Il metodo incPRINT per identificare i complessi RNA–proteine
Per identificare sistematicamente le interazioni RNA–proteine nelle cellule viventi, abbiamo sviluppato un metodo che misura le interazioni cellulari tra qualsiasi RNA test etichettato e qualsiasi proteina test etichettata. Il principio di incPRINT è la doppia espressione transitoria di un RNA di test con tag MS2 e di una proteina di test con tag BANDIERA in cellule HEK293T che esprimono stabilmente un rivelatore di luciferasi fuso alla proteina MS2 coat (MS2CP) da un plasmide genomicamente integrato (Fig. 1). L’RNA di prova è legato al rivelatore di luciferasi attraverso l’interazione MS2-MS2CP; il complesso RNA-luciferasi è co-purificato con la proteina di prova contrassegnata con BANDIERA immunoprecipitata dai lisati cellulari dall’anticorpo anti-BANDIERA (Fig. 1). Le interazioni indirette RNA-proteine colmate dal DNA vengono eliminate dal trattamento con DNasi dopo la fase di lisi cellulare. Per rilevare ogni interazione RNA-proteina, l’RNA-MS2 co-purificato con la proteina contrassegnata con bandiera del test viene misurato mediante luminescenza quantificabile della luciferasi (Fig. 1). Per controllare i livelli di espressione delle proteine di prova, l’abbondanza delle proteine di prova viene misurata mediante ELISA utilizzando un secondo anticorpo anti-FLAG accoppiato alla perossidasi di rafano (HRP) (Fig. 1). Il metodo incPRINT è flessibile in scala, utilizzabile come un dosaggio a basso o alto rendimento. Per consentire l’identificazione sistematica e ad alto throughput delle interazioni RNA-proteine cellulari, abbiamo generato una libreria personalizzata di proteins 3000 proteine umane contrassegnate con FLAG, inclusi R 1500 RBPs noti (basati su refs. 10,11), transcription 1300 fattori di trascrizione12 e proteins 170 proteine associate alla cromatina. Il contenuto proteico etichettato può essere adattato per adattarsi alla configurazione sperimentale desiderata.
Principio del metodo incPRINT. Le cellule HEK293T, che esprimono stabilmente una proteina ricombinante NanoLuc luciferasi-MS2CP da un plasmide integrato, sono state co-trasfettate con plasmidi che codificano un RNA di test con tag MS2 e proteine di test con tag 3xFLAG in un formato a 96 pozzetti(ogni pozzetto contiene cellule che esprimono un RNA di test con tag e una proteina di test con tag). I lisati cellulari sono stati applicati a piastre a 384 pozzetti rivestite anti-FLAG per immunopurare le proteine di prova con i loro RNA interagenti. Dopo aver lavato le interazioni non specifiche, i complessi proteici MS2-RNA/FLAG-tagged sono stati rilevati dalla NanoLuc luciferasi, legata all’RNA di prova attraverso l’interazione MS2-MS2CP. I livelli di espressione delle proteine del test FLAG-tagged sono stati rilevati mediante ELISA utilizzando un secondo anticorpo anti-FLAG accoppiato alla perossidasi di rafano (HRP).
incPRINT rileva in modo affidabile le interazioni cellulari RNA–proteine
Per stabilire incPRINT, abbiamo eseguito una serie di esperimenti su piccola scala utilizzando una regione conservata di l 1-kb dell’lncRNA Xist chiamata ripetizione A, di seguito denominata Xist(A)13. Poiché diverse interazioni Xist (A)-proteina sono state ben stabilite7, sono servite da controlli nei nostri esperimenti iniziali di incPRINT. Abbiamo progettato un costrutto per esprimere Xist(A)-MS2 e analizzato la capacità dell’RNA Xist (A)-MS2 di interagire con un set selezionato di proteine Xist-binding precedentemente identificate7,14,15. La proteina di legame poli(A) PABPC3 non discriminatoria è stata utilizzata per controllare l’espressione dell’RNA e l’EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) è stata utilizzata come controllo negativo. La luminescenza incPRINT ha rilevato interazioni specifiche di Xist(A)-MS2 con SPEN, RBM15, RBM15B, YTHDC1, HNRNPC, SRSF7 e RALY, mentre HNRNPU, ha riferito di legare Xist a lunghezza intera ma non specificamente Xist (A) 7, e EGFP ha mostrato il legame basale (Fig. 2 bis). Il trattamento con RNasi ha abolito il segnale di interazione RNA-proteina misurato da luciferasi, mentre l’espressione delle proteine di prova rilevate da ELISA è rimasta per lo più invariata (Fig. 2a, Fig. supplementare 1a), dimostrando che le interazioni tra le proteine etichettate e il rivelatore di luciferasi sono state colmate dall’RNA.
