di cellule Umane marcatore di superficie di screening

hESC e hPSC-cellule RPE erano dissociati in singole celle utilizzando TrypLE per 5-10 min. Le vescicole ottiche sono state dissociate in singole cellule utilizzando TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) per 10 min, seguita da dissociazione fisica attraverso un ago da 20 G. Per consentire l’analisi simultanea di queste diverse popolazioni nello stesso campione, le cellule hESC, hPSC-RPE e le cellule della vescicola ottica sono state etichettate con CellTrace™ CFSE (0,25 µM) per 7 min a 37 °C o CellTrace™ Violet (5 µM) per 20 min a 37 °C seguendo il protocollo del produttore (Thermo Fisher Scientific). Quindi, i tre tipi di cellule sono stati colorati utilizzando i pannelli di screening BD Lyoplate™ (BD Biosciences) seguendo il protocollo del produttore. Il codice a barre delle cellule ha permesso di distinguere facilmente tra i tre gruppi di cellule e di ridurre al minimo la variabilità del campione durante lo screening. I campioni sono stati analizzati su piastre a 96 pozzetti su un LSRFortessa dotato di laser 405, 640, 488, 355 e 561 nm (BD Biosciences) o un CytoFLEX dotato di laser 405, 638, 488 e 561 nm (Beckman Coulter). Le cellule non vitali sono state escluse dall’analisi utilizzando il colorante acido nucleico 7-AAD (7-amminoacinomicina D) (BD Biosciences). L’analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software FlowJo v. 10 (Tree Star). Lo schermo del marcatore della superficie cellulare è stato eseguito una volta per le vescicole ottiche 3D e una volta per hPSC-RPE day 60.

Coltura cellulare

Le linee hESC HS980 e HS983 sono state precedentemente derivate e coltivate in condizioni definite e prive di xeno30 (Swedish Ethical Review Authority: 2011/745:31/3). I donatori hanno dato il loro consenso informato per la derivazione e il successivo utilizzo delle linee hESC. La linea WA09 / H9 hESC è stata ottenuta da Wicell ed è stata adattata alla coltura senza alimentatore su hrLN-521 (10 µg/mL, Biolamina). Le cellule sono state mantenute mediante propagazione clonale su piastre rivestite di hrLN-521 nel mezzo NutriStem hPSC XF (Biological Industries), in un incubatore di 5% CO2/5% O2 e passate enzimaticamente in rapporto 1:10 ogni 5-6 giorni.

Le linee hiPSC CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I e CTRL-14-II sono state gentilmente fornite dal Karolinska Institutet iPSC Core facility (Swedish Ethical Review Authority: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). I donatori hanno dato il loro consenso informato per la derivazione e il successivo uso delle linee hiPSC. Le cellule sono state mantenute mediante propagazione clonale su piastre rivestite di hrLN-521 (Biolamina) nel mezzo NutriStem hPSC XF (Biological Industries), in un incubatore di 5% CO2/5% O2 e passate enzimaticamente in rapporto 1:10 ogni 5-6 giorni.

Per il passaggio, le colture confluenti sono state lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza Ca2+ e Mg2+ e incubate per 5 min a 37 °C, 5% CO2 / 5% O2 con TrypLE Select. L’enzima è stato quindi accuratamente rimosso e le cellule sono state raccolte in mezzo NutriStem hPSC XF fresco pre-riscaldato mediante pipettaggio delicato per ottenere una sospensione monocellulare. Le celle sono state centrifugate a 300 × g per 4 min, il pellet risospeso in fresco pre-riscaldato NutriStem hPSC XF medio, e le cellule placcato su un piatto appena hrLN-521 rivestito. Due giorni dopo il passaggio, il mezzo è stato sostituito con un mezzo NutriStem hPSC XF fresco pre-riscaldato e cambiato quotidianamente.

