Utilizzo di analoghi di ATP da parte di CDK ingegnerizzati
Abbiamo generato CDK mutanti “Shokat” contenenti scambi di aminoacidi in un residuo ingombrante conservato nelle loro tasche di legame ATP. Nel caso di CDK2 e CDK3 si trattava di uno scambio tra fenilalanina e alanina alla posizione 80, designata CDK2 (F80A). Abbiamo anche sintetizzato 12 analoghi di ATP per determinare se i CDK ingegnerizzati possono utilizzare questi analoghi per fosforilare la proteina del retinoblastoma ricombinante (Rb) in vitro e hanno scoperto che utilizzavano N6-(2-feniletil)-ATP (PE-ATP) in modo più efficiente (Figura 1a e dati non mostrati). Sebbene sia wild-type che ciclina E-CDK2 (F80A) utilizzassero ATP normale per fosforilare la proteina glutatione-S-transferasi (GST)-Rb, solo la chinasi F80A potrebbe utilizzare PE-ATP. Risultati simili sono stati ottenuti con cyclin E-CDK3, ma in questo caso il mutante F80A non poteva più utilizzare ATP normale, sebbene la base strutturale per questa osservazione non sia chiara (Figura 1a). Questi studi hanno confermato che le chinasi di tipo selvaggio e ingegnerizzate presentano le specificità ATP desiderate.
Caratterizzazione dei CDK ingegnerizzati. (a) I complessi di ciclina E-CDK2/3, o le loro controparti ingegnerizzate F80A (indicate da asterischi), sono stati immunoprecipitati da lisati di cellule U2OS trasfette tramite l’HA-tag sulla subunità CDK e sottoposti a saggi di chinasi in vitro con 10 µM di analogo normale ATP o PE-ATP. La fosforilazione di GST-Rb è stata monitorata mediante immunoblotting con un anticorpo fosfospecifico anti-pS780-Rb (New England Biolabs). Le chinasi wild-type non possono utilizzare PE-ATP. (b) Cromatografia a strato sottile: l’analisi rivela l’idrolisi dell’ATP nel lisato cellulare e il trasferimento ai nucleotidi accettori (a sinistra). Sono indicate le posizioni del fosfato libero e dell’ATP. Al contrario, ATP-γ-S non è idrolizzato nei lisati cellulari (a destra). (c) I saggi di chinasi sono stati eseguiti utilizzando complessi wild-type e ciclina A-CDK2 (F80A) purificati da E. coli e GST-Rb in presenza di 200 µM di ATP, ATP-γ-S e PE-ATP-γ-S a temperatura ambiente per 2 h. Le reazioni di chinasi sono state analizzate mediante elettroforesi su gel SDS e visualizzate mediante colorazione Coomassie. L’estensione della fosforilazione GST-Rb è stata monitorata dallo spostamento di elettromobilità di GST-Rb.
Mentre i CDK mutanti utilizzavano efficientemente PE-ATP per fosforilare Rb in vitro, esperimenti simili che utilizzavano PE-ATP radiomarcato nei lisati cellulari fallirono perché il fosfato marcato era scisso dal PE-ATP da un’attività atpasica nei lisati (dati non mostrati). Siamo quindi passati alla forma tiofosfato dell’analogo ATP (PE-ATP-γ-S), che non è stato idrolizzato dai lisati (Figura 1b). Sebbene le chinasi usino spesso ATP-γ-S in modo meno efficiente del normale ATP, la tiofosforilazione presenta diversi vantaggi in questo contesto. Innanzitutto, i tiofosfati sono più stabili e resistenti alle fosfatasi . In secondo luogo, poiché non ci sono eventi di tiofosforilazione preesistenti nelle cellule, l’etichettatura del tiofosfato fornisce marcatori unici per le proteine fosforilate dalla chinasi mutante. Infine, il gruppo tiofosfato ha proprietà chimiche simili al gruppo sulfidrilico ed è suscettibile di modifiche chimiche. Abbiamo espresso e purificato i complessi solubili di tipo selvaggio e ciclina A-CDK2 (F80A) dai batteri e abbiamo effettuato un test di chinasi Rb simile per testare la loro capacità di utilizzare PE-ATP-γ-S. Come mostrato in Figura 1c, sebbene entrambe le chinasi possano utilizzare ATP o ATP-γ-S per fosforilare la proteina GST-Rb (come indicato dal suo spostamento di elettromobilità) solo il mutante F80A può utilizzare PE-ATP-γ-S. Abbiamo quindi usato PE-ATP-γ-S per tutti i nostri studi successivi.
