Abstract

È stato sviluppato un metodo diretto e altamente specifico chemiluminescente enzyme-linked immunosorbent assay (CL-ELISA) per il monitoraggio del cloramfenicolo (CAP) nei cosmetici. L’anticorpo anti-cloramfenicolo (mAb) adottato in questo lavoro per il test immunologico diretto potrebbe legarsi specificamente al CAP, con reattività crociata trascurabile (CR) (inferiore allo 0,01%) con la maggior parte degli analoghi CAP, incluso il tiamfenicolo (TAP) e il florfenicolo (FF) strutturalmente correlati. Il limite di rilevamento (LOD), misurato da IC10, era 0,0021 ng mL−1. Il campo di rilevamento (IC20-IC80) era compreso tra 0,00979 e 0,12026 ng mL−1. Nei campioni di cosmetici a spillo, i recuperi medi variavano dall ‘82,7% al 99,6%, con variazioni infragiornaliere e infragiornaliere inferiori rispettivamente al 9,8 e all’ 8,2%. Inoltre, con l’aiuto di MAB anti-CAP marcato con HRP, il metodo potrebbe essere elaborato in modalità di immunoreazione diretta veloce. Questo metodo CL-ELISA potrebbe essere applicato per la rilevazione specifica, rapida, semiquantitativa e quantitativa del CAPPUCCIO nei cosmetici, facilitando il controllo di qualità preciso della contaminazione del CAPPUCCIO.

1. Introduzione

Cloramfenicolo (CAP) è un membro della famiglia amphenicol di agenti antibatterici, e sono stati prodotti da streptococco venezuelano (struttura mostrato in Figura 1). Il cloramfenicolo viene solitamente eseguito come antibiotico ad ampio spettro con un’efficace attività antimicrobica. Può essere solitamente contro una varietà diffusa di batteri Gram-positivi e Gram-negativi, compresi gli organismi anaerobici . A causa dell’elevata attività, il cloramfenicolo è ampiamente applicato nelle industrie del bestiame, dell’acquicoltura e dei cosmetici per la prevenzione e il trattamento delle infezioni batteriche. In pubblicazioni recenti, il cloramfenicolo è stato segnalato per essere utilizzato per il trattamento di epifolliculite, acne e altre condizioni della pelle. Il cloramfenicolo è stato anche ampiamente adottato nei cosmetici come antisettico per inibire la crescita di microrganismi .

Figura 1

Tuttavia, recenti indagini hanno dimostrato che gli antibiotici amphenicol mostravano potenziali effetti avversi per la salute umana . Pertanto, le applicazioni del cloramfenicolo sono vietate in molti paesi, compresi i membri dell’UE, gli Stati Uniti e la Cina . Sebbene esistano regolamenti ufficiali per questi antibiotici, il cloramfenicolo viene ancora aggiunto illegalmente ai cosmetici, grazie al suo basso costo e all’eccellente effetto antibatterico. Al fine di garantire la sicurezza dei cosmetici e mantenere la salute umana, è emergente sviluppare metodi sensibili, affidabili e disponibili per il rilevamento del cloramfenicolo a livelli di tracciamento nei campioni di cosmetici.

Sono stati riportati numerosi metodi analitici per la CAP e la relativa rilevazione di antibiotici, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) , la gascromatografia (GC) e la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) . Tuttavia, questi metodi richiedono principalmente strumenti costosi, complicate procedure di pretrattamento e personale ben addestrato e non erano adatti per lo screening rapido di un gran numero di campioni. Sono stati adottati saggi immunologici basati principalmente sul riconoscimento specifico anticorpo-antigene per lo screening rapido e ad alta produttività degli analiti bersaglio. Substrato chemiluminescente con carattere ad alta sensibilità potrebbe essere impiegato in una piattaforma diretta chemiluminescente enzyme-linked immunosorbent assay (CL-ELISA). Rispetto ai protocolli colorimetrici convenzionali, la sensibilità dei saggi immunologici potrebbe essere migliorata di almeno 2 ~ 3 volte con chemiluminescente come substrato.