Differenziazione monostrato hPSC-RPE

Un protocollo passo-passo che descrive il protocollo di differenziazione può essere trovato in Protocol Exchange36. hESC o hiPSC sono stati placcati a una densità cellulare di 2,4 × 104 celle / cm2 su piatti rivestiti di laminina (20 µg/mL) utilizzando il mezzo NutriStem hPSC XF. Inibitore della rho-chinasi (Y-27632, Millipore) ad una concentrazione di 10 µM è stato aggiunto durante le prime 24 h, mentre le cellule sono state mantenute a 37 °C, 5% CO2/5% O2. Dopo 24 ore, il mezzo hPSC è stato sostituito con il mezzo di differenziazione NutriStem hPSC XF senza fattore di crescita del fibroblasto di base (bFGF) e fattore di crescita trasformante-β (TGFß) (industrie biologiche) e le cellule sono state collocate a 37 °C, 5% CO2/21% O2. Dal giorno 6 dopo la placcatura, 100 ng/mL di Activin A (R&D Systems) è stato aggiunto al supporto. Le cellule sono state alimentate tre volte a settimana e conservate per 30 giorni. I monostrati sono stati quindi tripsinizzati utilizzando TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) per 10 min a 37 °C, 5% CO2. L’enzima è stato accuratamente rimosso e le cellule sono state raccolte in terreno NutriStem hPSC XF fresco pre-riscaldato senza bFGF e TGFß mediante pipettaggio delicato per ottenere una sospensione monocellulare. Le cellule sono state centrifugate a 300 × g per 4 min, il pellet è stato risospeso, passato attraverso un filtro cellulare (ø 40 µm, BD Biosciences) e le cellule sono state seminate su piatti rivestiti di laminina (hrLN-111 e hrLN-521 a 20 mg/mL) a diverse densità cellulari che vanno da 1,4 × 106 a 1,4 × 104 cellule/cm2. Le cellule reimpiegate sono state alimentate tre volte alla settimana durante i successivi 30 giorni con NutriStem hPSC XF medium senza bFGF e TGFß. Per la differenziazione hPSC-RPE in vitro nella sospensione 3D EBs, abbiamo seguito il nostro protocollo precedentemente pubblicato10. In breve, le cellule staminali pluripotenti sono state coltivate per confluire su rhLN-521 e raschiate manualmente per produrre EBs utilizzando una punta di pipetta da 1000 µL. Le EBs sono state quindi coltivate in sospensione in piastre di attacco basse (Corning) ad una densità di 5-7 × 104 celle/cm2. La differenziazione è stata eseguita in NutriStem hESC XF medium su misura in cui bFGF e TGFß sono stati eliminati con il cambio del supporto due volte a settimana. Dieci micromoli di inibitore della Rho-chinasi (Y-27632, Millipore) sono stati aggiunti alle colture di sospensione solo durante le prime 24 h. Dopo la differenziazione di 5 settimane, le aree pigmentate sono state tagliate meccanicamente dall’EBs usando un bisturi. Le cellule sono state quindi dissociate usando TrypLE Select, seguita da un lavaggio attraverso un ago e una siringa da 20 G. Le cellule sono state seminate attraverso un filtro cellulare (ø 40 µm, BD Biosciences) su piatti rivestiti di LN ad una densità cellulare di 0.6-1, 2 × 104 cellule / cm2 e alimentato due volte a settimana con lo stesso mezzo di differenziazione di cui sopra. Le immagini di campo luminoso sono state acquisite con un microscopio Nikon Eclipse TE2000-S e una fotocamera Canon SX170 IS è stata utilizzata per catturare la pigmentazione dalla parte superiore dei pozzetti.

PCR quantitativa in tempo reale

L’RNA totale è stato isolato utilizzando il mini kit RNeasy Plus e trattato con DNasi libera da RNasi (entrambi da Qiagen). DNA complementare (cDNA) è stato sintetizzato utilizzando 1 µg di RNA totale in miscela di reazione 20 µL, contenente esameri casuali e apice III trascrittasi inversa (Gibco, Invitrogen), secondo le istruzioni del produttore.

Citometria a flusso

Lo smistamento cellulare è stato eseguito su colture hPSC-RPE dopo 21 o 30 giorni di differenziazione. Le cellule sono state incubate con gli anticorpi coniugati menzionati su ice per 30 min. I controlli FMO sono stati inclusi per ogni condizione per identificare e cellule gate-negative e-positive. Le celle colorate sono state quindi ordinate utilizzando un BD FACS Aria Fusion Cell Sorter (BD Biosciences) utilizzando il FACSDiva Sofware v8.0.1.

