di assemblaggio del mandrino (SAC) nel ciclo cellulare. Durante la tumorigenesi, si è ritenuto che i difetti o l’interruzione del punto di controllo dell’assemblaggio del mandrino fossero responsabili dell’aumento del tasso di impoverimento (26). Mondalet al hanno riferito che CDC20 è sovraespresso nei tumori primaryhead e collo e diverse linee cellulari di carcinoma a cellule squamose orali (OSCC). L’alto livello di espressione di CDC20 nelle cellule OSCC è associato alla promozione prematura delle anafasi, portando ad anomalie mitotiche (27). Gli studi hannoanche rivelato che l’alta espressione di CDC20 è rilevata nel carcinoma a cellule quamose orali e nei tessuti del cancro del colon-retto e la sua sovraespressione può prevedere una prognosi infausta per i pazienti (28,29).

CDC20 è anche necessario per le cellule anafase tardive per uscire dalla mitosi (30). Il TargetingCDC20 si traduce nel blocco dell’uscita dalla mitosi, che può essere una strategia terapeutica migliore per uccidere le cellule tumorali in modo più efficace rispetto ai farmaci che perturbano il fuso (31). Wang et al hanno riferito che il CDC20, che può funzionare come oncoproteina per promuovere la progressione e lo sviluppo dei cancri umani, rappresenta un obiettivo terapeutico promettente (32). Sebbene il ruolo di CDC20 nella tumorigenesi e nella prognosi di parecchi humancancers sia stato profondamente ricercato e confermato, studi limitati hanno studiato la funzione potenziale di CDC20 nell’iniziazione e nella progressione del carcinoma epatocellulare.

In questo studio, abbiamo valutato il livello di espressione diCDC20 in 16 tessuti HCC congelati freschi accoppiati e corrispondenti campioni non tumorali. I risultati hanno indicato che l’mRNA medio e il livello di proteine di CDC20 nei tessuti HCC erano molto più alti rispetto ai tessuti non tumorali corrispondenti. Immunoistochimica è stata utilizzata perinvestigando la posizione subcellulare di CDC20 e la suarapporto con parametri patologici clinici di HCC patients.By usando il test χ2, abbiamo scoperto che un livello più elevato di proteinespressione CDC20 era associato al genere,alla differenziazione tumorale, allo stadio TNM, all’espressione P53 e Ki-67. Per studiare la funzione potenzialmente biologica e il meccanismo molecolare di CDC20 in HCC, abbiamo progettato un RNA interferente a doppio filamento, piccolo (siRNA) che mira a CDC20 per interferire con il suo livello di espressione nella linea cellulare HepG2. Con il test di proliferazione cellulare e il test FACS, abbiamo scoperto che le cellule trasfette con oligonucleotidi siCDC20 hanno mostrato una velocità di crescita ridotta e una maggiore proporzione di cellule nello stadio G2/M.

Lo specifico knockdown di CDC20 da parte di siRNA ha mostrato un effetto soppresso contro la proliferazione delle cellule del cancro del fegato invitro, il che ha indicato che la sovraespressione di CDC20 potrebbe accelerare la proliferazione cellulare e promuovere l’iniziazione tumorale e la progressione dell’HCC. Le cellule tumorali del fegato con l’espressione CDC20 soppressa sono state indotte ad accumulare inG2 / M-fase, che può essere responsabile dell’inibizione della crescita cellulare. L’inibitore della chinasi ciclina-dipendente 1A (p21) che è noto per partecipare al checkpoint G2/M (33), è stato dimostrato essere sovraregolato quando l’espressione CDC20 è stata specificamente soppressa nelle cellule del cancro del fegato. P21 può inibire l’attività di CDK che conduce a theaccumulation di proteina soppressore tumorale di Rb non fosforilata, whichinhibits l’attivazione trascrizionale di E2F e subsequentlyprevents l’entrata delle celle nella fase di S del ciclo cellulare (34).

