Astratto
La cervicite è una malattia sessualmente trasmessa comune. Negli ultimi anni, l’abuso di antibiotici nel trattamento della cervicite provoca l’emergere di batteri resistenti agli antibiotici; sono necessarie strategie alternative da sviluppare. In questa ricerca, abbiamo studiato gli effetti del Gel vaginale Feilin (FVG), una formula a base di erbe cinese, sul trattamento della cervicite. Due modelli di cervicite sono stati ottimizzati utilizzando il topo BALB/c; un modello in vitro è stato stabilito nelle cellule HeLa. Nel modello di cervicite indotta da Chlamydia trachomatis, è stato possibile osservare l’alto livello di carichi batterici, l’infiammazione nei tessuti e le citochine nel siero. Con la somministrazione di FVG, le cariche batteriche nel muco cervicale e nel tessuto cervicale potrebbero essere significativamente inibite in modi dose-dipendenti. La lesione patologica della cervice e della vagina, così come i livelli di IL-2, IL-17 e MCP-1 nel siero, potrebbero essere mitigati dal FVG. FVG ha ridotto il numero di inclusione indotta da C. trachomatis nelle cellule HeLa. Inoltre, il danno istologico nel modello di cervicite indotta da Escherichia coli e Staphylococcus aureus potrebbe essere ridotto dal FVG. Questi risultati suggeriscono che il FVG è in grado di trattare la cervicite attraverso l’inibizione dei patogeni e la regolazione delle risposte immunitarie dell’ospite. FVG può contribuire come agente alternativo per il trattamento della cervicite.
1. Introduzione
La cervicite è una comune malattia a trasmissione sessuale con una condizione infiammatoria della cervice uterina . L’infezione della cervice inizia dal tratto genitale inferiore (vagina) e poi si sviluppa nella malattia infiammatoria pelvica con infezione ascendente del tratto genitale superiore (utero e tube di Falloppio) e cavità peritoneale . La cervicite si è verificata frequentemente come infezione asintomatica. Lo scarico mucopurulento cervicale o vaginale anormale e l’ectopia cervicale possono essere i segni e i sintomi della cervicite in alcuni pazienti . Tuttavia, la cervicite grave può portare a ulteriori infertilità e gravidanza ectopica. La cervicite è considerata associata alla trasmissione dell’infezione da HIV e allo sviluppo di carcinomi cervicali .
La cervicite può essere indotta da vari agenti patogeni come Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrea, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas, virus Herpes simplex, citomegalovirus e adenovirus . C. trachomatis infezione è segnalato per essere la causa più frequente di cervicite. Più del 10% delle donne con cervicite viene diagnosticato come infetto da C. trachomatis e il numero di queste infezioni continua ad aumentare negli ultimi decenni . C. trachomatis è un batterio intracellulare obbligato gram-negativo. Due forme di C. trachomatis possono essere trovate nel suo ciclo di sviluppo. L’attaccamento di corpi elementari (EBs) alle cellule ospiti media l’invasione di C. trachomatis. All’interno delle cellule ospiti, C. trachomatis forma i corpi reticolati (RBs) e poi RBS replicano all’interno del vacuolo citoplasmatico e infine formano l’inclusione .
La clamidia può persistere a lungo nella cervice uterina senza sintomi. L’infezione può risolversi spontaneamente senza trattamento o può causare cervicite. La clearance di C. trachomatis richiede le risposte dell’immunità Th1 . Tuttavia, le risposte dell’immunità adattativa possono avere una natura a doppio taglio e causare danni ai tessuti. La gestione dell’infezione da C. trachomatis si basa sul trattamento dei pazienti e dei loro partner sessuali con macrolidi. L’abuso di antibiotici e falsi positivi può contribuire alla comparsa di organismi resistenti agli antibiotici. I batteri resistenti agli antibiotici, d’altra parte, portano al fallimento del trattamento . Dopo il trattamento con l’antibiotico, il 10% -20% dei pazienti soffrirà di reinfezione entro un anno, il che può essere dovuto all’assenza di immunità protettiva contro la clamidia . Considerando queste condizioni, è necessario sviluppare strategie alternative.