Subito dopo la cernita, 70.000 cellule diluite in 100 µL di 2% FBS e 1 mM EDTA (Sigma) sono state citospinate per 5 minuti a 400 giri / min su vetrini. I vetrini sono stati lasciati asciugare durante la notte a temperatura ambiente, seguita da fissaggio con 4% di formaldeide priva di metanolo a temperatura ambiente per 10 min e colorazione immunofluorescenza.

Immunofluorescenza

Istologia e immunotenenti tissutali

Immediatamente dopo l’eutanasia mediante iniezione endovenosa di 100 mg / kg di pentobarbital (Allfatal vet. 100 mg/mL, Omnidea), gli occhi sono stati enucleati e l’area di iniezione del bleb è stata contrassegnata con un colorante verde per la marcatura dei tessuti (TMD) (Prodotti di Histolab). Un’iniezione intravitreale di soluzione di fissaggio 100 µL (FS) costituita da formaldeide tamponata al 4% (Solvenco AB) è stata eseguita prima della fissazione in FS per 24-48 h e dell’incorporamento in paraffina. Le sezioni seriali a quattro micrometri sono state prodotte attraverso l’area etichettata con TMD e ogni quattro sezioni sono state colorate con ematossilina-eosina.

Per l’immunotenente, i vetrini sono stati deparaffinizzati in xilene, disidratati in alcoli graduati e risciacquati con ddH2O e soluzione salina tamponata con Tris (TBS, pH 7.6). Il recupero dell’antigene è stato ottenuto in tampone citrato da 10 mm (citrato trisodico diidrato, Sigma-Aldrich, pH 6.0) con 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) a 96 °C per 30 min, seguito da 30 min di raffreddamento a temperatura ambiente. I vetrini sono stati lavati con TBS e bloccati per 30 minuti con il 10% di siero d’asino normale (Abcam) diluito in TBS contenente il 5% (p/v) di IgG e albumina bovina libera da proteasi (Jackson Immunoresearch) in una camera umidificata. Primaria anticorpi diluito in blocco buffer sono state incubate overnight a 4 °C: uomo nucleare apparato mitotico proteine (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432), e CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clone ) (Dati Supplementari 2). Anticorpi secondari (asino anti-coniglio IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 e asino anti-topo IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, entrambi da Thermo Fisher Scientific) (Dati supplementari 2) diluito 1: 200 in tampone di blocco sono stati incubati 1 h a temperatura ambiente. Le sezioni sono state montate con vector Vectashield con supporto di montaggio DAPI ((4′,6-diamidino-2-fenilindolo) (Vector Laboratories) sotto un coprioggetto 24 × 50 mm2.

Per immunoistochimica, diapositive sono state deparaffinized seguita da antigen retrieval (ER2 soluzione a pH 9, 20 min, Leica Biosystems) e di colorazione (IHC Protocollo F) per CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) e CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clone ) anticorpi (Dati Supplementari 2) Obbligazioni RXm strumento (Leica Biosystems).

Le immagini sono state scattate con Olympus IX81 fluorescence inverted microscope o Zeiss LSM710-NLO point scanning confocal microscope. L’analisi post-acquisizione delle immagini è stata eseguita utilizzando il software ImageJ.

Analisi di fagocitosi

I POSS bovini marcati con isotiocianato di fluoresceina sono stati isolati e gentilmente dati dal Dr. E. F. Nandrot dell’Institut de la Vision, Paris37. Le cellule hPSC-RPE sono state coltivate sulla membrana transwell (0,33 cm2, Corning) rivestita con hrLN-521 20 µg/mL per 1 mese dopo la semina. Le cellule sono state incubate a 37 ° C o 4 °C per 16 ore con 2,42 × 106 POS/Transwell scongelati diluiti in DMEM (mezzo di Eagle modificato di Dulbecco) o mezzi indipendenti dalla CO2 (entrambi da Thermo Fisher Scientific), rispettivamente. Dopo l’incubazione, le cellule sono state spente con Trypan Blue Solution 0.2% (Gibco, Invitrogen) per 10 min a temperatura ambiente, fissato con 4% di formaldeide libera da metanolo (Poliscienze) a temperatura ambiente per 10 min e permeabilizzato con 0,3% Triton X-100 in D-PBS per 15 min. Rhodamine phalloidin colorazione (1: 1000, 20 min a temperatura ambiente, Biotinum 00027) (Dati supplementari 2) è stato utilizzato per visualizzare i confini cellulari. I nuclei sono stati colorati con Hoechst 33342 (1: 1000, 20 min a temperatura ambiente, Invitrogeno).