incPRINT misura le interazioni cellulari RNA–proteine. a Intensità di interazione rilevate tra Xist (A) – MS2 e i fattori indicati, con e senza trattamento con RNasi. I dati di due repliche biologiche sono presentati come media ± s. d.; RLU sono unità luminose relative. b Intensità di interazione tra Xist (A) – MS2 e i fattori indicati. I valori di interazione in cella sono stati misurati in un esperimento standard di incPRINT. I valori di interazione in vitro sono risultati da trasfezioni separate delle proteine etichettate e dell’RNA Xist(A)-MS2, che sono state combinate per analisi di interazione dopo che le cellule sono state lisate. I dati di due repliche biologiche per ogni esperimento sono presentati come media ± s. d.; RLU sono unità di luce relativa. c Grafico a dispersione che mostra la correlazione delle intensità di interazione Xist(A)-MS2 determinate dalla luminescenza della NanoLuc luciferasi da due repliche biologiche. Sono mostrati i valori mediano-normalizzati. È indicato il coefficiente di correlazione di Pearson al quadrato. d Grafico a dispersione che mostra la correlazione dei livelli di espressione proteica etichettati con FLAG determinati da ELISA anti-FLAG da due repliche biologiche. Sono mostrati i valori mediano-normalizzati. È indicato il coefficiente di correlazione di Pearson al quadrato. e Grafico a dispersione che mostra intensità di interazione RNA-proteina e livelli di espressione proteica. RLU sono unità di luce relativa.
Per ottimizzare il numero di cicli staminali MS2 utilizzati per etichettare l’RNA testato, Xist(A) è stato fuso con due, quattro, sei, dieci o 24 cicli staminali MS2 e le loro interazioni con un set di proteine di controllo sono state testate in un esperimento incPRINT su piccola scala. Un aumento dell’intensità della luminescenza direttamente correlato con un numero aumentato di cicli dello stelo MS2 fino a dieci cicli dello stelo senza un marcato aumento del legame al controllo EGFP (Fig. 1 ter). Pertanto, in tutti i successivi esperimenti incPRINT, gli RNA sono stati etichettati con dieci cicli staminali MS2.
Per determinare se le interazioni RNA–proteine rilevate da incPRINT si sono effettivamente verificate nelle cellule o sono sorte solo in vitro dopo la lisia cellulare16,17,18, il segnale di luminescenza di due esperimenti indipendenti è stato misurato e confrontato. Nel primo esperimento, l’RNA Xist (A)-MS2 e le proteine del test FLAG-tagged sono state co-trasfettate nella stessa popolazione cellulare descritta sopra. Nel secondo esperimento, l’RNA Xist (A)-MS2 e le proteine del test FLAG–tagged sono state trasfettate separatamente in due diverse popolazioni cellulari e raggruppate insieme solo dopo la fase di lisi cellulare, consentendo la formazione di complessi RNA-proteine esclusivamente in vitro (Fig. 1c). Abbiamo scoperto che le interazioni sono state rilevate preferenzialmente quando l’RNA Xist (A)-MS2 e le proteine contrassegnate con FLAG sono state co-trasfettate (la condizione standard di incPRINT; Fig. 2 ter). Questi risultati suggeriscono che ogni volta che un segnale di interazione è stato rilevato da incPRINT, derivava dai complessi RNA-proteine formati nelle cellule, mentre l’associazione di complessi RNA-proteine post-lisi cellulare è apparsa come sfondo trascurabile in condizioni specifiche di incPRINT (Fig. 2 ter). Presi insieme, questi esperimenti stabiliscono che incPRINT misura le interazioni RNA-proteine cellulari utilizzando una lettura di luminescenza.