La medicina tradizionale cinese (TCM) ha una lunga storia nel trattamento delle malattie ginecologiche . Il gel vaginale di Feilin (FVG) è sviluppato da una formula clinicamente usata della medicina cinese che è usata per trattare la cervicite mucopurulenta. FVG è costituito dai seguenti farmaci a base di erbe: La radice di Gentianae et rhizoma, Stemonae radix, Fraxini cortex, Paeoniae radix rubra, Dictamni cortex e Glycyrrhizae radix et rhizome. Secondo la teoria di TCM: FVG può essere usato per trattare l’accumulo di umidità e materiali tossici indotti perdite vaginali anomale, come leucorrea profusa, fetida e giallastra, prurito e dolore intorno ai genitali esterni . L’estrazione, la preparazione e il controllo di qualità del FVG sono stati studiati. Le concentrazioni di gentiopicroside e paeoniflorin in FVG sono state analizzate per essere approssimativamente 5.90 mg / g e 8.96 mg/g, rispettivamente .
Nel presente studio, abbiamo testato l’ipotesi che il FVG potesse trattare efficacemente la cervicite. Sono stati stabiliti modelli di cervicite murina per valutare il trattamento del FVG. Nel modello murino infetto da C. trachomatis sono state valutate le cariche batteriche, la lesione patologica e i livelli di MCP-1, IL-2 e IL-17 nel siero. Le inclusioni nelle cellule HeLa indotte da C. trachomatis sono state enumerate in vitro. Inoltre, dopo essere stato infettato dalla miscela di Escherichia coli e Staphylococcus aureus, il trattamento del FVG è stato valutato attraverso l’esame istologico della cervice.
2. Materiali e metodi
2.1. Preparazione di FVG
I sei medicinali a base di erbe sono stati estratti tre volte con acqua bollente e precipitati con alcool al 70% (v/v) di etanolo. Il surnatante è stato concentrato con l’evaporatore rotante ad una densità relativa di 1,30-1,35 (50°C) per ottenere l’estrazione di Feilin (FE, 5,62 g/g). La base del gel era la miscela di carbopol 941 e gomma xantano. L’estrazione è stata miscelata con la base di gel per ottenere FVG. Il carico di droga di FVG era di 2,5 g/g, 1,25 g/g e 0,625 g/g.
2,2. Ceppi batterici e cellule ospiti
Chlamydia trachomatis ceppo di polmonite da topo Nigg II (ATCC® VR-123™), Escherichia coli (ATCC® 25922™) e Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™) sono stati ottenuti dalla raccolta di colture di tipo americano. E. coli e S. aureus sono stati coltivati in brodo nutriente. La linea cellulare epiteliale HeLa della cervice umana (ATCC ® CCL-2™) è stata acquistata dalla collezione di culture dell’Accademia cinese delle Scienze mediche e coltivata in un mezzo RPMI 1640 contenente 10% FBS a 37°C in presenza di 5% di CO2. C. trachomatis N è stato propagato nelle cellule HeLa. Prima dell’infezione, le cellule HeLa infette (105 cellule/mL) sono state interrotte e centrifugate. Il surnatante è stato raccolto per ottenere corpi elementari purificati (EBs), che possono essere utilizzati per infettare direttamente topi e cellule HeLa.
2.3. Infezioni e trattamento animali
120 topi BALB / c femminili (18-20 g) sono stati acquistati da Charles River Laboratories China (Pechino, Cina). Gli animali sono stati ospitati in una struttura per animali con barriera BSL2. Tutte le procedure sperimentali animali descritti qui sono stati con il permesso di Institute of China Academy of Chinese Medical Sciences, Cinese Materia Medica, Comitato Etico. Il numero di riferimento per l’approvazione etica è 20162019.