Le immagini sono state acquisite con il microscopio confocale a scansione puntuale Zeiss LSM710-NLO. L’analisi post-acquisizione delle immagini è stata eseguita utilizzando Imaris (Bitplane) e le quantificazioni POS sono state effettuate con il software CellProfiler 2.1.1. Moduli utilizzati: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages e ExportToSpreadsheet. Gli oggetti sono stati identificati da un diametro tipico di 10-40 unità di pixel utilizzando due classi, Globale, Otsu, metodo di soglia di varianza ponderata con limiti inferiori e superiori 0.01 e 1.0 e fattore di correzione 2.1, con oggetti raggruppati distinti per intensità.

Saggio immunoassorbente legato all’enzima

Le cellule hPSC-RPE sono state coltivate su membrane Transwell (0,33 cm2, Millipore) rivestite con substrati diversi. Supernatanti da entrambi i lati apicale e basale hPSC-RPE (che significa compartimenti superiore e inferiore del transwell, rispettivamente) sono stati raccolti 60 h dopo il mezzo è stato cambiato. I livelli di secrezione di PEDF sono stati misurati in triplicati per ogni condizione con kit ELISA PEDF umani disponibili in commercio (BioVendor RD191114200R) sono stati utilizzati, in conformità con le istruzioni del produttore, dopo 60 giorni di coltura. La densità ottica Sreadings sono stati misurati utilizzando SpectraMax 250 Micropiastre Reader (dispositivi molecolari). I risultati sono presentati come media ± SEM.

Le misurazioni TEER

Le celle transepiteliali di resistenza elettrica RPE placcate su Transwell (0,33 cm2, millipore) sono state misurate utilizzando il misuratore volt-ohm del sistema di resistenza elettrica Millicell (Millicell XT-2, Millipore), secondo le istruzioni del produttore. Le colture di sessanta giorni sono state equilibrate all’esterno dell’incubatore a temperatura ambiente per 15-20 minuti prima dell’esperimento. Le misurazioni sono state eseguite in terreni di coltura invariati in triplice copia per ogni condizione, in tre diverse posizioni di ciascun pozzo. Le medie sono state utilizzate per ulteriori analisi. La resistenza di fondo è stata determinata da un inserto di coltura vuoto nello stesso supporto rivestito con il substrato corrispondente ma senza celle e sottratta dalla rispettiva condizione di esperimento. Le misurazioni sono riportate come resistenza in ohm volte l’area in centimetri quadrati (Ω × cm2). I risultati sono presentati come media ± SEM.

Microscopia elettronica a scansione

Le cellule hPSC-RPE sono state coltivate su inserti transwell rivestiti con LN521 (20 µg / mL) per 60 giorni. Sono stati fissati per immersione in glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato da 0,1 M, pH 7,4. La membrana transwell è stata tagliata e lavata in acqua MilliQ prima della disidratazione graduale dell’etanolo e dell’essiccazione del punto critico utilizzando anidride carbonica (Leica EM CPD 030). Gli inserti sono stati montati su stub di campioni utilizzando linguette adesive in carbonio e sputter rivestito con un sottile strato di platino (Quorum Q150T ES). Le immagini di microscopia elettronica a scansione sono state acquisite utilizzando un microscopio elettronico a scansione a emissione di campo Ultra 55 (Zeiss, Oberkochen, Germania) a 3 kV e il rivelatore SE2.