Purificazione monofase dei peptidi tiofosforilati
L’uso di CDK ingegnerizzati e analoghi dell’ATP facilita la fosforilazione del substrato altamente specifico: la prossima sfida è come identificarli all’interno di un lisato complesso. Abbiamo cercato di utilizzare i tag del tiofosfato per catturare e arricchire in modo covalente i peptidi tiofosforilati dopo la fosforilazione e la digestione dei lisati. Tuttavia, un problema chiave era quello di distinguere chimicamente i tiofosfopeptidi e i peptidi contenenti cisteina. Sebbene sia stato descritto un metodo chemioselettivo per arricchire i tiofosfopeptidi, la schiacciante abbondanza di residui di cisteina in una miscela proteica complessa rende difficile questo approccio . Abbiamo usato un semplice metodo di cattura e rilascio per isolare selettivamente i peptidi tiofosforilati all’interno dei lisati cellulari tripsinizzati (Figura 2a). Le proteine all’interno del lisato sono state fosforilate in vitro con ciclina A-CDK2 (F80A) e PE-ATP-γ-S. La miscela proteica è stata successivamente digerita e i peptidi risultanti sono stati miscelati con Tiopropil sepharosio 6B , una resina disolfuro attivata che cattura sia i peptidi contenenti cisteina che i tiofosfopeptidi attraverso una reazione di scambio disolfuro. Poiché l’eluizione tradizionale del ditiotreitolo (DTT) rilascia entrambi i tipi di peptidi legati, abbiamo utilizzato le differenze qualitative tra peptidi tiofosfati legati alla resina e peptidi contenenti cisteina al legame fosforotiolatesolfuro e legame alchildisolfuro, rispettivamente. A valori di pH elevati, il legame fosforotiolatesolfuro viene idrolizzato e l’alchildisolfuro rimane intatto . Il trattamento della resina con una base forte (come l’idrossido di sodio) rilascia specificamente i tiofosfopeptidi (e li converte anche in normali fosfopeptidi), ma non i peptidi contenenti cisteina, idrolizzando il legame fosforotiolatesolfuro (Figura 2b). Poiché i peptidi legati tramite cisteina non vengono eluiti nella fase finale, non possiamo recuperare i tiofosfopeptidi contenenti cisteina. Inoltre, l’eluizione provoca la perdita della firma del tiofosfato convertendo il tiofosfopeptide in un fosfopeptide. Il nostro metodo di isolamento tiofosfopeptide differisce modestamente da quello di Blethrow et al. in quanto catturiamo i tiofosfopeptidi usando la chimica a scambio disolfuro (resina disolfuro) invece di alchilazione (resina iodoacetammide) e li elutiamo selettivamente con idrolisi di base piuttosto che ossidazione.
Purificazione a passo singolo dei tiofosfopeptidi. a) Schema generale per l’isolamento dei tiofosfospeptidi. Le proteine sono state etichettate con ciclina A-CDK2 (F80A) e PE-ATP-γ-S e sottoposte a digestione triptica. I peptidi risultanti sono stati mescolati con perle di disolfuro, che catturano sia i tiofosfopeptidi che i peptidi contenenti cisteina. Le perle sono state quindi trattate con una soluzione di base per rilasciare selettivamente solo i fosfopeptidi. b) La chimica alla base della selettività dei tiofosfopeptidi. Sia il tiofosfato che la cisteina contengono gruppi tiolici reattivi che possono essere catturati in modo covalente dalle perle di disolfuro. A valori di pH elevati, i legami fosforotiolatesolfuro (vicino alla freccia superiore) vengono idrolizzati per consentire il rilascio dei peptidi legati al tallone mentre i legami alchildisolfuro (vicino alla freccia inferiore) sono stabili e quindi i peptidi vengono trattenuti sulle perle. Si noti che durante l’idrolisi del legame fosforotiolatesolfuro, il tiofosfato viene convertito in fosfato normale.
