Abstract
Il Carbendazim, come fungicida, era comunemente usato per controllare le malattie fungine in agricoltura, silvicoltura e medicinali veterinari. In questo studio, la tossicità acuta e riproduttiva di carbendazim è stata valutata utilizzando Caenorhabditis elegans (C. elegans) come modello al fine di valutare preliminarmente i potenziali rischi di questo fungicida nella produzione e nell’applicazione agricola. I risultati hanno mostrato che la crescita di C. elegans era inibita da 0,01 µg/L di carbendazim. Il trattamento di 0,1 µg/L carbendazim ha causato una significativa diminuzione del comportamento di locomozione e danni significativi al sistema riproduttivo e antiossidante, causando una drastica riduzione della durata della vita dei nematodi. Questi risultati forniscono una migliore comprensione del rischio ambientale di carbendazim e sollevano nuove preoccupazioni per la sicurezza.
1. Introduzione
I pesticidi, una sorta di reagenti chimici o biologici, sono ampiamente utilizzati in agricoltura per regolare la crescita delle piante e controllare le malattie e i parassiti degli insetti, che possono promuovere la crescita delle colture e migliorare la resa delle colture . Tuttavia, l’uso diffuso di pesticidi porterà a diversi gradi di residui nelle colture o negli alimenti e quindi influirà sulla salute umana . I problemi dei residui di antiparassitari non solo hanno attirato grande attenzione dei consumatori, ma sono anche diventati uno dei fattori chiave che influenzano la sicurezza alimentare .
Carbendazim, come fungicida ad ampio spettro, è stato utilizzato per controllare le malattie fungine in agricoltura, silvicoltura e medicinali veterinari . Tuttavia, carbendazim è classificato nella categoria pericolosa delle sostanze chimiche dall’Organizzazione mondiale della sanità ed è stato classificato nell’elenco prioritario delle sostanze chimiche che interferiscono con il sistema endocrino dalla Commissione europea . Negli ultimi anni, è ovvio che l’uso diffuso di carbendazim con eccesso di gamma e sovradosaggio e il fatto che il carbendazim è difficile da degradare portano entrambi al problema dei residui di carbendazim in agricoltura . Sebbene l’effetto tossico del carbendazim sia stato riportato dagli 1980, la tossicità del carbendazim diventa un argomento caldo a causa della crescente preoccupazione per gli interferenti endocrini ambientali . Carbendazim è stato vietato in diversi paesi a causa dei suoi impatti negativi sull’ambiente e sulla salute come disturbi dello sviluppo e della riproduzione, tossicità e mutagenicità . Gli effetti avversi di carbendazim sui parametri biochimici, istopatologici ed ematologici nel fegato, nei reni e nelle ghiandole endocrine e nei loro livelli ormonali sono stati illustrati nei ratti . Inoltre, ha bisogno di ulteriori studi sulla bassa concentrazione dovuta ai residui di carbendazim.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), come un importante modello di ricerca, è ampiamente usato per fare qualche valutazione. Secondo Amrit et al. , C. elegans ha molti vantaggi, quali la piccola dimensione, il tempo rapido della generazione, facile di coltura sul laboratorio e breve durata della vita adulta. C. elegans è stato scelto in questo studio come organismo modello per valutare la tossicità della bassa concentrazione di carbendazim, che può essere considerata un valore di riferimento per l’applicazione del carbendazim in agricoltura.
2. Materiali e metodi
2.1. Sostanze chimiche e ceppi
Carbendazim (purity ≥ 99%; Aladdin® Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, Cina) è stato sciolto in N, N-dimetilformammide (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., srl, Shanghai, Cina) per produrre la soluzione originale di 1 g / L carbendazim. Le concentrazioni di DMF erano dello 0,1% nelle soluzioni di esposizione finale(0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg/L). 0,1% DMF senza carbendazim era il gruppo di controllo. C. elegans (wild-type N2) sono stati originariamente ottenuti dal Caenorhabditis Genetics Center (Università del Minnesota, MN, USA). I nematodi sono stati coltivati su piastre nematode growth medium (NGM) che sono state seminate con Escherichia coli OP50 a 20°C come descritto . L1-larvale C. elegans sono stati raccolti lavando i nematodi gravidi con una miscela sbiancante (1 M NaOH, 10% NaHOCl).