High-throughput di rilevamento di RNA–proteina interazioni
Per testare la scalabilità di incPRINT per l’identificazione sistematica di RNA–le interazioni della proteina, abbiamo interrogato su misura, libreria di ~3000 tagged BANDIERA proteine umane (tra cui ∼1500 noto RBPs10,11, ∼1300 trascrizione factors12, e ∼170 cromatina associata proteine), con Xist(A)-MS2. Per rafforzare la fiducia delle interazioni RNA-proteina identificate da incPRINT, tutte le interazioni sono state analizzate in duplicato biologico, generando due valori di luminescenza (intensità di interazione RNA–proteina) e due ELISA (livello di espressione della proteina di prova) per ciascuna coppia RNA–proteina testata. Dopo aver filtrato le proteine espresse a livelli insufficienti (vedere la sezione “Metodi”), i dati di interazione sono stati analizzati per 2405 proteine. La riproducibilità di incPRINT è stata valutata calcolando i punteggi di correlazione dei duplicati biologici sia per la luminescenza (Fig. 2c; R2 = 0.87) e segnali ELISA (Fig. 2d; R2 = 0,99). In particolare, non è stata rilevata alcuna correlazione tra i valori di luminescenza e ELISA, indicando che le intensità di interazione non erano un semplice riflesso dei livelli di espressione della proteina (Fig. 2e). In sintesi, i nostri dati dimostrano che incPRINT è un metodo scalabile ad alto throughput che misura in modo riproducibile le interazioni RNA-proteine nella cellula.
incPRINT identifica il proteoma di RNA poco espressi
Successivamente, abbiamo cercato di testare se incPRINT può identificare in modo robusto le proteine che interagiscono con i trascritti espressi a bassi livelli endogeni. L’identificazione di proteine associate a RNA a basso numero di copie è generalmente difficile quando si utilizzano approcci di cattura-MS dell’affinità dell’RNA a causa della tipicamente bassa efficienza delle purificazioni dell’RNA e della grande quantità di materiale richiesto per la spettrometria di massa. Poiché Firre è un lncRNA funzionalmente importante che modula l’architettura nucleare di ordine superiore tra i cromosomi19 ed è di un’abbondanza endogena piuttosto bassa (molecules 20 molecole per cellula basate su dati RNA-Seq su diversi tessuti murini), abbiamo valutato il suo RBP-interactome con incPRINT. La trascrizione full-length Firre taggata da MS2 è stata espressa 4 40 volte superiore a quella endogena FIRRE nelle cellule HEK293T utilizzate per incPRINT (Fig. 2 bis). Come riportato per la trascrizione endogena19, Firre-MS2 è stato localizzato preferenzialmente al nucleo (Fig. 2 ter). Interrogando la nostra libreria di ~ 3000 proteine, incPRINT ha identificato un insieme di proteine specifiche come interattori Firre (Fig. 3a, puntini rossi; Dati supplementari 1), mentre la maggior parte delle proteine non interagiva con Firre (Fig. 3a, punti grigi; Dati supplementari 1). È importante sottolineare che incPRINT ha identificato sia proteine conosciute che nuove che interagiscono con Firre. CTCF e HNRNPU, precedentemente riportati da due studi indipendenti per legare Firre e per essere importanti per la sua funzione19, 20, sono stati identificati anche da incPRINT (Fig. 3 bis). Per convalidare l’associazione di nuovi interattori Firre, abbiamo analizzato i dati ENCODE eclip21. I dati eCLIP, disponibili per sette RBP interagenti Firre identificati da incPRINT, hanno confermato il loro legame con Firre nella linea cellulare K562, convalidando ulteriormente il metodo incPRINT (Fig. 2c; Dati integrativi 2). Coerentemente con il ruolo di Firre nell’organizzazione nucleare19, un insieme di interattori Firre identificati da incPRINT erano proteine associate alla cromatina tra cui CHD1, POU5F1, JARID2, EPC1, SATB1, MECP2, AEBP2 e CTCF (Dati supplementari 1). Le analisi del dominio proteico hanno mostrato che le proteine interagenti con Firre sono state significativamente arricchite per il motivo di riconoscimento dell’RNA (RRM) (Fig. 3b; Dati supplementari 3).