Le precedenti letterature sul rilevamento immunologico di CAP non possono distinguere CAP dai suoi analoghi della famiglia amphenicol (Figura 1), inclusi tiamfenicolo (TAP) e florfenicolo (FF), a causa degli anticorpi specifici ad alta ampiezza . In queste ricerche, è difficile determinare se il TAPPO di contaminazione, i suoi analoghi o la somma di essi quando un risultato positivo. In questa ricerca, abbiamo impiegato un anticorpo monoclonale anti-CAP (mAb) ad alta specifica che può legarsi alla specificità del CAP e ai valori di CR trascurabili per la maggior parte degli analoghi testati. Sulla base di questo stesso mAb, è stato sviluppato un metodo CL-ELISA altamente specifico e diretto per la determinazione delle tracce di CAP nei cosmetici. Questo protocollo sviluppato non necessita di una complessa reazione di coniugazione indiretta con anticorpo secondario marcato con HRP. Con substrato chemiluminescente, la sensibilità potrebbe essere migliorata in modo significativo (diagramma schematico mostrato in Figura 2). Con l’uso di anti-CAP MAB marcato con HRP, il test è stato condotto in modalità di immunoreazione diretta veloce senza procedure di immunoreazione complesse. Questo metodo CL-ELISA può essere applicato per la rilevazione specifica, rapida, semiquantitativa e quantitativa del CAPPUCCIO nei cosmetici e questo lavoro contribuirà al controllo di qualità e alla regolazione del CAPPUCCIO.

Figura 2

2. Materiali e metodi

2.1. Prodotti chimici e reagenti

Gli standard cloramfenicolo (CAP), ciprofloxacina (CIP), florfenicolo, (FF), penicillina (PEN), ractopamina (RAC), salbutamolo (SAL), sulfadiazina (SUL) e tiamfenicolo (TAP) sono stati acquistati da Sigma Aldrich (99% purity, St. Louis, MO, USA). L’antigene coniugato CAP e l’anticorpo CAP marcato con HRP sono stati ottenuti da ZeYang Co. (Pechino, Cina). La soluzione di substrato di chemiluminescenza supersignale è stata acquistata da Thermo Fisher (USA). Il sistema di sintesi Milli-Q è stato ottenuto da Millipore (Bedford, MA, USA) per la purificazione dell’acqua. Altri reagenti (grado analitico) sono stati acquistati da Beijing Reagent Corp. (Pechino, Cina).

2.2. Attrezzature e strumentazione

Piastre di microtitolazione in polistirene opaco a 96 pozzetti bianco Costar (Costar Inc ., Milpitas, CA, USA) sono stati utilizzati in questo lavoro. Il lettore di micropiastre SpectraMax M5 è stato ottenuto da dispositivi molecolari (CA, USA). La centrifuga MIKRO 22R è stata ottenuta da Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Germania).

2.3. Tamponi e soluzioni

Per questo saggio CL-ELISA sviluppato, sono stati preparati diversi tamponi e soluzioni per il saggio immunologico.

Soluzione salina tampone fosfato (PBS, 0,01 M, pH 7,4): 8,0 g di NaCl, 2,9 g di Na2HPO4, 0,2 g di KH2PO4 e 0,2 g di KCl sono stati sciolti in 1 L di acqua deionizzata.

Tampone di blocco (pH 7.4): 0.5% caseina in 0.01 M PBS.

Tampone di rivestimento (pH 9,6): 1,59 g di Na2CO3 e 2,93 g di NaHCO3 sono stati sciolti in 1 L di acqua deionizzata.

Tampone di diluizione enzimatica (pH 7,4): 5% siero bovino fetale in 0,01 M PBS.

Buffer di lavaggio( PBST): 0,01% Tween-20 in 0,01 M PBS.

2.4. Procedura ELISA chemiluminescente competitiva (CL-ELISA)

Le piastre di microtitolazione in polistirene opaco bianco Costar a 96 pozzetti sono state adottate per la reazione immunologica. 100 µL di antigene coniugato con CAPPUCCIO sono stati disciolti nel tampone di rivestimento ad una concentrazione finale a 0,00042 ng mL-1 che è stato aggiunto e incubato a 4°C per 20 h per il rivestimento. Dopo il lavaggio con tampone di lavaggio per tre volte, il tampone di blocco (150 µL per pozzetto) è stato aggiunto a ciascun pozzetto e incubato per occupare i siti attivi in eccesso a 37°C per 1,5 h. Le piastre rivestite sono state conservate a 4°C prima dell’uso.