2.2. Letalità
Le soluzioni originali di Carbendazim (1 g/L) sono state diluite con mezzo liquido S (1,12 g K2HPO4, 5,92 g KH2PO4 e 5,85 g NaCl sono state diluite con 1 L di acqua) per ottenere le concentrazioni finali di carbendazim di 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, e 1 mg / L, che conteneva 0,1% DMF. S mezzo liquido con 0,1% DMF era il gruppo di controllo. 30 nematodi (L4) sono stati testati in piastre a 96 pozzetti per ogni concentrazione. La sopravvivenza dei nematodi è stata contata al microscopio dopo aver coltivato per 24 ore nell’incubatrice. Il processo del test si basa sul metodo di Xiang et al. . Erano necessari tre esperimenti paralleli.
2.3. Comportamento della locomozione
Almeno 10 C. elegans (L4) sono stati scelti casualmente da ogni concentrazione per determinare il comportamento della locomotiva, che è stato registrato sia dalla frequenza head-thrash che dai tempi di piega del corpo . Il numero di frequenza head-thrash è stato contato dai cambiamenti nella direzione di piegatura al corpo centrale di C. elegans in 1 min. La misurazione della curva del corpo è stata definita come i tempi dei cambiamenti di direzione della parte dei nematodi coltivati in NGM senza E. coli OP50 nei 30 s.
2.4. Analisi di crescita e sviluppo
C. elegans esposto a carbendazim per 24 h è stato analizzato. La lunghezza corporea dei nematodi esposti al carbendazim è stata valutata dal software Image J. La progenie di ogni C. elegans dalle larve L4 al giorno 1 è stato registrato allo stadio L3 dopo il trasferimento individuale in una nuova piastra ogni giorno fino alla cessazione della riproduzione . Sono stati effettuati almeno tre test paralleli.
2.5. Analisi della durata della vita
Tutti i C. elegans testati per la durata della vita sono stati coltivati nella stessa condizione a 20°C. I C. elegans sincronizzati sono stati coltivati in piastre NGM con diverse concentrazioni di carbendazim fino al giorno 4. I nematodi testati sarebbero quindi trasferiti in nuove piastre NGM ogni 2 giorni. Sopravvissuto e morto C. elegans sono stati registrati ogni giorno (a partire dal primo giorno dell’età adulta) fino a quando tutti i nematodi per ogni concentrazione erano morti . Sono stati effettuati almeno tre test paralleli.
2.6. La determinazione del danno ossidativo
Il ROS intracellulare è stato misurato con 2′,7′-diclorodiidrofluorosceina diacetato (H2DCFH-DA), che è di gran lunga la sonda reattiva di rilevamento dell’ossigeno più comune e sensibile. Il wild-type N2 C. elegans sono stati lavati in tampone M9 e poi ultrasuoni interrotto. Il surnatante è stato analizzato il livello di ROS seguendo le istruzioni del kit ROS. La concentrazione finale di lavoro di H2DCHE-DA era 10 μΜ . Le lunghezze d’onda di eccitazione e di assorbimento delle emissioni erano rispettivamente di 485 nm e 535 nm. Sono stati effettuati almeno tre test paralleli.
La superossido dismutasi totale intracellulare (T-SOD) è stata determinata secondo le istruzioni del kit T-SOD acquistato dall’Istituto di bioingegneria di Nanjing Jiancheng. Dopo aver lavato con M9 tre volte, i nematodi esaminati sono stati interrotti ad ultrasuoni e hanno reagito con un kit T-SOD. La lunghezza d’onda di assorbanza era di 550 nm. Inoltre, il surnatante è stato utilizzato per rilevare il livello di proteina per ogni concentrazione, in cui la lunghezza d’onda di assorbanza era di 595 nm. Sono stati effettuati almeno tre test paralleli.
2.7. Analisi dei dati
Tutti i dati sono stati forniti come errore medio ± standard della media (SEM) utilizzando ANOVA a senso unico. I grafici sono stati presentati utilizzando Origin 8.5 e GraphPad Primer 7 e l’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software SPSS 19.0. Il livello di significatività statistica è stato condotto utilizzando and .
3. Risultati
3.1. Determinazione del comportamento di locomozione di C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
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Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans dopo esposizioni acute carbendazim analizzando i dati sulla frequenza testa-thrash e tempi di piegatura del corpo dei nematodi(Figure 1(a) e 1 (b)). Entrambi hanno mostrato riduzioni significative alle concentrazioni di carbendazim comprese tra 0,01 µg / L e 100 µg / L (). Inoltre, i colpi di testa dei nematodi esposti a 100 µg / L sono diminuiti al 68,27%. Per il test body bends, quando le concentrazioni di carbendazim erano 10 µg/L e 100 µg / L, ha avuto un significativo effetto inibitorio sulle curve del corpo di C. elegans del 36,77% e del 35,48% rispetto a quello di controllo, rispettivamente.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Determinazione della crescita e dello sviluppo di C. elegans dopo Carbendazim Acuta Esposizioni
Rispetto al gruppo di controllo (Figure 1, lettera c) e 1(d)), la lunghezza del corpo e l’area della superficie corporea erano significativamente () ridotto in gruppi di esposizione da 0,01 µg/L a 100 µg/L. Entrambi sono stati diminuiti da 19.16% e 22.15% al trattamento di 0,01 µg/L rispetto al gruppo di controllo, rispettivamente. La concentrazione di 10 µg / L ha presentato gli impatti più negativi e la lunghezza corporea e la superficie corporea di C. elegans sono diminuite rispettivamente del 35,21% e del 65,22% rispetto al gruppo di controllo.