Per testare la fattibilità di questo approccio, abbiamo fosforilato GST-Rb con ciclina A-CDK2 (F80A) e PE-ATP-γ-S, e applicato la nostra procedura di purificazione ad un digest tripsina della miscela di reazione. I peptidi isolati sono stati analizzati mediante spettrometria di massa tandem elettrospray (ESI-MS/MS) utilizzando uno spettrometro di massa a trappola ionica. I peptidi sono stati identificati facendo corrispondere gli spettri di massa tandem a un database di sequenze proteiche umane (con aggiunta della sequenza GST-Rb) utilizzando il software SEQUEST . Il substrato di GST-Rb contiene cinque cisteine come pure sette siti di SP / TP, che sono siti favoriti per fosforilazione di CDK . Abbiamo recuperato più fosfopeptidi contenenti solo e tutti i siti di fosforilazione previsti (Tabella 1). Inoltre, non abbiamo recuperato peptidi contenenti cisteina e pochissimi peptidi non specifici. Ciò ha fornito una prova di principio per i nostri saggi su larga scala.
Identificazione umana ciclina-CDK2 substrati in lisati cellulari
il Nostro obiettivo era quello di identificare potenziali ciclina-CDK2 substrati su un proteoma larga scala. Per ridurre la complessità del campione, abbiamo frazionato l’intero lisato cellulare delle cellule HEK293 in 11 frazioni utilizzando cromatografia a scambio ionico e precipitazione di solfato di ammonio (file di dati aggiuntivi 1). Abbiamo quindi effettuato saggi di chinasi in vitro su ciascuna frazione. Come controllo positivo, abbiamo anche aggiunto una piccola quantità di GST-Rb per ogni reazione. Dopo aver digerito la miscela di reazione con tripsina, abbiamo applicato il nostro protocollo di purificazione per isolare i tiofosfopeptidi dalle miscele peptidiche. I peptidi recuperati sono stati sottoposti a cromatografia liquida – analisi MS / MS e ricerca di database. Abbiamo recuperato un numero variabile di peptidi e almeno un fosfopeptide Rb da ciascuna delle frazioni di lisato (file di dati aggiuntivi 2).
I CDK fosforilano le proteine in modo diretto alla prolina su serina o treonina e numerosi studi supportano l’idea che il motivo S/T-P-X-R/K rappresenti il motivo di consenso CDK. Dai fosfopeptidi abbiamo identificato un totale di 203 proteine: 180 candidati sono stati fosforilati all’interno di motivi SP o TP (diretti alla prolina; File di dati aggiuntivi 3). Questi substrati candidati rappresentano una vasta gamma di processi biologici, tra cui il controllo del ciclo cellulare, il metabolismo del DNA e dell’RNA, la traduzione e le strutture cellulari (Figura 3). Un totale di 96 su 222 (43%) dei siti diretti alla prolina è conforme al consenso CDK noto (con un residuo caricato positivamente nella posizione +3). È interessante notare che circa il 24% dei siti diretti alla prolina (53/222) conteneva un residuo caricato positivamente nelle posizioni +4 o +5, suggerendo che questo motivo potrebbe anche essere favorito da CDK2. Infatti, Blethrow et al. ha anche osservato che un numero sostanziale di substrati della ciclina B-CDK1 contiene siti non di consenso. Per i peptidi che contenevano siti non di consenso, abbiamo scoperto che circa il 50% delle proteine corrispondenti trasportava almeno un motivo K/RXLφ o K/RXLXφ (dove φ è un grande residuo idrofobo e X è un qualsiasi amminoacido) distale ai siti di fosforilazione, e quasi tutti portavano almeno un motivo RXL minimo (file di dati aggiuntivo 3). Ciò è coerente con l’idea consolidata che questi motivi promuovono il legame della ciclina A-CDK2 ai substrati . Oltre a selezionare le fosforilazioni con motivi di consenso CDK, abbiamo identificato 28 proteine che sono state precedentemente implicate come substrati CDK (contrassegnate in grassetto nel file di dati aggiuntivo 3) . Così, quasi il 15% dei nostri candidati sono stati precedentemente trovati come obiettivi CDK, sostenendo ulteriormente l’idea che i nostri metodi catturati e arricchiti per substrati CDK2. Infine, il 43% delle fosforilazioni che abbiamo trovato sono state precedentemente identificate in analisi di fosfoproteomi su larga scala in vivo, indicando che queste fosforilazioni non sono limitate alle nostre condizioni di lisato .
