Contribuito da Paul Barber
Estrazione del DNA tramite Chelex
Chelex è noto per essere come volubile come è a buon mercato e facile. Ecco alcuni suggerimenti per buone amplificazioni:1. A volte i campionilavorare meglio se usato immediatamente, a volte è meglio aspettare una notte prima di usarli. Sperimenta e trova ciò che funziona per la tua specie. I risultati possono variare a seconda dei taxa.2. Quando si eseguono PCR iniziali, eseguire una diluizione seriale del modello.La quantità di estrazione di DNA Chelex utilizzata in una PCR può essere pari alla metà del volume della PCR o inferiore a 1 microlitro di una diluizione 1:10.000. Trovo che 1 microlitro di un 1: 1 è buono per la maggior parte delle applicazioni.3. Se non si ottengono amplificazioni dalla PCR la prima volta con un estratto di Chelex, ripetere la procedura vortex, spin, incubate, vortex, spin, sit overnight descritta sopra. Spesso questo farà funzionare una PCR negativa.
Metodo¶
- Con candeggina, sterilizzare una spatola per reagenti secchi e una piccola barra magnetica.
- Preparare un impasto al 5-10% in peso di resina Chelex100 (parte Biorad 143- 3832,100-200 mesh Chelex, forma di sodio) e acqua HPLC sterilizzata UV. Il modo più efficace per farlo è prendere un tubo sterile falcon da 50 ml, posizionarlo su una scala all’interno di un piccolo becher e azzerare la scala. Quindi aggiungere 5 grammi di Chelex e riempire a 50ml mark con acqua.
La precisione non è critica. La tecnica sterile è.
- Posizionare la barra sterile nel tubo e posizionarla sull’agitatore magnetico. Chelex si deposita rapidamente, quindi se la sospensione non è ben miscelata, le concentrazioni e i risultati saranno variabili. Mantenendo il liquame ben miscelato, aliquota 300-500micro litri in 0,6 o 1,6 ml eppendorf tubi (di nuovo, sterili) e tappo immediatamente. Se si ha accesso a una cappa flusso laminare, che è un buon posto per fare tutto questo. Si consiglia di pulire la bilancia e agitatore con una soluzione di candeggina al 10% e/o UV sterilizzare prima dell’uso.
- Accendere blocco di riscaldamento. Impostare a 95°C. Riempire i fori con acqua.
- Utilizzando una pinza sterile (fiamma sopra bruciatore alcool più volte per sterilizzare), rimuovere un piccolo pezzo di tessuto dal campione. Questo pezzo di tessuto dovrebbe essere abbastanza grande da essere visibile, ma non così grande da essere facilmente visibile. Immagina di tagliare una sezione di 0,2 mm di una graffetta standard. Questo è molto grande. Troppo tessuto può inibire le reazioni.
Sterilizzare le pinze tra i campioni.
- Al termine, effettuare un controllo Chelex negativo immergendo la pinza sterilizzata in un tubo di slurry Chelex.
- Campione di vortice e slurry chelex per 10-15 secondi.
Assicurarsi che i coperchi siano scattati saldamente prima di iniziare.
- Campioni di spin brevemente ad alta velocità in una microcentrifuga
- Incubare i campioni per 20 minuti a 95°C
*La temperatura del blocco potrebbe scendere leggermente durante questo passaggio. Questa goccia è normale. Controllare i tubi durante l’incubazione per garantire che i coperchi non siano spuntati.*
- Vortex campioni di nuovo per 10-15 secondi.
Attenzione perché il vapore può far scoppiare il coperchio della provetta da centrifuga. Tenere i coperchi verso il basso.
- Spin tubi di nuovo ad alta velocità in microcentrifuga.
- I campioni sono pronti per l’uso.
Utilizzare il supernato solo per le reazioni di PCR. Chlex tallone sarà inattivare Taq!
Questo metodo si basa, con il permesso, su un protocollo originale disponibile qui.