Il tessuto cervicale dei topi BALB / c è stato ferito con ago angolato sotto anestesia. I topi sono stati poi inoculati con 50 µL di C. trachomatis N o la miscela di E. coli e S. aureus (109 CFU/mL). I topi sono stati infettati una volta al giorno e ripetuti per tre giorni. 24 ore dopo l’ultima infezione, il FVG è stato somministrato nella vagina del topo usando una pipetta (il volume di FVG è stato attentamente controllato) alla dose di 2,2 g/kg, 1,1 g/kg e 0,55 g/kg per 12 giorni. Le supposte di Policresulen (PS), come controllo positivo, sono state mescolate con base di gel e somministrate alla dose di 16,5 mg/kg per 12 giorni. Al gruppo di controllo e al gruppo modello è stato dato un volume uguale di base di gel. Il,, e il giorno del trattamento, il muco cervicale è stato raccolto con il tampone. Il giorno 15, i topi sono stati anestetizzati, sono stati prelevati campioni di sangue dall’aorta ventralis e il siero è stato separato. I topi sono stati poi uccisi dalla dislocazione cervicale sotto anestesia e la cervice e la vagina sono stati rimossi. Lo schema del tempo sperimentale è stato mostrato in Figura 1.
2.4. Analisi ELISA di C. trachomatis N, IL-2, IL-17 e MCP-1
I tamponi con muco cervicale sono stati dispersi con un volume uguale di PBS, il livello di C. trachomatis N in PBS è stato analizzato con l’enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) kit (Meilian, Shanghai, China) secondo le istruzioni del produttore (aggiungere 50 µL di campione e 50 µL di anticorpo di rilevazione per ciascun pozzetto e incubare a 37°C per 1 ora, lavare i pozzetti, aggiungere 100 µL di coniugato HRP a ciascun pozzetto e incubare a 37°C per 0,5 ore; lavare i pozzetti, aggiungere 50 µL di substrati cromogenici di ogni bene, e incubare a 37°C per 0,5 ore; aggiungere 50 µL di soluzione di arresto per ogni bene; leggere l’assorbanza di ogni bene a 450 nm). I livelli di siero IL-2, IL-17 e MCP-1in sono stati determinati dal kit ELISA (Meilian, Shanghai, Cina) secondo le istruzioni del produttore come descritto sopra.
2.5. L’analisi RT-PCR di C. trachomatis N
L’RNA totale è stato estratto dalla cervice utilizzando TRIzol (Invitrogen, California, USA); l’espressione dei geni bersaglio è stata analizzata utilizzando uno script SYBR Prime RT-PCR Kit II (TaKaRa, Pechino, Cina) con Piko Real 96 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). I primer sono stati utilizzati come segue: 16S rRNA forward primer, 5 ‘ – ACC CGT TGG ATT TGA GCG TA-3′; 16S rRNA reverse primer, 5′-GTT GAG CCC CGA GAT TTG AC-3′; GAPDH forward primer, 5′-GCT GAG TAT GTC GTG GAG T-3′; GAPDH reverse primer, 5′-GTT CAC ACC CAT CAC AAA C-3’. L’espressione relativa del gene C. trachomatis N e del gene del topo è stata calcolata secondo il metodo.
2.6. Esame istologico
I tessuti dei topi sono stati fissati con formaldeide al 10%, quindi incorporati in paraffina e tagliati a fette per la colorazione di ematossilina ed eosina. Le sezioni sono state valutate visivamente da DMLB( Leica Camera AG, Wetzlar, Germania); due sezioni sono state preparate da ciascun campione. I seguenti criteri sono stati applicati per classificare i cambiamenti patologici.
“-” L’epitelio della cervice e della vagina non mostra iperplasia e nessuna infiammazione e i tessuti sono normali.
L’epitelio”+” della cervice e della vagina ha una lieve iperplasia; il tessuto connettivo ha una lieve infiammazione segmentale.
“++” L’epitelio della cervice e della vagina ha iperplasia; il tessuto connettivo è stato infiltrato dalle cellule infiammatorie.
“+++” Epitelio della cervice e della vagina hanno iperplasia significativa e sono stati infiltrazione di cellule infiammatorie; il tessuto connettivo era circondato da infiammazione diffusa e congestione vascolare.
2.7. Infezione delle cellule ospiti e macchia di inclusione
Le cellule HeLa sono state seminate in piastra 6-well con la densità di 2×105 cellule / pozzo e coltivate per 48 h. Quindi le cellule sono state incubate con C. trachomatis N EBs contenuto medio. La piastra è stata centrifugata a 32°C per 1h e continuamente coltivata a 37 ° C in presenza di 5% di CO2 per 2h. Il mezzo delle cellule infette è stato sostituito con FE (500, 250 e 125 µg/mL) contenuto medio e incubato per altre 48 h. Successivamente, le cellule sono state lavate con PBS, fissate con metanolo e colorate con Giemsa. Le inclusioni nelle cellule HeLa sono state catturate da IX71 (Olympus, Tokyo, Giappone) ed enumerate.