Classificazione delle proteine per categoria funzionale. I numeri indicano proteine identificate in ogni categoria.
Sia i nostri studi che quelli riportati da Blethrow et al. utilizzato schemi di isolamento fosfopeptide simili e relativi ciclina-CDK, e abbiamo anticipato che ci potrebbe essere sostanziale sovrapposizione nei substrati rivelati da entrambi gli studi. In effetti, abbiamo trovato quasi il 50% (30/68) dei substrati della ciclina B-CDK1 nella nostra lista di candidati alla ciclina A-CDK2; quindi, questi metodi sono robusti e riproducibili (file di dati aggiuntivo 4). Tuttavia, ci sono anche differenze sostanziali tra i due elenchi e queste probabilmente sono il risultato di molti fattori, tra cui differenze procedurali, diversi tipi di cellule, identificazione incompleta del peptide da parte della SM e specificità del substrato conferita dalle subunità ciclina e/o chinasi. Alcune di queste differenze possono anche riflettere le diverse funzioni biologiche della ciclina A-CDK2 e della ciclina B-CDK1. Ad esempio, abbiamo trovato nove proteine coinvolte nella traduzione delle proteine e/o nella funzione del ribosoma, ma nessuna di queste proteine è stata trovata con la ciclina B-CDK1, nonostante la loro abbondanza relativamente alta.
Sebbene abbiamo identificato un certo numero di substrati CDK2 noti, non abbiamo identificato alcuni substrati CDK2 precedentemente descritti. Alcuni dei fattori sopra elencati possono anche spiegare la mancata ricerca di substrati CDK2 noti nelle nostre analisi. Inoltre, i substrati già fosforilati da CDK endogeni non sarebbero stati tiofosforilati in vitro. È anche possibile che alcune proteine non siano state solubilizzate durante la preparazione del lisato e / o la fase di sonicazione ed escluse dalle nostre analisi. Infine, è possibile che grandi complessi proteici possano essere stati interrotti dalle procedure di frazionamento prima della reazione della chinasi e che le proteine fosforilate da CDK2 solo nel contesto di questi complessi non possano essere scoperte dai nostri metodi.
Abbiamo anche recuperato quattro fosfopeptidi corrispondenti alla ciclina A e CDK2 e 27 fosfopeptidi aggiuntivi con siti non diretti alla prolina (file di dati aggiuntivo 5). Sospettavamo che questi fosfopeptidi derivassero dall’auto-fosforilazione della ciclina A-CDK2 e dalla fosforilazione di fondo da parte di altre chinasi, e altri hanno riportato una fosforilazione di fondo simile . Per testare queste possibilità, abbiamo effettuato una reazione di controllo chinasi utilizzando ciclina A-CDK2 (F80A) e PE-ATP-γ-S senza lisato cellulare aggiunto e recuperato tre dei quattro peptidi ciclina A-CDK2 (file di dati aggiuntivi 5). Inoltre, quando abbiamo eseguito una reazione simile “solo chinasi” in presenza di γ-32P-ATP, abbiamo osservato l’incorporazione di 32P in entrambe queste proteine in modo dose-dipendente (file di dati aggiuntivi 6). Questi esperimenti hanno confermato che c’era un’auto-fosforilazione di fondo della ciclina A-CDK2 nei test originali.