incPRINT identifica le proteine che interagiscono con Firre. un’intensità di interazione Firre-proteina normalizzata in media da due repliche biologiche, ordinate in ordine crescente. La linea tratteggiata orizzontale rappresenta il taglio dell’intensità di interazione utilizzato per la classificazione degli interattori Firre. I punti rossi sono proteine che interagiscono con Firre; i punti grigi sono proteine che non si legano a Firre. Sono indicate le proteine note per legarsi a Firre o quelle la cui interazione è stata convalidata nei dati ENCODE eclip21. Vedere la sezione ‘Metodi’ per la normalizzazione dei dati. RLU sono unità di luce relativa. b Grafico che mostra il numero di partner che interagiscono con incPRINT Firre che contengono un particolare dominio Pfam rispetto al-log10 (P) dell’arricchimento del dominio. I valori P sono stati calcolati utilizzando il test della proporzione. Mostrati in blu sono domini rappresentati almeno tre volte nella frazione tirata verso il basso che hanno un P corretto < 0.05. RRM-1 si riferisce al dominio Pfam PF00076. Per tutti i domini Pfam analizzati, vedere Dati supplementari 3.
Per determinare se l’RNA sovraespressione è stato richiesto per incPRINT per identificare correttamente le proteine di legame per l’RNA con bassi livelli endogeni, un insieme di proteine è stato testato con diverse concentrazioni di Firre-MS2 che vanno dalla sovraespressione come descritto in precedenza per i livelli comparabili a endogeno FIRRE in HEK293T cellule (Complementare Fig. 2d, e). Mentre la sovraespressione dell’RNA ha portato a punteggi di interazione più elevati consentendo la loro migliore separazione dai punteggi di fondo, il segnale della luciferasi è stato rilevabile in modo robusto sopra il segnale di fondo quando sono state utilizzate diluizioni di Firre-MS2 (Fig. 2d). È importante sottolineare che questo segnale non è stato associato ai livelli di espressione della proteina di prova (Fig. 2e). Insieme, questi dati dimostrano l’utilità di incPRINT nell’identificazione delle proteine associate ai trascritti espressi a bassi livelli endogeni.
incPRINT identifica partner di interazione RNA-regione-specifica
Poiché molti LNCRNA funzionano come scaffold modulari, consentendo il legame di specifici RBP a domini di RNA discreti1,5, abbiamo cercato di testare se incPRINT consente l’identificazione di interazioni RNA-dominio-specifiche. Una molecola ideale di prova di principio è il lncRNA Xist, dato il suo ruolo vitale nell’inattivazione del cromosoma X dei mammiferi (XCI)22,23, e la sua struttura modulare e funzione. La trascrizione Xist lunga ∼17 kb contiene diverse regioni di sequenza conservate (chiamate ripetizioni da A a F) che svolgono funzioni distinte durante il processo XCI, tra cui l’inizio del silenziamento genico (la ripetizione A), il mantenimento dello stato X-inattivo (le ripetizioni F e B)e la corretta localizzazione cromosomica e l’accumulo focale di Xist (le ripetizioni C ed E) 13,24,25,26,27,28,29,30,31,32 (Fig. 4 bis). Inoltre, diversi studi indipendenti hanno precedentemente identificato e convalidato una serie di interazioni proteiche funzionali con Xist7 a lunghezza intera,14,15,26,28,33,34,35. Abbiamo cercato di applicare incPRINT a tre regioni conservate del mouse Xist, cioè Xist(A), Xist(F) e Xist(C) (Fig. 4 bis). Quando espresso in cellule HEK293T utilizzate per incPRINT, ogni frammento Xist-MS2 ha mostrato un diverso livello di espressione rispetto allo Xist endogeno, che va da un aumento di ∼60 volte per Xist(A) a un livello di espressione quasi endogeno per Xist (C) (Fig. 3 bis). Tutti i singoli frammenti Xist-MS2 sono stati localizzati preferenzialmente al nucleo, in modo simile alla loro controparte endogena a tutta lunghezza (Fig. 3 ter). Ogni regione Xist (cioè, Xist(A), Xist(F) e Xist(C)) è stato interrogato con la nostra libreria di ~3000 proteine. Per confrontare i segnali tra le singole regioni Xist espresse a diversi livelli (Fig. 3c), i punteggi di interazione per ogni regione Xist sono stati normalizzati utilizzando i dati di legame MS2 RNA (Dati supplementari 4). Per la normalizzazione, un insieme di 200 proteine con punteggi di luciferasi di primo livello nel dataset di RNA MS2 è stato definito come leganti comuni di tutti gli RNA con tag MS2. I leganti comuni sono stati quindi identificati in ciascun set di dati e il loro punteggio mediano di interazione è stato calcolato per ciascun RNA testato e utilizzato per normalizzare le intensità di luminescenza grezza in ciascun set di dati (vedere la sezione “Metodi”). In particolare, i dati MS2 non sono stati utilizzati come controllo della specificità di legame, poiché molti RBPS riconoscono motifs36 RNA a bassa complessità presenti anche all’interno del tag MS2 e poiché il legame proteico con MS2 non esclude una potenziale interazione funzionale con un RNA di prova. Analogamente a Firre, abbiamo scoperto che la maggior parte delle proteine non si legava a nessuno dei frammenti Xist testati (Fig. 4b-d, punti grigi; Dati supplementari 4), mentre set specifici di proteine sono stati identificati per interagire con ogni singola regione Xist (Fig. 4b-d, puntini rossi; Dati supplementari 4). È importante sottolineare che, tra le proteine interagenti Xist identificate da incPRINT, abbiamo trovato partner di interazione ben noti di Xist identificati in studi precedenti per legare la trascrizione a figura intera 7, 14, 15 (indicata in Fig. 4b-d, Tabella supplementare 1). Confrontando gli insiemi di proteine identificate da incPRINT e i loro punteggi di interazione per ciascuna regione Xist interrogata (Dati supplementari 4), abbiamo scoperto che ogni frammento Xist interagiva con un insieme di proteine specifiche per la regione corrispondente, con una frazione minore di RBPs che si legava a tutte e tre le regioni Xist (Fig. 4 e). Pertanto, l’applicazione di incPRINT a tre regioni conservate di Xist ha permesso l’identificazione e l’assegnazione a specifiche regioni di RNA di RBP precedentemente determinate per legare la trascrizione Xist a lunghezza completa7, 14, 15 (Fig. 4e; note proteine che interagiscono con Xist sono indicate a destra). Ad esempio, incPRINT ha identificato SPEN come un interattore Xist(A) specifico (Fig. 4e), confermando i precedenti rilevamenti7, 8. Allo stesso modo, RBM15, RBM15B e YTHDC1 sono stati identificati da incPRINT per interagire specificamente con Xist(A) e Xist(F), ma non Xist(C), confermando il loro legame riportato alla fine 5′ di Xist7, 9 (Fig. 4 e). Inoltre, abbiamo identificato un’interazione Xist(C)-specifica con HNRNPU (noto anche come SAF-A) precedentemente dimostrato di essere coinvolto nella localizzazione Xist7,14,33 (Fig. 4e, Tabella supplementare 1). Per convalidare le interazioni Xist-proteina specifiche per la regione dell’RNA, i dati ENCODE eclip21 disponibili per 14 proteine identificate da incPRINT, molte delle quali sono nuovi RPBS interagenti con Xist, hanno confermato il loro legame con XIST nella linea K562 (Fig. 3d; Dati integrativi 2), avvalorando ulteriormente la specificità del nostro metodo. Una differenza funzionale tra gli interattomi proteici delle tre regioni Xist è stata confermata dalle analisi di arricchimento del termine Gene Ontology (GO). Coerentemente con le funzioni differenziali riportate per le singole regioni Xist, le proteine associate a Xist(A) e Xist(F) sono state arricchite per gli RBP coinvolti nell’elaborazione dell’RNA, mentre la regione C – repeat ha interagito preferenzialmente con le proteine leganti il DNA coinvolte nella regolazione trascrizionale (Fig. 3 