2.8. Analisi statistiche
Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism v. 6 (GraphPad Software, California, USA). Tutti i dati sono stati normalmente distribuiti (test Kolmogorov-Smirnov). Il numero di inclusione e i punteggi istologici sono stati analizzati con il test Mann-Whitney U; altri sono stati analizzati con il t-test spaiato. Un valore di p < 0.05 è stato considerato significativo.
3. Risultati
3.1. FVG Inibisce il livello di C. trachomatis N nel muco cervicale
EBs di C. trachomatis germinano e formano l’RBs dopo aver invaso le cellule ospiti. Gli RBS iniziano a moltiplicarsi dopo 7-21 giorni. Il saggio immunoenzimatico è un metodo di non coltura comunemente usato per diagnosticare l’infezione da clamidia . Abbiamo analizzato il livello di C. trachomatis N nel muco cervicale per valutare la gravità dell’infezione dei topi.
Nella fase iniziale dell’infezione da C. trachomatis N, non è stato osservato alcun cambiamento significativo della carica batterica. 10 giorni dopo la prima infezione, l’aumento di C. trachomatis N nei topi potrebbe essere testato. Il giorno, il livello della carica batterica era significativamente più alto del gruppo di controllo (Figura 2(a)). Con il successivo trattamento di FVG (2.2, 1.1, 0.55 g/kg), il livello di C. trachomatis N nel muco cervicale dei topi potrebbe essere fortemente inibito in modi dose-dipendenti(Figure 2(c) e 2 (d)).
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3.2. FVG inibisce il carico di C. trachomatis N in Cervice
Nella diagnosi di infezione da chlamydia, la tecnica di amplificazione dell’acido nucleico inclusa la reazione a catena della polimerasi (PCR) è più sensibile e specifica rispetto al saggio immunoenzimatico . Quindi, abbiamo ulteriormente testato il carico di C. trachomatis N nella cervice dei topi con il metodo RT-PCR. Il giorno 15, l’espressione di 16S rRNA di C. trachomatis N nei topi era significativamente più alta rispetto al gruppo di controllo (Figura 3). Il trattamento di FVG (2,2, 1,1 g/kg) per 12 giorni potrebbe inibire fortemente il carico di C. trachomatis N nella cervice (Figura 3).
3.3. FVG diminuisce la C. trachomatis Cervicite e vaginite indotte da N
L’infezione di C. trachomatis nei topi è un modello appropriato per lo studio delle infezioni del tratto genitale. L’infezione non riesce a indurre una grave patologia genitale del tratto superiore . La patologia della cervice e della vagina è stata analizzata per caratterizzare la gravità dell’infezione da C. trachomatis N.
Come mostrato nella Figura 4, nel gruppo di controllo, le cellule epiteliali e il tessuto connettivo della cervice erano normali, non è stata osservata iperplasia o infiammazione. Nel gruppo modello, gli strati epiteliali della cervice hanno iperplasia e le cellule infiammatorie sono state infiltrate nell’epitelio e nel tessuto connettivo. Dopo il trattamento di FVG (1,1 g/kg), la lesione patologica della cervice potrebbe essere significativamente ridotta (Figura 4).
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Come mostrato nella Figura 5, nel gruppo di controllo, l’epitelio vaginale era normale, non è stata osservata iperplasia o infiammazione. Nel gruppo modello, gli strati di epitelio vaginale hanno iperplasia e le cellule infiammatorie sono state infiltrate nel tessuto epiteliale. Dopo il trattamento di FVG (2,2, 1,1 g/kg), la lesione della vagina potrebbe essere significativamente ridotta (Figura 5).