Abbiamo anche eseguito reazioni di controllo della chinasi utilizzando le frazioni di lisato, GST-Rb ‘spike-in’ e PE-ATP-γ-S senza l’aggiunta di ciclina A-CDK2. Queste reazioni di controllo della “no-chinasi” hanno fosforilato 7 dei 27 fosfopeptidi non diretti alla prolina sulla nostra lista (file di dati aggiuntivo 5), suggerendo che la maggior parte, se non tutti, di questi fosfopeptidi sono il risultato della fosforilazione di fondo da parte delle chinasi che sono in grado di utilizzare l’analogo ATP in misura limitata. Ad esempio, la maggior parte di questi peptidi contiene siti di fosforilazione diretti ai residui acidi che sono motivi di caseina chinasi 2. La caseina chinasi 2 è unica in quanto può utilizzare GTP e ATP; quindi, il sito attivo può ospitare gli analoghi ATP ingombranti, come il PE-ATP . È importante sottolineare che non abbiamo recuperato alcun fosfopeptide Rb da questi esperimenti di controllo, indicando che non vi era alcuna attività CDK non specifica nei nostri saggi. Abbiamo anche recuperato 44 peptidi non modificati, 12 dei quali contenevano residui di cisteina. La maggior parte di questi peptidi ha avuto origine da diverse frazioni di lisato (file di dati aggiuntivi 2). Sospettiamo che questi derivino dal legame non specifico di basso livello dei peptidi alla resina nonostante le condizioni di lavaggio rigorose e, nel caso dei peptidi contenenti cisteina, da una piccola quantità di idrolisi del legame alchildisolfuro durante la fase di eluizione. In sintesi, i nostri metodi erano altamente selettivi e i nostri studi hanno identificato un gruppo sorprendentemente ampio di substrati candidati della ciclina A-CDK2, la maggior parte dei quali non sono stati precedentemente identificati come bersagli CDK.
Validazione di substrati candidati come target ciclina A-CDK2
Abbiamo impiegato diverse strategie per convalidare alcuni dei nuovi candidati nella nostra lista come substrati ciclina A-CDK2. Poiché le nostre identificazioni proteiche erano basate su sequenze peptidiche, abbiamo iniziato confermando che la ciclina A-CDK2 ha fosforilato tre candidati a lunghezza intera e nativi immunoprecipitati tramite tag epitopi da 293 cellule trasfettate (EF2, TRF2 e RAP1). Poiché queste proteine non erano presenti nella lista della ciclina B-CDK1, abbiamo determinato se sono anche fosforilate dalla ciclina B-CDK1. Ogni candidato CDK2 è stato fosforilato sia dalla ciclina A-CDK2 che dalla ciclina B-CDK1, sebbene EF2 sia stato fosforilato in misura minore rispetto a TRF2 o RAP1 (Figura 4a). Abbiamo anche espresso TRF2, RAP1 e la proteina ribosomiale RL12 come fusioni GST e li abbiamo purificati da Escherichia coli. Quando abbiamo usato la ciclina A-CDK2 per fosforilare TRF2 e RAP1 in vitro, le proteine erano altamente fosforilate e le analisi della SM hanno rivelato che queste fosforilazioni si sono verificate negli stessi siti inizialmente identificati (Figura 4b). Abbiamo anche usato la ciclina A-CDK2 e la ciclina B-CDK1 per fosforilare GST-RL12 e abbiamo scoperto che entrambi i CDK hanno anche fosforilato RL12 in vitro (Figura 4c). Questi studi confermano quindi che i peptidi identificati nel nostro schermo rappresentano proteine che possono essere fosforilate dalla ciclina A-CDK2, almeno in vitro. Sebbene abbiamo trovato differenze qualitative nella capacità della ciclina A-CDK2 e della ciclina B-CDK1 di fosforilare proteine specifiche, in ogni caso i candidati sono stati fosforilati da entrambi i CDK. Poiché la preparazione enzimatica che abbiamo usato in questi studi conteneva un eccesso di CDK2 libero (F80A), abbiamo considerato la possibilità che alcune fosforilazioni del substrato potessero derivare dall’associazione di cicline endogene con CDK2 (F80A) che era monomerica o che potrebbe essersi dissociata dalla ciclina A durante le condizioni del test. Abbiamo scoperto che la quantità di attività della ciclina B-CDK2 (F80A) in questi estratti era trascurabile rispetto alla ciclina A-CDK2 (F80A) e non siamo riusciti a rilevare alcuna attività della ciclina E-CDK2 (F80A) (file di dati aggiuntivi 7). Tuttavia, non possiamo escludere la possibilità che alcuni peptidi possano essere stati fosforilati da CDK2 (F80A) in complesso con una ciclina endogena e la specificità di qualsiasi substrato candidato per la ciclina A rispetto ad altre cicline che attivano CDK2 deve essere convalidata come descritto di seguito.