3.3. Determinazione delle dimensioni della covata di C. elegans dopo esposizioni acute di Carbendazim
Secondo la Figura 2, le dimensioni della covata dei nematodi hanno avuto una diminuzione significativa () nei gruppi di trattamento da 0,1 µg/L a 100 µg/L. Le dimensioni della covata di C. elegans sono diminuite in modo significativo, che è diminuita al 43,71% con il trattamento di 10 µg / L rispetto al gruppo di controllo.
3.4. Determinazione della durata della vita di C. elegans dopo esposizioni acute a Carbendazim
La durata della vita di C. elegans è stata significativamente inibita da 0,01 µg/L a 100 µg/L di carbendazim secondo la curva di durata della vita mostrata in Figura 3. I risultati hanno mostrato che la durata della vita di C. elegans è stata ridotta da 24 a 20 giorni con il trattamento di 0,01 µg/L di carbendazim. La durata della vita dei nematodi trattati con 0,01 µg/L di carbendazim è stata ridotta del 20,00%. Quando la concentrazione di esposizione a carbendazim è stata di 100 µg / L, la durata della vita di C. elegans è stata ridotta al massimo del 45,83%.
3.5. Effetti dell’esposizione acuta a Carbendazim sul sistema antiossidante di C. elegans
I livelli di ROS di controllo e C. elegans trattati all’esposizione a carbendazim di diverse concentrazioni sono mostrati nella Figura 4(a). È stato indicato che il livello di ROS intracellulare era significativamente aumentato () a intervalli da 0,01 µg/L a 100 µg/L carbendazim. Rispetto a quello di controllo, il livello di ROS è stato aumentato al massimo del 70,60% con il trattamento di 10 µg/L. Secondo i risultati dei livelli di SOD intracellulare, ha avuto un aumento al trattamento da 0.carbendazim da 01 µg/L a 100 µg/L (Figura 4, lettera b)). Il livello di SOD è stato aumentato del 10,70% a 0,1 µg/L di carbendazim rispetto al gruppo di controllo.
a)
(b)
(a)
(b)
4. Discussione
Carbendazim, come i fungicidi, è ampiamente usato in agricoltura per inibire la crescita del fungo. Carbendazim è stato vietato l’uso in Australia, nella maggior parte dell’Unione europea e negli Stati Uniti a causa della sua grave tossicologia e della sua natura persistente . Per questo studio, è stata la prima volta a utilizzare C. elegans come organismi modello per valutare gli effetti del carbendazim sul comportamento locomotore, crescita e sviluppo, riproduzione, durata della vita e sistemi antiossidanti. Inoltre, i risultati hanno mostrato che ha avuto un’influenza negativa su C. elegans.
Secondo il 24 h-LC50, la concentrazione di tossicità acuta di C. elegans esposta a diverse concentrazioni di carbendazim è 0,867 mg/L. Il 96-h LC50 di carbendazim in risposta al pesce zebra è stato illustrato come 1,75 mg / L . Le uova di carpa prussiana Carassius gibelio hanno mostrato gli effetti di tossicità alla concentrazione di 0,036 mg / L . Gli studi hanno presentato che la crescita e lo sviluppo di Navicula sp. è inibito da carbendazim con un valore di 24 h-EC50 di 2,18 mg/L. Sebbene il tasso di crescita algale sia recuperato dopo l’esposizione di 72 ore, il contenuto di clorofilla-a rimane significativamente diminuito quando il trattamento di carbendazim è stato superiore a 0,5 mg/L . In questo presente, C. elegans esposto a una bassa concentrazione di carbendazim sono stati selezionati per valutare i suoi effetti a seconda della concentrazione effettiva di esposizione giornaliera umana. Basse concentrazioni di carbendazim non significano che sia sicuro. Carbendazim mostra effetti biologici negativi a dosi molto più basse in alcuni studi.
