le Note di Laboratorio per 1003 BIO
© 30 agosto 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Olanda
ENZIMI
Proteine Che Agiscono Come Catalizzatori
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le Cellule non hanno le opzioni di calore e vigorosa agitazione per accelerare le reazioni chimiche, facendo gli atomi e le molecole urtano più spesso e con più forza. Invece fanno catalizzatori proteici chiamati enzimi che forniscono superfici su cui reagenti incontrano l’un l’altro nel corretto orientamento, e gli enzimi possono anche indebolire i legami che devono essere rotti. Gli enzimi hanno un’alta specificità only solo reagenti specifici si adatteranno sulle loro superfici e bilanceranno le cariche superficiali locali del luogo chiamato sito attivo. Il particolare insieme di reagenti per un enzima sono chiamati suoi substrati. Gli enzimi, come tutti i catalizzatori, non vengono modificati dalla reazione che catalizzano; pertanto, quando tutti i reagenti sono stati convertiti in prodotti, le molecole enzimatiche originali rimangono.
La funzione enzimatica dipende dall’ambiente in cui si verifica la reazione. Fattori come la temperatura e il pH possono influenzare notevolmente la capacità di un enzima di fare il suo lavoro. La seguente serie di esperimenti illustra i principi delle reazioni catalizzate enzimaticamente nei sistemi biologici. Useremo l’enzima catecolasi (o catecol ossidasi) che è comune nelle piante; è presente nel succo di patata appena spremuto che è stato fornito. I substrati della catecolasi sono catecolo e ossigeno. I substrati reagiscono l’uno con l’altro all’interno del sito attivo dell’enzima. I prodotti formati da questa reazione sono benzochinone e acqua; poiché il benzochinone ha un colore marrone, puoi vedere che la reazione ha avuto luogo. Questa è chiamata la reazione di doratura della frutta. Il benzochinone inibisce la crescita di microrganismi e impedisce alla frutta danneggiata di marcire. Nelle cellule intatte la catecolasi viene immagazzinata nelle vescicole e non interagisce con il catecolo.
In presenza dell’enzima catacholasi:
catecol + ½O2
benzoquinone + H2O
In tutti gli esperimenti seguenti, mescolare gli ingredienti come specificato e mescolare la miscela con un vortex genie o toccando il lato del tubo vicino al fondo; incubare le miscele a 40 gradi C, se non diversamente specificato.
Se dubitavi della purezza dell’enzima, come potresti scoprire se c’è qualcos’altro nell’estratto di patata oltre alla catecolasi?
I. Formazione e rilevazione del benzochinone
Questo esperimento stabilisce gli standard per l’aspetto quando la reazione ha o non ha avuto luogo. Utilizzare acqua distillata dove è indicato H2O.
| Mix | Initial color | Color change (after 5 min) |
| 10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment) |
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| 10 drops potato extract with 10 drops H2O (control) |
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| 10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (control) |
Come definiresti i concetti di un controllo e di un esperimento?
II. Specificità enzimatica
L’idrochinone è strutturalmente simile ma non uguale al catecolo. In questo esperimento vedremo se l’enzima può anche convertirlo in benzochinone, o se l’enzima è semplicemente troppo specifico nel suo design per interagire con la molecola simile ma non identica.
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Mix |
Initial color | Color change (after 5 min) |
| 10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol |
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| 10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone |
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| 10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (control) |
L’enxyme può convertire l’idrochinone in benzochinone? Come sei arrivato a questa conclusione?
NOTA: IL TUO GRUPPO FARÀ III O IV – NON ENTRAMBI.
Chiedi al tuo istruttore di laboratorio se il tuo gruppo farà III temperatura o IV pH.
III. Effetto della temperatura sull’attività enzimatica
Gli enzimi sono progettati per funzionare all’interno di un intervallo di temperatura specifico. Potresti fare alcune ipotesi sul risultato per le seguenti temperature al di sotto. Tieni presente che le strutture che producono l’enzima sono frutta e patata; sulla scala di temperatura Celsius 0 gradi è il congelamento, 22 gradi è la temperatura ambiente e 100 gradi sta bollendo. Più è caldo, più rapidamente le molecole vibrano e si muovono. Le collisioni di molecole d’acqua con l’enzima potrebbero annullare la sua struttura piegata che è tenuta in posizione da legami idrogeno; quando questo accade la molecola si dice che sia stata denaturata. Cosa accadrebbe al sito attivo in questo caso? A basse temperature le molecole si muovono molto lentamente e la possibilità che si scontrino e reagiscano l’una con l’altra è molto bassa. Si noti che l’estratto di patata è stato mantenuto sul ghiaccio. Perché?
Annota la tua ipotesi sull’effetto della temperatura sull’attività enzimatica:
Imposta 6 paia di provette con 10 gocce di estratto di patata in un set e 10 gocce di 1% di catecolo nell’altro. Incubarli per 5 minuti, una coppia in ciascuno dei 5 ambienti di temperatura indicati di seguito. Quindi mescolare l’estratto di patata e il catecolo insieme; registra il colore iniziale e rimetti quel tubo negli ambienti a temperatura controllata. Registra di nuovo il colore dopo 5 minuti.
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Temperatura |
colore Iniziale |
cambiamento di Colore |
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0 degrees C |
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22 degrees C |
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40 degrees C |
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60 degrees C |
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80 degrees C |
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100 ° C |
i risultati supportano la tua ipotesi iniziale?
Quali temperature denaturano l’enzima in modo che non possa recuperare.
Qual è il precipitato bianco che si forma a 100 gradi C?
IV. Effetto del pH sull’attività enzimatica
La scala del pH misura il numero di ioni idrogeno (ciascuno con una carica +1) presenti in soluzione. La scala nei sistemi biologici va da 0 (fortemente acido) a 14 (fortemente basico). 7, il punto neutro, è il pH di acqua pura. Ricordiamo che la struttura piegata delle molecole proteiche è in gran parte dovuta al legame di idrogeno tra parti opposte della catena polipeptidica. Altri ioni in soluzione potrebbero sostituire le parti corrispondenti della catena, e farlo venire annullata. Quando ciò accade, cosa ne sarà del sito attivo?
Annota la tua ipotesi sull’effetto dell’intervallo di pH sull’attività enzimatica:
Impostare 7 provette con 40 gocce di una diversa soluzione a pH tamponato in ciascuna. Aggiungere 10 gocce di estratto di patate a ciascuna e mescolare. Quindi aggiungere 10 gocce di catecolo all ‘ 1% a ciascuna e mescolare.
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pH |
Initial color |
Color change (5 min after adding catechol) |
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pH 2 |
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pH 4 |
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pH 6 |
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pH 7 |
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pH 8 |
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pH 10 |
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pH 12 |
Do the results support your hypothesis?
A quale pH o intervallo di valori di pH funziona meglio l’enzima?
Perché mettere il succo di limone sulla frutta appena affettata ritarda la sua doratura?
V. Necessità di cofattori per l’attività enzimatica
Molti enzimi funzionano solo se c’è un cofattore ad essi associato. Catecolasi richiede rame come cofattore. PTU è una sostanza chimica che ha una maggiore affinità per il rame rispetto a catecolasi, e prende il rame lontano dall’enzima. Puoi osservare cosa succede alla funzione dell’enzima quando il suo cofattore viene rimosso. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.
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Mix |
Initial color |
Color change (5 min after adding catechol) |
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Tube A |
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Tube B |
Quale tubo, A o B, è il controllo in questo esperimento?