Validazione in vitro di substrati candidati selettivi CDK2. (a) Le cellule HEK293 sono state transitoriamente trasfettate con vettori che esprimono EF2, TRF2 e RAP1 contrassegnati con FLAG. Gli immunoprecipitati anticorpali anti-FLAG sono stati fosforilati in vitro con ciclina A-CDK2 o ciclina B-CDK1 in presenza di γ-32P-ATP (pannelli in alto a sinistra). Nelle reazioni parallele, l’istone H1 è stato fosforilato come controllo per normalizzare le attività della ciclina A-CDK2 e della ciclina B-CDK1 (pannello destro). “C” indica le reazioni “solo chinasi” senza substrati transfettati (pannello di sinistra) e “nessuna chinasi” (pannello di destra). I campioni di proteine sono stati separati da SDS PAGE e i gel sono stati trasferiti su membrane PVDF. I fosfo-segnali sono stati visualizzati dall’autoradiografia. La membrana è stata successivamente sondata con anticorpo anti-FLAG (Sigma-Aldrich) per confermare l’identità della banda portante del fosfosegnale (pannelli in basso a sinistra). L’asterisco rappresenta una banda non specifica della preparazione commerciale della ciclina B-CDK2. (b) La reazione della chinasi è stata effettuata usando γ-32P-ATP e GST-TRF2, GST-RAP1, GST-Rb (controllo positivo) e GST (controllo negativo) come substrati in presenza o assenza della chinasi wild-type della ciclina A-CDK2. Le reazioni sono state visualizzate dalla pagina SDS seguita dalla colorazione di Coomassie e dall’autoradiografia (pannello di sinistra). Un test di chinasi simile è stato effettuato utilizzando ciclina wild-type A / CDK2 e ATP-γ-S e successivamente sottoposto a uno schema di isolamento del fosfopeptide. L’analisi del MS ha confermato che TRF2 e RAP1 sono stati fosforilati ciascuno sui siti esatti che abbiamo identificato dallo schermo con un sito aggiuntivo per RAP1 (pannello di destra). (c) Il test della chinasi è stato effettuato utilizzando γ-32P-ATP, ciclina A-CDK2 o ciclina B-CDK1 con quantità crescenti di GST-RL12 purificato. I campioni sono stati separati da SDS PAGE e il gel è stato macchiato con Coomassie (pannello inferiore) seguito da autoradiografia (pannello superiore). “C” indica le reazioni “solo chinasi” senza substrati transfettati.
Convalida di RL12 come substrato in vivoCDK2
Gli studi di cui sopra hanno convalidato diversi nuovi candidati identificati nel nostro schermo come substrati CDK2 in vitro. Tuttavia, per determinare se un nuovo substrato è anche fosforilato da CDK2 in vivo, abbiamo eseguito un’analisi più completa della proteina ribosomiale RL12. Per prima cosa abbiamo mescolato immunoprecipitati di ciclina A-CDK2 e RL12 etichettati con epitopi espressi in cellule umane in presenza di γ-32P-ATP e abbiamo scoperto che la ciclina A-CDK2 ha fosforilato RL12 in vitro (Figura 5a). La fosforilazione è stata in gran parte abolita in un mutante RL12 dove la fosfoserina S38 identificata è stata sostituita con un’alanina, ed è stata ripristinata quando S38 è stata sostituita con una treonina (Figura 5b). Abbiamo quindi utilizzato la mappatura del fosfopeptide per identificare il peptide contenente S38 e abbiamo confermato che è stato direttamente fosforilato da CDK2 in vitro (Figura 5c). Per verificare se RL12 è anche fosforilato in vivo in modo CDK2-dipendente nello stesso sito, abbiamo etichettato metabolicamente le cellule con 32P-ortofosfato e immunoprecipitato wild-type o RL12-S38A da cellule che sovraesprimono la ciclina E-CDK2, la ciclina E-CDK2 cataliticamente inattiva o