Microscopia elettronica a trasmissione

Le cellule hPSC-RPE sono state coltivate su inserti transwell rivestiti con LN521 (20 µg / mL) per 60 giorni. Sono stati fissati per immersione in glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato da 0,1 M, pH 7,4. La membrana transwell è stata tagliata e tagliata a strisce sottili, risciacquata in tampone fosfato da 0,1 M, seguita da post fissazione in tetrossido di osmio al 2% in tampone fosfato da 0,1 M, pH 7,4, a 4 °C per 2 h. Le strisce di membrana sono state sottoposte a disidratazione graduale dell’etanolo e infine piatte incorporate in LX-112. Sezioni ultrasottili (~50-60 nm) sono state preparate utilizzando un Leica EM UC7 e contrastate con acetato di uranile, seguito da citrato di piombo. L’imaging a microscopia elettronica a trasmissione è stato eseguito su un microscopio elettronico a trasmissione Hitachi HT7700 (Hitachi High-Technologies) operato a 80 kV e le immagini digitali sono state acquisite utilizzando una telecamera CCD Veleta (Olympus Soft Imaging Solutions).

Analisi bioinformatica a sequenza di RNA unicellulare

Le cellule hPSC-RPE di sessanta giorni sono state dissociate utilizzando TrypLE Select e passate attraverso un filtro cellulare (ø 40 µm, BD Biosciences). Sono stati risospesi ad una concentrazione di 1000 cellule / µL in 0,04% BSA in PBS. Le cellule sono state trasportate a 4 °C alla struttura di genomica a cellule singole eucariotiche (ESCG, SciLifeLab, Stoccolma, Svezia) dove è stata preparata una libreria cDNA da 3′ per il sequenziamento dell’RNA a cellule singole con la piattaforma genomica 10x (10x Genomics) utilizzando il software NovaSeq 6000. Cella Ranger 2.1.La pipeline 1 (10x Genomica) è stata utilizzata per convertire i file di chiamata Illumina base in formato fastq, allineare le letture di sequenziamento al trascrittoma hg19 utilizzando STAR aligner38 e generare matrici di codici a barre di funzionalità. Le celle filtrate per il controllo della qualità di Cell Ranger (718, 810, 931 e 1129 goccioline contenenti cellule sono state catturate per CD140b+GD2 -, CD140b+CD184−, campioni 1:20 e hESC, rispettivamente replicati) sono state analizzate nella versione R 3.5.1 (R Core Team)39, utilizzando Seurat suite versione 2.3.440, 41. Come ulteriore misura di controllo della qualità, sono state selezionate cellule RPE con geni espressi in modo univoco (da≥2000 a ≤5000), UMI (da≥10.000 a ≤30.000) e percentuale di mappatura UMI ai geni MT (da≥0,025 a ≤0,10). Allo stesso modo, hESC con geni espressi in modo univoco (≥2000 a ≤8000), UMI (≥10.000 a ≤80.000) e percentuale di mappatura UMI ai geni MT (≥0,025 a ≤0,10). Questa fase di filtrazione ha prodotto un set di dati finale di 616, 725, 779 e 905 celle per CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, campioni 1:20 e hESC replicati, rispettivamente. Prima della riduzione della dimensionalità mediante analisi della componente principale (PC), la variazione cellulare–cellulare nell’espressione genica guidata da UMIS, espressione genica mitocondriale e stadi del ciclo cellulare erano regrediti durante il processo di scalatura dei dati42. I geni variabili all’interno dei campioni RPE sono stati selezionati in base alla loro espressione e dispersione media normalizzata (cut-off di espressione = 0,0125–5 e cut-off di dispersione inferiore = 0,5). Per la selezione del PC sono stati valutati i risultati di PCHeatmap, jackStraw, deviazioni standard del PC e analisi di Clustre43. I primi 15 PC sono stati utilizzati per la proiezione tsne44 e l’analisi di clustering (risoluzione = 0.1, perplessità = 40).

I cluster di celle sono stati analizzati con due approcci. I migliori geni differenziali sono stati identificati per la prima volta per ciascun cluster utilizzando il test rank-sum di Wilcoxon. L’espressione genica secondaria (punteggi dei moduli) è stata calcolata per hESC indifferenziato e diversi tipi di cellule presenti nella retina umana. Le cellule che esprimono i marcatori del mesoderma sono state suddivise manualmente in un cluster separato utilizzando le funzionalità di stampa interattiva di Seurat. I dati vengono caricati in ArrayExpress (EMBL-EBI)—vedere i dettagli di seguito.