Per l’analisi del CAPPUCCIO, le piastre di microtitolazione rivestite sono state precondizionate a temperatura ambiente per 30 min. Quindi, 30 µL di campioni elaborati o CAP standard e 70 µL di anticorpo anti-CAP marcato con HRP (2,46 ng mL-1) diluito dal tampone di diluizione enzimatica sono stati aggiunti a turno a ciascun pozzetto. Le piastre sono state incubate a 37°C per 30 min per una reazione competitiva diretta. Dopo aver lavato la piastra con tampone di lavaggio per cinque volte, è stata aggiunta una soluzione di substrato di chemiluminescenza supersignale (100 µL/pozzetto) e l’intensità di chemiluminescenza di ciascun pozzetto è stata misurata con un lettore di micropiastre SpectraMax M5.

2.5. Curva standard

Sono stati testati dieci diversi livelli di concentrazione per la valutazione delle curve di taratura. La concentrazione più alta era a 1000 ng mL-1 e le seguenti concentrazioni erano diluite in serie di un terzo della precedente. Ogni concentrazione è stata eseguita in tre volte secondo il protocollo CL-ELISA.

B / B0 è definito per il rapporto di chemiluminescenza dei risultati. Qui, B sta per l’intensità di chemiluminescenza di diversa concentrazione standard CAP, e B0 sta per intensità di chemiluminescenza senza standard CAP in ogni test.

Le curve standard sono state valutate tracciando B/B0 a diverse concentrazioni standard di CAP e adattando i dati alla seguente equazione logistica a quattro parametri usando Origin (versione 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA):In questa equazione, A sta per l’asintoto superiore (rapporto di chemiluminescenza B / B0 senza standard CAP). B è la pendenza della curva nel punto di flesso. C, che rappresenta il 50% dell’assorbanza massima, è il valore X nel punto di flesso. E D è l’asintoto inferiore (segnale di fondo).

2.6. Preparazione del campione per l’analisi CL-ELISA

I campioni cosmetici (2,00 g ± 0,02 g) sono stati pesati con precisione e trasferiti in provette da centrifuga in polipropilene da 50 ml. Quindi, 20 mL di PBS sono stati aggiunti e vortexati per 30 s, e quindi ultra-sonicazione per 3 min per l’estrazione del CAPPUCCIO. Ogni campione è stato centrifugato a 12000 g per 10 min a 4°C e il surnatante è stato raccolto e filtrato attraverso una membrana da 0,22 µm. Trenta aliquote di microlitro del surnatante di ciascun campione sono state aggiunte a una piastra rivestita da 96 pozzetti per l’analisi secondo la procedura CL-ELISA sviluppata.

2.7. Precisione e precisione

I campioni di cosmetici per lozione primer negativi sono stati precedentemente confermati dalle analisi UPLC-MS / MS. Poi ogni campione è stato a spillo con CAP standard a tre diverse concentrazioni di 5, 20, e 100 ng L-1. L’analisi è stata elaborata secondo il protocollo CL-ELISA sviluppato con cinque repliche ciascuna (n = 5). Le concentrazioni dei campioni sono state calcolate in base alla curva di calibrazione e l’accuratezza e la precisione sono state valutate sulla base dei recuperi di tutti i campioni.

3. Risultati e discussione

3.1. Specificità del test

La specificità del metodo è stata valutata valutando l’entità della cross-reattività (CR) con composti strutturalmente correlati di CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL e TAP. I valori di CR sono stati valutati con la seguente equazione:In questa equazione, IC50 è la metà massima concentrazione inibitoria di una sostanza. I risultati della specificità della mAb anti-CAP sono stati mostrati nella Tabella 1. Dai risultati, sono stati ottenuti valori di CR trascurabili (meno dello 0,01%) per tutti gli analoghi studiati in questa ricerca, inclusi il TAP e il FF più correlati alla struttura. Si può concludere che questo saggio CL-ELISA sviluppato potrebbe essere applicato per il rilevamento specifico del CAPPUCCIO.

Analogue IC50 (ng mL−1) CR (100%) CAP 0.034 100 TAP >1,000 <0.01 FF >1,000 <0.01 SAL >1,000 <0.01 RAC >1,000 <0.01 SUL >1,000 <0.01 CIP >1,000 <0.01 PEN >1,000 <0.01

Tabella 1

CL50 e cross-reattività (CR) valore di CAP farmaceutici.

