La carota (Daucus carota) è una pianta biennale stagionata in inverno che viene coltivata per il suo fittone commestibile. È una delle verdure più consumate e prodotte a causa della sua varietà dietetica di colore, sapore, fibra e vitamina A, così come il suo consumo sia in forma cruda che cotta. Ogni anno ne vengono prodotte oltre 20 milioni di tonnellate destinate al consumo umano.

Le pratiche di coltura tissutale sono state molto popolari nella clonazione delle piante. Il primo studio sulla coltura del tessuto di carota fu riportato nel 1939 da Gautheret e Nobecourt. Tuttavia, Steward et al. e Reinert ha riportato il primo studio di “embriogenesi della carota”; hanno cercato di far crescere le radici usando la sospensione cellulare e le colture di callo.

L’embriogenesi somatica è un metodo efficace per comprendere e studiare gli aspetti biochimici, fisiologici e genetici della coltura cellulare vegetale.

Molti studi sulla coltura del tessuto di carota hanno portato allo sviluppo di un semplice metodo di embriogenesi nelle carote. Secondo il metodo, la crescita delle colture di carote può essere indotta semplicemente rimuovendo l’ormone 2,4-D dalle colture di sospensione cellulare. Ora, la carota viene spesso utilizzata come modello sperimentale per l’analisi dell’embriogenesi somatica in vari laboratori in tutto il mondo.

Materiale e attrezzature necessarie per l’istituzione della cultura

Materiali sterilizzati

• 5 Coltura di callo friabile di carota, incontaminata e mantenuta a 25 ℃.
• 5 flaconi Erlenmeyer (250 ml), contenenti terreno di coltura con 5 x 10-8 g/ml 2, 4-D.
• 5 cilindri dosatori (100 ml) con tappi di alluminio.
• 2 spatole.
• 25 fogli di alluminio (100 x 100 mm).
• 2 pezzi di nylon, o setacci in acciaio inox con porosità di 250 µm, che possono essere inseriti nell’apertura dei cilindri di misura.
• 5 Petri-piatti.

Non sterilizzati materiali

• Impermeabile penna di marcatura
• il Rotary scuotendo la macchina
• bruciatore Bunsen
• 1 beuta (150 ml) contengono il 95% di etanolo
• Parafilm

Procedura per l’avvio e l’Instaurazione della Cultura

1. Prendere i tubi di callo cultura, sterile bocca di tutti e 5 i tubi e trasferire il callo per la piastra di Petri separatamente (5 calli 5 piastre di Petri).
2. Prendere un pallone canonico da 250 ml contenente i mezzi di coltura e 2, 4-D.
3. Trasferire tutte le 5 calli dalla capsula di Petri a 5 palloni canonici, separatamente.
4. Fiamma / sterilizzare la bocca dei flaconi e coprirli con il tappo. Fissare il tappo utilizzando parafilm.
5. Disponga tutti i palloni che contengono la coltura sulla macchina d’agitazione rotatoria nell’intensità leggera scura o bassa a 25 ℃.
6. Dopo 7 giorni, trasferire i flaconi dallo shaker in una stanza sterile.
7. Rimuovere il parafilm e il cappuccio della pellicola da ogni pallone e infiammare / sterilizzare la bocca dei flaconi.
8. Trasferire separatamente la sospensione di ciascun pallone in un cilindro sterile da 100 ml passandolo attraverso un setaccio.
9. Lasciare che il contenuto si stabilizzi per 10 minuti e quindi scartare il surnatante.
10. Trasferire i residui delle cellule rimaste nel cilindro graduato in un pallone da 250 ml contenente 60 ml di mezzo fresco.
11. Ripetere il passaggio 10 per ogni pallone di coltura.
12. Metti di nuovo tutti e cinque i flaconi sullo shaker.
13. Dopo 7 giorni ripetere la procedura eseguita in precedenza (dal punto 6-10). Tuttavia, questa volta solo prendere 1/5 delle cellule residue come l’inoculo.
14. Ripetere la procedura circa 3-4 volte. In tal modo, solo singole cellule o piccoli aggregati rimarranno nella sospensione della carota.
15. Per la carota, la sospensione cellulare, il numero di celle appropriate compreso tra 105 e 3 x 105 cellule/ml o 100 e 300 mg (peso fresco) di inoculo in un volume di 60 ml di mezzo fresco contenente i media e 5×10-8 g/ml 2,4-D.
16. Un periodo di 7 giorni è appropriato per la carota per ottenere le singole cellule in coltura di sospensione.

Approximate Schedule of the Culture

Event	Timing (approximate)
Initiation of cell suspension and determination of total cell number and PCV (packed cell volume)	Day 0
First transfer of cultures	Day 8
Fourth transfer of cultures	Day 29

Result

What should you observe while experimenting? Ecco alcuni punti da ricordare mentre si notano i risultati.

• Data e durata dell’esperimento.
• Il numero di colture e trattamenti applicati.
• Registrare la morfologia e il numero di colture infette ad un intervallo di tre settimane.
• Determinare PCV (volume delle cellule impacchettate) all’inizio e alla fine del trasferimento della coltura.
• Stimare il numero totale di celle dopo 3 sottoculture, ai giorni 1, 2, 4 e 7, e tracciare un grafico contro il tempo.
• Studia la relazione tra la densità dell’inoculo e il modello di crescita.

La coltura in sospensione offre un vantaggio rispetto ad altre colture in quanto consente il movimento del tessuto nei mezzi di coltura che facilita lo scambio gassoso. Inoltre, rimuove qualsiasi polarità del tessuto e del gradiente di nutrienti all’interno e nei media.

Applicazione della coltura tissutale per la carota

1. Per clonare le taproots.
2. Per studiare la forma mutante delle carote.
3. Per studiare le risposte fisiologiche della carota che possono facilitare una comprensione di altre piante pure.
4. Per studiare la crescita e lo sviluppo della carota da una singola cellula.
5. Per studiare lo stress-risposta della carota che fornisce una panoramica delle risposte di altre piante pure.
6. Per generare centinaia di piante transgeniche dalla sospensione di singole cellule per qualsiasi scopo sperimentale.

1. Reinert J. e Yeoman M. M. (1982). Coltura di cellule vegetali e tessuti: un manuale di laboratorio. Springer-Verlag, Berlino Heidelberg, Newyork.
2. Hardegger M., Shakya R. (2004) Trasformazione della carota. In: Curtis I. S. (eds) Colture transgeniche del mondo. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-2333-0_22.
3. Crescita e divisione delle cellule di carota in coltura in sospensione. (1970). Fisiologia vegetale e cellulare. DOI:10.1093 / oxfordjournals.PCP.a074564.
4. https://www.atzlabs.com/prodcut-info/C1955-Carrot -…