Il comportamento della locomotiva è stato valutato per valutare la neurotossicità di C. elegans (larva L4) dopo un’esposizione di 24 ore a carbendazim. I risultati hanno mostrato che il carbendazim potrebbe avere effetti negativi sul comportamento della locomotiva attraverso la rilevazione di colpi di testa e flessione del corpo di C. elegans, che entrambi erano più sensibili al gruppo di esposizione più elevato. Il comportamento locomotore degli embrioni di zebrafish esposti al carbendazim è sensibile . Studi precedenti hanno dimostrato che i pesci hanno un comportamento anormale quando le concentrazioni subletali di carbendazim sono 0,22-0,43 mg / L .
Malformazioni dello sviluppo potrebbero anche essere una ragione per la locomozione anormale . La crescita e lo sviluppo di C. elegans sono stati analizzati nel nostro studio. I risultati hanno mostrato che la lunghezza corporea e l’area corporea di C. elegans erano significativamente ridotte al trattamento superiore a 0,01 µg/L di carbendazim. La normale crescita dei vertebrati è correlata all’omeostasi metabolica dell’ormone tiroideo . Williams et al. hanno indicato che carbendazim potrebbe causare la perdita di sperma dopo l’impianto, malformazione fetale, e la crescita e lo sviluppo lento.
La tossicità riproduttiva di carbendazim è stata dimostrata che carbendazim potrebbe inibire la polimerizzazione dei microtubuli delle cellule fungine e dei mammiferi, causando la rottura dell’assemblaggio dei microtubuli agendo con β-tubulina, che si traduce in una compromissione della segregazione dei cromosomi nel processo di divisione cellulare . La formazione di microtubuli da legami non covalenti di α-e β-tubulina è responsabile della segregazione cromosomica nel processo di mitosi e meiosi . La dimensione della covata di C. elegans diminuisce significativamente a 0,1 µg/L di concentrazione di carbendazim. Carbendazim è stato trovato per influenzare i sistemi di riproduzione in quaglie giapponesi e criceti . Si è concluso che la durata della vita di C. elegans è stata significativamente ridotta con una concentrazione di carbendazim ≥0,01 µg / L sulla base del nostro studio. Gli studi hanno dimostrato che carbendazim ha portato alla sterilità e tossicità dello sviluppo e manifesta tossicità embrionale, apoptosi delle cellule germinali e teratogenesi in diverse specie di mammiferi .
L’apoptosi è una morte cellulare programmata complessa, che è un fenomeno altamente regolato caratterizzato da una serie di processi cellulari . Molti studi hanno presentato che la produzione di ROS indotta dallo stress ossidativo è correlata alla morte cellulare apoptotica . Il nostro studio ha rilevato che carbendazim potrebbe indurre un aumento significativo del livello dei valori ROS e un piccolo aumento del livello dei valori SOD. Lo stress ossidativo causato dall’inquinamento ambientale induce l’aumentata espressione del ROS e successivamente danneggia il sistema di difesa antiossidante . SOD è responsabile della disintossicazione dei radicali liberi tossici e delle loro attività, che viene utilizzata per valutare il livello di stress ossidativo e lo stato antiossidante cellulare . Metalloenzyme SOD accelera la trasformazione dei radicali citotossici endogeni superossido a H2O2, e l’aumento dei livelli di espressione SOD può contribuire a migliorare le attività enzimatiche al fine di eliminare i radicali superossido indotti da carbendazim e per prevenire il verificarsi di disfunzione cellulare durante l’esposizione di carbendazim . Concentrazioni più elevate di esposizione di carbendazim potrebbero causare grave stress ossidativo, che successivamente distrugge l’equilibrio dell’omeostasi cellulare e promuovere l’apoptosi . Tuttavia, carbendazim a basse concentrazioni potrebbe ancora danneggiare significativamente il sistema riproduttivo secondo i nostri risultati.
5. Conclusione
Per quanto ne sappiamo, il presente studio ha valutato la sicurezza di carbendazim esposto a C. elegans per la prima volta. Ha dimostrato che il carbendazim potrebbe avere un effetto dannoso sul comportamento della locomotiva, sullo sviluppo e sulla crescita, sulla riproduzione, sulla durata della vita e sul sistema antiossidante di C. elegans. Spero che debba prestare maggiore attenzione all’applicazione di carbendazim in base ai risultati. Inoltre, la sicurezza del carbendazim per l’uso deve essere ulteriormente valutata, in particolare la tossicità del bioaccumulo e i potenziali effetti genotossici.
Disponibilità dei dati
Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Riconoscimenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (31501569).