3.2. Ottimizzazione della procedura CL-ELISA

Il rapporto antigene-anticorpo in un sistema di reazione competitivo influenza significativamente l’immunoreazione. In questo protocollo CL-ELISA, il rapporto antigene-anticorpo è stato valutato e ottimizzato. Rapporti antigene-anticorpo di 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, e 30: 70 sono stati indagati. I risultati sono stati ottimizzati secondo IC50 e RLUmax (maximum relative light units) e mostrati nella Tabella 2. Il valore IC50 è aumentato significativamente con l’aumento del rapporto anticorpale. Quando il rapporto antigene-anticorpo era 70: 30, è stato ottenuto il risultato più sensibile con il valore IC50 più basso. Inoltre, un’alta percentuale di anticorpi ha portato ad un alto valore di RLUmax. Tuttavia, per i rapporti tra antigene e anticorpo testati, tutti i valori di RLU erano adatti per la rilevazione di CAP. A causa dell’elevata sensibilità del substrato chemiluminescente, non vi era alcuna differenza apparente del valore RLUmax. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3.3. Sensibilità

IC50, LOD (misurato da IC10) e il campo di rilevamento (IC20−IC80) sono stati ottenuti dalla curva di calibrazione sigmoidale per valutare la sensibilità del protocollo CL-ELISA proposto (Figura 3). In questa ricerca, LOD era 0.0021 ng mL-1 mentre il valore IC50 era 0.016 ng mL-1 per CAP. Il campo di rilevamento di questo metodo era 0,00979-0,12026 ng mL-1. Rispetto ai saggi immunologici stabiliti, questo metodo ha mostrato una maggiore sensibilità e un LOD inferiore per CAP .

Figura 3

3.4. Accuratezza e precisione

Per la precisione e la precisione di indagine, recuperi di CAP in campioni fortificati sono stati calcolati in primo luogo. E l’accuratezza e la precisione sono state valutate con cinque repliche ciascuna in tre giorni di convalida. A tre livelli fortificati di 5, 20 e 100 ng L−1, i recuperi medi per CAP nei campioni di cosmetici per lozioni a base di primer a spillo variavano dall ‘ 82,7% al 99,6%. Le variazioni infragiornaliere e infragiornaliere sono state rispettivamente inferiori al 9,8% e all ‘ 8,2% (i risultati sono stati riportati nella Tabella 3).

4. Conclusioni

In questa ricerca è stato sviluppato un nuovo e altamente sensibile metodo CL-ELISA per il rilevamento del cappuccio nei cosmetici. Il mAb utilizzato nel test ha mostrato un’elevata specificità al CAPPUCCIO con valori di CR trascurabili ai suoi analoghi, specialmente per la maggior parte dei TAP e FF relativi alla struttura. Sulla base di questo stesso mAb, il metodo CL-ELISA proposto potrebbe essere applicato per la rilevazione di CAP specificamente invece di miscele di CAP e altri analoghi. Questo è il primo rapporto di una CL-ELISA per la determinazione del TAPPO in cosmetica. Il metodo LOD era 0,0021 ng mL-1, IC50 era 0,016 ng mL-1 e il campo di rilevamento era 0,00979−0,12026 ng mL−1. Nei campioni di cosmetici a spillo, i recuperi medi variavano dall ‘82,7% al 99,6%, con la variazione infragiornaliera e infragiornaliera inferiore rispettivamente al 9,8% e all’ 8,2%. Il dosaggio offre i vantaggi di elevata specificità, semplicità, tempi di analisi rapidi e convenienza. Per quanto riguarda la sua sensibilità e specificità, il metodo CL-ELISA sviluppato è superiore alla maggior parte dei saggi immunologici riportati per il rilevamento del CAPPUCCIO. Si può concludere che questo metodo CL-ELISA sviluppato potrebbe essere applicato per la rilevazione specifica, rapida, semiquantitativa e quantitativa del CAPPUCCIO nei cosmetici.

Disponibilità dei dati

I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare LetPub (www.letpub.com) per fornire assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma chiave nazionale R&D della Cina (n. 2017YFE0110800), dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31871718) e dall’azione di ricerca e innovazione dell’UE Horizon 2020 (n. 727864-EU-China-Safe).