sexies, f). In accordo con l’analisi GO, l’analisi del dominio proteico ha dimostrato che le proteine interagenti Xist(A) sono state arricchite per i domini proteici SPOC (Spen paralog e ortholog C-terminal) e RRM, le proteine interagenti Xist(F) sono state arricchite per il dominio RRM e le proteine interagenti Xist(C) non hanno mostrato alcun particolare arricchimento (Fig. 4f; Dati supplementari 3), evidenziando ulteriormente la specificità dei set proteici identificati da incPRINT per ciascuna regione Xist. In sintesi, incPRINT ha recuperato con successo le interazioni note con proteine Xist e ha scoperto nuovi RBP. Identificando specifici insiemi di proteine che interagiscono con le singole regioni conservate di un lncRNA modulare, abbiamo dimostrato che incPRINT consente l’assegnazione specifica della regione delle interazioni RNA-proteine.
Proteine identificate per interagire con regioni distinte del lncRNA Xist. una rappresentazione schematica della trascrizione Xist del mouse e delle sue regioni di ripetizione da A a F conservate. Gli esoni sono indicati come caselle, gli introni come linee. Un’immagine ingrandita della regione 5 ‘ di Xist mostra le posizioni dei frammenti Xist lungo la trascrizione Xist. I frammenti da 0,9 kb, 2 kb e 1,7 kb per Xist(A), Xist(F) e Xist(C), rispettivamente, utilizzati negli esperimenti incPRINT sono delimitati da barre colorate orizzontali. b Intensità di interazione Xist(A)-proteina normalizzata in media da due repliche biologiche, ordinate in ordine crescente. La linea tratteggiata orizzontale rappresenta il cutoff dell’intensità di interazione utilizzato per la classificazione degli interattori Xist(A). I punti rossi sono proteine che interagiscono con Xist(A); i punti grigi sono proteine che non si legano a Xist(A). Sono indicate proteine selezionate note per legarsi a Xist. Vedere la sezione ‘Metodi’ per la normalizzazione dei dati. RLU sono unità di luce relativa. c Come in (b), per Xist(F). d Come in (b), per Xist(C). e Heatmap che mostra le intensità di interazione tra Xist(A), Xist(F) e Xist(C). Le proteine che interagiscono con Xist precedentemente rilevate sono indicate sulla destra. RLU sono unità di luce relativa. f Come in Fig. 3b, per i partner di interazione Xist(A), Xist(F) e Xist(C). SPOC si riferisce al dominio Pfam PF07744.
incPRINT identifica le interazioni funzionali RNA–proteine
Poiché Xist ha una funzione cellulare ben caratterizzata nel silenziamento genico durante XCI, abbiamo cercato di verificare se alcune delle interazioni Xist-proteine scoperte usando incPRINT sono funzionalmente rilevanti. L’attenzione si è concentrata sulla proteina Zz3, che interagisce con tutte e tre le regioni Xist testate, e RBM6, che presenta un legame più specifico con le regioni Xist(A) e Xist(F) (Fig. 4 e). Innanzitutto, abbiamo confermato l’interazione di Xist con RBM6 e Rz3 in condizioni endogene testando la co-precipitazione di Xist con entrambe le proteine in cellule staminali embrionali di topo. Le proteine sono state etichettate HA nella linea cellulare polimorfica TX1072 ES che consente l’espressione Xist indotta da doxiciclina, innescando XCI in assenza di differenziazione31,37,38,39. L’immunoprecipitazione a RNA (RIP) dopo induzione doxiciclina di Xist e UV-cross-linking delle cellule seguita da analisi qRT-PCR ha identificato un significativo arricchimento del trascritto Xist con proteine RBM6 e proteinsz3, confermando la loro interazione in vivo (Fig. 5 bis, lettera b). In particolare, incPRINT ha anche identificato RBM6 come interazione con Firre. RIP qRT-PCR ha rilevato una specifica interazione di Firre con RBM6 ma non con Zz3, confermando così il legame Firre-RBM6 in condizioni endogene e convalidando ulteriormente i nostri risultati incPRINT (Fig. 5 bis, lettera b).