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3.4. FVG Riduce le risposte di citochine sieriche dell’infezione da C. trachomatis N
Le citochine possono essere rilasciate dalle cellule epiteliali e dalle cellule immunitarie dopo l’infezione da C. trachomatis, la maggior parte delle quali proviene da cellule Th1. Queste citochine contribuiscono alle risposte immunitarie ma inducono il danno patologico . I livelli di citochina nel siero sono stati testati per supportare i risultati dell’esame istologico. Il giorno, i livelli di IL-2, IL-17 e MCP-1 sono stati significativamente sovraregolati (Figura 6). Tre dosi di FVG potrebbero inibire efficacemente il rilascio di IL-17 e MCP-1. La produzione di IL-2 potrebbe essere ridotta dal FVG a basse dosi (1,1 e 0,55 g/kg).
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3.5. FVG Riduce il numero di inclusione indotta da C. trachomatis N In Vitro
La proliferazione di C. trachomatis si verifica nelle cellule ospiti con formazione di RBs. L’inclusione può essere formata circa 12 h dopo l’infezione, che contiene numeri di RBs . L’inibizione in vitro di FVG sull’infezione di C. trachomatis N è stata valutata con il numero di inclusione. Dopo che le cellule di HeLa sono state incubate con C. trachomatis N per 48h, è stato possibile osservare inclusioni con la macchia Giemsa. Dopo il trattamento con FVG (FE), il numero di inclusione è stato significativamente ridotto in modo dose-dipendente (Figura 7).
3.6. FVG Ridurre la lesione patologica della cervice indotta da E. coli e S. aureus
Anche se C. trachomatis è segnalato per essere il patogeno più comune della cervicite, anaerobi come E. coli, S. aureus e Klebsiella pneumoniae potrebbero essere isolati nei pazienti di cervicite . Un modello di cervicite di ratto infettato dalla miscela di E. coli, S. aureus e N. gonorrea era stato stabilito nel nostro precedente lavoro . Nella presente ricerca, è stato ottimizzato un modello di topi infettati dalla miscela di E. coli e S. aureus. 14 giorni dopo la prima infezione, la cervice è stata dimostrata gravemente infetta.
Nel gruppo di controllo, l’epitelio cervicale era normale e non è stata osservata iperplasia o infiammazione. Nel gruppo modello, gli strati interni dell’epitelio cervicale hanno iperplasia e le cellule infiammatorie (neutrofili ed eosinofili) sono state gravemente infiltrate nel tessuto epiteliale. Dopo il trattamento di FVG (2,2 e 1,1 g/kg), l’infiammazione della cervice potrebbe essere significativamente inibita (Figura 8).
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4. Discussione
La diagnosi di cervicite è difficile a causa della mancanza del sintomo evidente. In alcuni pazienti è stato possibile osservare una scarica mucopurulenta anormale e un’ectopia cervicale . Molti modelli di cervicite di mammiferi erano stati stabiliti negli ultimi decenni. Macachi, ratti e topi potrebbero essere usati per stabilire il modello della cervicite. Sia i batteri (C. trachomatis) che i composti chimici (fenolo, acido acetico) potrebbero essere usati per indurre la cervicite . In questa ricerca, sono stati ottimizzati due modelli di mouse. Dopo l’infezione con C. trachomatis N, la carica batterica di C. trachomatis N nel muco cervicale è stata continuamente aumentata nel tempo. L’infezione da C. trachomatis N potrebbe portare alla sovraregolazione delle citochine nel siero e all’infiammazione nei tessuti della vagina e della cervice. Dopo l’infezione con la miscela di E. coli e S. aureus, la lesione della cervice potrebbe essere rilevata nella diagnosi patologica.
Clinicamente, gli antibiotici erano la prima scelta per trattare la cervicite in base a diversi agenti patogeni. Ma l’emergere di resistenti agli antibiotici come il chinolone-resistente C. trachomatis e N. gonorrea, meticillina-resistente S. aureus, e vancomicina-resistente E. coli diventa un problema serio in tutto il mondo a causa dell’abuso di antibiotici . La TCM può contribuire a strategie alternative per il trattamento della cervicite. Gli effetti del FVG sulla cervicite sono stati testati in questa ricerca.