Animali

Dopo l’approvazione da parte del Comitato etico sperimentale degli animali del Nord di Stoccolma (DNR N25 / 14), 10 conigli albini bianchi della Nuova Zelanda (forniti da Lidköpings rabbit farm, Lidköping, Svezia) di età compresa tra 5 mesi, del peso di 3,5 e 4,0 kg sono stati utilizzati in questo studio. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione per l’uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.

Trapianto subretinico

I monostrati hPSC-RPE sono stati lavati con PBS, incubati con TrypLE e dissociati in sospensione unicellulare. Le cellule sono state contate in una camera emocitometrica di Neubauer utilizzando lo 0,4% di Trypan blue (Thermo Fisher Scientific Corp.), centrifugate a 300 × g per 4 min, e il pellet cellulare è stato risospeso in PBS appena sterilizzato con filtro ad una concentrazione finale di 1000 cellule/µL. La sospensione cellulare è stata quindi asetticamente aliquota in unità 600 µL e mantenuta sul ghiaccio fino all’intervento chirurgico.

Gli animali sono stati sottoposti ad anestesia generale mediante somministrazione intramuscolare di 35 mg/kg di ketamina (Ketaminolo, 100 mg/mL, Intervet) e 5 mg/kg di xilazina (Rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health), e le pupille sono state dilatate con una miscela di 0,75% ciclopentolato / 2,5% fenilefrina (APL). Le microchirurgie sono state eseguite su entrambi gli occhi utilizzando una tecnica di pars plana transvitreale a 2 porte da 25 G (Alcon Accurus, Alcon Nordic) come descritto in precedenza45. La sospensione cellulare è stata aspirata in una siringa da 1 mL collegata a un tubo di prolunga e a una cannula politip da 38 G (MedOne Surgical Inc). Senza precedente vitrectomia, la cannula è stata inserita attraverso il trocar temporale superiore. Dopo un corretto posizionamento della punta, accertato da un flare retinico focale, 50 µL di sospensione cellulare (equivalenti a 50.000 cellule) sono stati iniettati lentamente subretinalmente ~6 mm sotto il margine inferiore della testa del nervo ottico, formando un bleb uniforme chiaramente visibile al microscopio operatorio. Si è fatto attenzione a mantenere la punta all’interno del bleb durante l’iniezione per ridurre al minimo il reflusso. Dopo la rimozione dello strumento, è stata applicata una leggera pressione alle sclerotomie autosigillanti senza sutura. Due microgrammi (100 µL) di triamcinolone intravitreale (Triescenza, Alcon Nordic) sono stati somministrati 1 settimana prima dell’intervento e non sono stati somministrati antibiotici post-chirurgici.

Statistiche e riproducibilità

Per le analisi statistiche, sono state eseguite analisi bidirezionali della varianza e confronti multipli post hoc utilizzando la correzione del test di Tukey per valutare le differenze in vitro delle diverse densità valutate e l’ordinamento rispetto alle condizioni replicate nei saggi di secrezione TEER e PEDF.

Tutte le quantificazioni sono state eseguite in cieco. Parametri statistici tra cui le definizioni e il valore esatto di n (ad esempio, numero totale di esperimenti, repliche, ecc.), le deviazioni, i valori P e i tipi di test statistici sono riportati nelle figure, nelle corrispondenti legende di figura e in questa sezione. L’analisi statistica è stata effettuata utilizzando Prism 7 (Software GraphPad, versione 7.0 c). In tutti i casi, l’analisi statistica è stata condotta su dati di almeno tre repliche sperimentali biologicamente indipendenti. I confronti tra i gruppi sono stati pianificati prima dei test statistici e le dimensioni degli effetti target non sono state predeterminate. Le barre di errore visualizzate sui grafici rappresentano la media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. Tutte le micrografie mostrate sono immagini rappresentative di tre esperimenti indipendenti, se non diversamente specificato (ad esempio, Fig. 1c).

Reporting summary

Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.