In conclusione, questo è il primo studio volto a esaminare l’espressione del CDC20 nei tessuti e nelle linee cellulari dell’HCC, fornendo un nuovo focus sul fatto che il CDC20 può essere un indicatore clinicamente rilevante e un bersaglio terapeutico promettente dell’HCC. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi incentrati sui meccanismi molecolari del CDC20 nell’avvio e nella progressione dell’HCC e sulla ricerca sul significato prognostico del CDC20.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano i loro colleghi dell’Istituto di Biotecnologie dell’Accademia di Medicina Militare per il loro supporto tecnico.

	Parkin DM: Global cancer statistics in theyear 2000. Lancet Oncol. 2:533–543. 2001.PubMed/NCBI
	El-Serag HB and Rudolph KL: Hepatocellularcarcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis.Gastroenterology. 132:2557–2576. 2007. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, WardE e Forman D: Global cancer statistics. CA Cancro J Clin.61:69–90. 2011. Visualizza Articolo : Google Scholar
	Severi T, van Malenstein H, Verslype C andvan Pelt MC: Tumore iniziazione e progressione in hepatocellularcarcinoma: fattori di rischio, la classificazione e bersagli terapeutici.Acta Pharmacol Sin. 31:1409–1420. 2010. Visualizza articolo: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Michielsen P e Ho E: Carcinoma epatocellulare a banda di epatite virale. Acta Gastroenterol Belg. 74:4–8.2011.
	McGivern DR e Lemon SM: meccanismi specifici del virus della carcinogenesi nel fegato associato al virus dell’epatite C. cancro. Oncogene. 30:1969–1983. 2011. Per maggiori informazioni, consulta la nostra informativa sulla privacy e sui cookie, consulta la nostra informativa sul trattamento dei dati personali.: Un giro sulle montagne russe con i ciclini mitotici. Semin Cell Dev Biol. 16:335–342. 2005.Visualizza Articolo : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Weinstein J, Jacobsen FW, Hsu-Chen J, Wu Tand Baum LG: UN romanzo di proteine di mammiferi, p55CDC, presente in dividingcells è associato con attività di chinasi di proteina e ha homologyto il Saccharomyces cerevisiae ciclo di divisione cellulare proteine Cdc20and Cdc4. Biol cellulare Mol. 14:3350–3363. 1994.
	Peters JM: Biologia cellulare: il checkpointbrake sollevato. Natura. 446:868–869. 2007. Visualizza articolo: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Fang G, Yu H e Kirschner MW: Directbinding dei membri della famiglia di proteine CDC20 attiva il complesso di promozione delle fasi in mitosi e G1. Cella Mol. 2:163–171.1998. Il nostro sito utilizza cookie tecnici e di terze parti per migliorare la tua esperienza di navigazione.: Degradationof RAP80 umano è il ciclo cellulare regolato da Cdc20 e Cdh1 ubiquitinligases. Mol Cancer Res. 10:615-625. 2012. Visualizza Articolo : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kidokoro T, Tanikawa C, Furukawa Y,Katagiri T, Nakamura Y e Matsuda K: CDC20, un potenziale cancertherapeutic di destinazione, è regolato negativamente da p53. Oncogene.27:1562–1571. 2008. Per maggiori informazioni, consulta la nostra informativa sulla privacy e sui cookie, consulta la nostra informativa sulla privacy.: Aumento dell’espressione CDC20 è associata alla differenziazione e alla progressione del duttaleadenocarcinoma pancreatico. Hematol Oncol.5:152012. Visualizza Articolo : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kim JM, Sohn HY, Yoon SY, et al:l’Identificazione del cancro gastrico geni correlati utilizzando un cDNAmicroarray contenente romanzo espresso sequence tags espresso ingastric cellule tumorali. Clin Cancer Res. 11:473-482. 2005.PubMed / NCBI
	Espinosa AM, Alfaro A, Roman-Basaure E, etal: La mitosi è una fonte di potenziali marcatori per lo screening e la sopravvivenza e gli obiettivi terapeutici nel cancro cervicale. PLoS Uno.8:.PubMed/NCBI
	Ouellet V, Guyot MC, Le Page C, et al:Analisi dell’array tissutale di espressione microarray candidatesidentifica i marcatori associati al grado tumorale e all’esito del cancro ovarico epiteliale inserous. Int J Cancro. 119:599–607. 2006.Visualizza articolo: Google Scholar