FVG è un gel vaginale, la cui base gel è la miscela di carbopol 941 e gomma xantano . Negli ultimi anni, molte preparazioni vaginali commerciali del gel della formula di erbe cinese sono state usate per trattare la cervicite . La consegna vaginale della droga è una via mucosa tradizionale della consegna della droga, che può essere usata per il trattamento di entrambe le malattie locali e sistemiche . Preparazioni tradizionali, come supposte, gel, compresse, film vaginali, irrigazioni e pessari possono essere utilizzati come formulazioni vaginali . Come uno dei sistemi di somministrazione di farmaci più utilizzati, i gel vaginali sono stati utilizzati per la preparazione di microbicidi, contraccettivi, induttori del lavoro e ormoni sessuali. Confrontando con altri sistemi di somministrazione di farmaci, il gel vaginale è più sicuro e ha una maggiore biodisponibilità .
Tutti i sei farmaci a base di erbe in FVG possono essere utilizzati nel trattamento delle malattie ginecologiche in TCM . Secondo la teoria della TCM, in questa formula, la Gentianae radix et rhizome è il ” farmaco monarca” o “farmaco principale”, la Stemonae radix e la Fraxini cortex sono il “farmaco ministeriale” o “farmaco assistente”, la Paeoniae radix rubra e Dictamni cortex sono il “farmaco adiuvante”e la Glycyrrhizae radix et rhizome è il “farmaco guida”. Il Gentianae radix et rhizome può contribuire maggiormente agli effetti del FVG. Iridoidi e glucosidi totali di peonia sono principalmente isolati da Gentianae radix et rhizoma e Paeoniae radix rubra, rispettivamente. Questi composti mostrano significativi effetti anti-infiammatori . Alcaloidi e limonoidi contribuiscono all’attività antibatterica della corteccia Dictamni . Le cumarine in Fraxini cortex e i flavoni in Glycyrrhizae radix et rhizome mostrano effetti antibatterici e anti-infiammatori . Gli alcaloidi contribuiscono all’attività insetticida di Stemonae radix . Questi composti bioattivi di questi medicinali a base di erbe possono supportare il trattamento del FVG sulla cervicite.
IL-17 è prodotto caratteristicamente dalle cellule Th17. Clinicamente, la concentrazione di IL-17 nelle secrezioni genitali dei pazienti infetti da C. trachomatis è significativamente superiore a quella delle donne non infette . L’alto livello di IL-17 nel modello di cervicite del topo era in accordo con il risultato clinico. I livelli di IL-2 e MCP-1 sono associati alle risposte di Th1. IL-2 è secreto dalle cellule Th1 e stimola la produzione di citochine. Esiste una correlazione inversa tra il livello di MCP-1 e le risposte Th1. L’inibizione dell’MCP-1 può aumentare la produzione di IFN-γ . Il FVG potrebbe ridurre le concentrazioni di IL-2, IL-17 e MCP-1. Questi risultati hanno suggerito che il FVG potrebbe inibire la cervicite attraverso la regolazione delle risposte immunitarie dell’ospite.
All’inizio del ciclo di infezione C. trachomatis, il sistema di secrezione di tipo III consente all’EBs di invadere le cellule ospiti . L’internalizzazione di C. trachomatis è seguita dallo sviluppo di RBs e inclusioni. L’inibitore del sistema di secrezione di tipo III potrebbe bloccare la formazione di inclusioni . L’indagine in vitro ha dimostrato che il FVG potrebbe inibire il numero di inclusione nelle cellule HeLa.
In conclusione, abbiamo stabilito con successo due modelli di cervicite di topo con l’infezione di C. trachomatis N, S. aureus ed E. coli. Abbiamo dimostrato che il FVG potrebbe inibire significativamente la cervicite. FVG potrebbe downregulate la carica batterica, mitigare la lesione patologica, e ridurre il numero di inclusione. Gli effetti del FVG sono stati associati all’inibizione dei patogeni e alla regolazione delle risposte immunitarie dell’ospite. Questa ricerca fornisce la prova che il FVG potrebbe essere usato come un nuovo agente alternativo che allevia il problema della resistenza agli antibiotici durante il trattamento della cervicite.
Disponibilità dei dati
I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono inclusi nell’articolo.
Conflitti di interesse
Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo lavoro.
Contributi degli autori
Xin Mao e Ronghua Zhao hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.
Riconoscimenti
Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (nn. 81773977 e 81774204).