RBM6 e Zz3 sono necessari per XCI in vivo. una immunoprecipitazione RNA (RIP) della proteina RBM6 HA-tagged. Pannello di sinistra, western blot per RMB6. Pannello di destra, livelli di RNA dei trascritti indicati nell’ingresso e negli eluati immunoprecipitati. Tutti gli arricchimenti sono normalizzati a GAPDH mRNA e al campione di input. Ogni esperimento RIP è stato eseguito su due repliche biologiche indipendenti. I dati sono presentati come media ± s. d.; test t non accoppiati: * * P < 0.01. immunoprecipitazione dell’RNA di b (RIP) della proteina HAz3 HA-contrassegnata. Pannello di sinistra, western blot per Zz3. Pannello di destra, livelli di RNA dei trascritti indicati nell’ingresso e negli eluati immunoprecipitati. Tutti gli arricchimenti sono normalizzati all’mRNA GAPDH e al campione di input come descritto nella sezione “Metodi”. Ogni esperimento RIP è stato eseguito due volte su repliche biologiche indipendenti. I dati sono presentati come media ± s. d.; test t non accoppiati: * * P <0.01; *P< 0.05, non significativo (ns). Le macchie complete sono fornite come file di dati di origine. c Immagini rappresentative di RNA FISH di cellule indotte da Xist dopo l’esaurimento delle proteine indicate. Xist è mostrato in rosso e il gene X-Linked Lamp2 in verde. La linea tratteggiata delinea i nuclei delle cellule. Gli asterischi indicano l’espressione Lamp2 dal cromosoma X attivo. Le punte di freccia indicano l’espressione Lamp2 dal cromosoma X inattivo che sfugge alle barre della scala XCI, 5 µm. d Quantificazione di cellule con espressione bi-allelica Lamp2 valutata con RNA FISH ed espressa come rapporto di piega rispetto al controllo RLuc. I dati di tre esperimenti indipendenti sono rappresentati come media ± s. d.; T-test dello studente: **P < 0.01; *P < 0.05; non significativo (ns). Linea tratteggiata delinea il livello di RLuc.
Successivamente, per verificare se RBM6 e Zz3 hanno un impatto su XCI, abbiamo usato l’ibridazione in situ fluorescente a RNA a cellule singole (RNA FISH) per valutare l’espressione di Lamp2 endogeno, un gene X-linked che viene normalmente silenziato durante l’iniziazione XCI40. In caso di espressione Xist indotta da doxiciclina, deplezione di Rbm6, Spz3 e controllo positivo Spen (Fig. 4a, b) ha portato a una riduzione del silenziamento di Lamp2, mentre la sua espressione mono-allelica indotta da XCI è rimasta inalterata dopo l’esaurimento di Thap7, che non interagiva con Xist e veniva usato come controllo negativo (Fig. 5c, d; Fig.supplementare. 4c; Tabella supplementare 2). In assenza di condizioni di Xist (-doxiciclina), l’espressione di Lamp2 è rimasta invariata dopo l’esaurimento delle proteine di cui sopra (Fig. 4d; Tabella supplementare 2). È importante sottolineare che i difetti nel silenziamento del cromosoma X non sono stati innescati dall’espressione alterata di Xist / Tsix dopo l’esaurimento delle singole proteine (Fig. 4 e). In sintesi, l’identificazione di interattori funzionalmente importanti tra gli RBP identificati da incPRINT dimostra il potenziale di scoperta di incPRINT.