	Roessler S, Jia HL, Budhu A, et al: Aunique metastasis gene signature enables prediction of tumorrelapse in early-stage hepatocellular carcinoma patients. CancerRes. 70:10202–10212. 2010. Visualizza l’articolo:Google Scholar
	Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, et al: Esplorazione, normalizzazione e sintesi dei dati di livello della sonda array ad alta densitàoligonucleotide. Biostatistica. 4:249–264.2003. Visualizza l’articolo: Google Scholar
	Dai M, Wang P, Boyd AD, et al: Evolvinggene/transcript definitions significantly alter the interpretationof GeneChip data. Acidi nucleici Res. 33:e1752005. Visualizza l’articolo: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Tusher VG, Tibshirani R e Chu G:Analisi di significatività dei microarray applicati alla risposta di ionizzazione. Proc Natl Acad Sci Stati Uniti d’America. 98:5116–5121. 2001.Visualizza articolo: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Huang ZX, Tian HY, Hu ZF, Zhou YB, Zhao Jand Yao KT: GenCLiP: un software per la creazione di cluster di gene listsby letteratura profilatura e la costruzione di gene co-occurrencenetworks relative per parole chiave personalizzate. BMC Bioinformatica. 9:3082008.Vedi articolo: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Adhikary S e Eilers M: Transcriptionalregulation e trasformazione da proteine Myc. Nat Rev Mol CellBiol. 6:635–645. 2005. Viewarticolo : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Detre S, Saclani Jotti G and Dowsett M: A’quickscore’ method for immunohistochemical semiquantitation:validation for oestrogen receptor in breast carcinomas. J ClinPathol. 48:876–878. 1995.
	Früh MPM: EGFR IHC score for selection ofcetuximab treatment: Ready for clinical practice? Transl LungCancer Res. 1:145–146. 2012.
	Hwang LH, Lau LF, Smith DL, et al: Buddingyeast Cdc20: un obiettivo del punto di controllo del mandrino. Scienza.279:1041–1044. 1998. Il sito utilizza cookie tecnici e di terze parti per migliorare la tua esperienza di navigazione e per migliorare la tua esperienza di navigazione. Nat RevCancer. 5:773–785. 2005. ViewArticle: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Mondal G, Sengupta S, Panda CK, Gollin SM,Saunders WS e Roychoudhury S: Sovraespressione di Cdc20 porta toimpairment del spindle assembly checkpoint e aneuploidizationin il cancro orale. Carcinogenesi. 28:81–92. 2007. Visualizza articolo: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Moura IM, Delgado ML, Silva PM, et al:L’alta espressione di CDC20 è associata a prognosi infausta nel carcinoma a cellule quamose. J Pathol orale Med. 43:225–231. 2013.Visualizza Articolo : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wu WJ, Hu KS, Wang DS, et al: CDC20overexpression prevede una prognosi per i pazienti withcolorectal cancro. J Transl Med. 11:1422013. Visualizza Articolo : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yeong FM, Lim HH, Padmashree CG e SuranaU: l’Uscita dalla mitosi nel lievito gemmante: bifasica inattivazione di theCdc28-Clb2 mitotica chinasi e il ruolo di Cdc20. Cella Mol.5:501–511. 2000. Visualizza l’articolo: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Huang HC, Shi J, Orth JD e Mitchison TJ:La prova che l’uscita mitotica è un obiettivo terapeutico migliore per il cancro rispetto all’assemblaggio del mandrino. Cellule tumorali. 16:347–358. 2009. Visualizza articolo: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Wang Z, Wan L, Zhong J, et al: Cdc20: un potenziale nuovo obiettivo terapeutico per il trattamento del cancro. Curr PharmDes. 19:3210–3214. 2013. Visualizza articolo: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Bunz F, Dutriaux A, Lengauer C, et al:Requisito per p53 e p21 per sostenere l’arresto di G2 dopo il danno al DNA.Scienza. 282:1497–1501. 1998. Visualizza l’articolo: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Wells J, Boyd KE, Fry CJ, Bartley SM Efarnham PJ: specificità genica target di E2F e proteine tascabili membri della famiglia in cellule viventi. Biol cellulare Mol. 20:5797–5807. 2000.Visualizza articolo : Google Scholar