l’inibitore CDK p21 (per inibire i CDK endogeni) . Poiché non è possibile studiare la fosforilazione endogena di RL12 a causa della mancanza di un adeguato anticorpo anti-RL12, questi studi hanno esaminato la fosforilazione di RL12 ectopico in vivo (queste condizioni di trasfezione hanno portato a una sovraespressione di circa cinque – dieci volte dell’mRNA RL12 (file di dati aggiuntivi 8). Abbiamo scoperto che RL12 wild-type, ma non RL12-S38A, è stato fosforilato in vivo (Figura 5d). Questa fosforilazione è stata migliorata nelle cellule che sovraesprimevano la ciclina E-CDK2, ma non la ciclina E-CDK2 inattiva, ed è stata diminuita nelle cellule che sovraesprimevano l’inibitore CDK p21 (che inibisce la ciclina-CDK endogena; Figura 5d). Infine, abbiamo utilizzato la mappatura del fosfopeptide e le analisi del fosfoammino acido della proteina RL12 immunoprecipitata dalle cellule etichettate e abbiamo confermato che la fosforilazione di RL12 da parte della ciclina E-CDK2 in vivo si è verificata anche su S38 (Figura 5e). La fosforilazione RL12 S38 in vivo è stata riportata anche negli studi sui fosfoproteomi .
Fosforilazione di RL12 in vitro e in vivo. (a) RL12 o vector control (“vec”) con etichetta HA sono stati transitoriamente trasfettati in cellule U2OS e immunoprecipitati utilizzando anticorpi 12CA5. Anche i complessi di ciclina A-CDK2 sono stati espressi transitoriamente separatamente nelle cellule U2OS e immunoprecipitati utilizzando un anticorpo contro la ciclina A. I saggi di chinasi sono stati effettuati utilizzando l’immunoprecipitato RL12 (o di controllo) con o senza l’immunoprecipitato di ciclina A-CDK2 in presenza di γ-32P-ATP. (b) Saggi simili sono stati condotti utilizzando immunoprecipitati di ciclina A-CDK2 e RL12 contenenti wild-type (wt) e i mutanti fosfositi RL12 indicati. L’asterisco indica la catena leggera dell’anticorpo. (c) Mappatura dei fosfopeptidi e analisi dei fosfoamminoacidi del wild-type radiomarcato (pannello di sinistra) e del mutante S38T (pannello di destra) di RL12. (d) Wild-type RL12, RL12-S38A, o controllo vettoriale è stato transitoriamente co-transfected con ciclina E-CDK2, catalytically inactive (dn) ciclina E-CDK2, o p21. Tutte le cellule sono state sottoposte a etichettatura ortofosfato 32P. RL12 è stato immunoprecipitato da lisati cellulari e visualizzato dalla pagina SDS seguita da autoradiografia. (e) L’analisi di mappatura dei fosfopeptidi è stata effettuata anche sull’RL12 radiomarcato mostrato in (d). La freccia in basso mostra un secondo e minore sito di fosforilazione rilevato in vivo.
Sebbene abbiamo convalidato ciascuno dei nuovi candidati che abbiamo testato finora dimostrando che le proteine a lunghezza intera sono fosforilate da CDK2, alcuni candidati sulla nostra lista probabilmente non saranno fisiologicamente rilevanti substrati ciclina A-CDK2. Ad esempio, le reazioni di chinasi sono state eseguite nei lisati e la compartimentazione subcellulare in vivo può limitare l’accesso di CDK2 ad alcuni candidati. Inoltre, è possibile che altre chinasi cellulari siano ridondanti o più importanti di CDK2 rispetto ai singoli substrati in vivo. È quindi fondamentale che i candidati siano valutati rigorosamente in un contesto il più fisiologico possibile. A tal fine, negli studi in corso stiamo utilizzando un approccio di targeting genetico per mutare un sottoinsieme di questi siti di fosforilazione nei geni endogeni per studiarne il significato fisiologico.
