Migliorata la piccola scala continuo del sistema di coltivazione
In questo studio, ci mostrano ulteriori progressi e possibilità di applicazione di una piccola scala in continuo del sistema di coltivazione, precedentemente sviluppato da Klein et al. , per un maggior grado di parallelizzazione e una migliore gestione, nonché il monitoraggio dei singoli reattori. Gli aspetti chiave delle modifiche apportate al sistema comprendono un aumento del set di vasi di coltura paralleli da 8 a 24 reattori e una diminuzione del volume di lavoro da 10 a 6,5 ml. Il sistema attuale è inoltre costituito da coperchi su misura che ospitano quattro porte fisse utilizzate per l’aerazione, l’alimentazione dei supporti, la rimozione del brodo e l’inoculazione o il campionamento (Fig. 1). Oltre alle quattro porte, una sonda ottica DO a forma di asta viene inserita attraverso il coperchio per il monitoraggio DO senza disturbare il processo di coltivazione, e in questo modo sostituendo il punto del sensore fluorescente di ossigeno del set-up precedente . Il bagno d’acqua, che nel precedente set-up ha mantenuto una temperatura di coltivazione costante, è stato sostituito da un blocco riscaldante in alluminio su misura, che è fuso ad un agitatore micropiastra. Poiché la versione precedente del sistema di bioreattori su piccola scala è stata validata utilizzando il lievito di fissione Schizosaccharomyces pombe, presentiamo qui il set-up di coltivazione migliorato per le colture di S. cerevisiae.
Le fasi operative di base, così come le regolazioni dei tassi di diluizione selezionando il diametro del tubo appropriato e la velocità della pompa della pompa di afflusso del fluido, sono state eseguite come descritto in precedenza . Qui, il peso del contenuto liquido di ciascun bioreattore è stato determinato gravimetricamente alla fine della coltivazione, consentendo il calcolo preciso del rispettivo tasso di diluizione con un 5.deviazione dell ‘ 1%. Il brodo di coltura e la fase gassosa del reattore sono stati entrambi rimossi attraverso la stessa porta del coperchio del reattore utilizzando la pompa di efflusso (Fig. 1). I tassi della pompa di efflusso di 7.5 ml min-1 sono stati usati per tutti gli esperimenti di coltivazione. Il tasso della pompa di efflusso era molto superiore al tasso della pompa di alimentazione, generando una leggera pressione negativa all’interno del recipiente di coltura. Questa differenza di pressione ha provocato l’afflusso di aria attraverso la porta di aerazione. Il coefficiente medio di trasferimento di massa di ossigeno kLa raggiunto è stato di 110 h-1, che ha permesso livelli di DO ben al di sopra del 30% di saturazione durante tutto il processo di coltivazione. Il pH non è stato monitorato online né controllato durante la coltivazione, poiché il terreno è stato regolato a priori a un pH di 6.0, che ha portato a un pH finale di 5.5 nel brodo di coltivazione. Il pH è stato misurato in linea su base giornaliera dal deflusso dei reattori e dopo la raccolta. Il pH è rimasto costante non appena è stato raggiunto lo stato stazionario e l’effluente del reattore ha mostrato una deviazione minore di 0,1 unità di pH (dati non mostrati).
Esplorando la produzione di 3 HP in chemostati su piccola scala a diversi tassi di diluizione in condizioni C-limitanti
Per determinare il tasso di crescita specifico massimo (µmax), S. cerevisiae ST938 è stato coltivato in condizioni batch applicando una disponibilità di nutrienti in eccesso. Usando il glucosio come fonte di carbonio, il µmax era 0.265 h−1, la resa della biomassa era 24.9 g mol-1 e la resa del carbonio 3-HP sul glucosio era 0.6% C-mol (Tabella 1). In questa modalità di coltivazione, la maggior parte del carbonio è stata metabolizzata in etanolo e CO2, come alti flussi glicolitici in wild-type S. le cerevisiae sono fortemente legate alla fermentazione alcolica . Le coltivazioni di chemostat sono controllate dalla fornitura di un substrato che limita la crescita. Allo steady state, S. cerevisiae wild-type non produce quantità significative di metaboliti di overflow al di sotto di un certo tasso di crescita, segnando il tasso critico di diluizione (Dcrit (h−1)) a causa della mancanza di accumulo di fonti di carbonio. A questo tasso critico di diluizione o superiore, la fonte di carbonio si accumula nel reattore e viene attivato il metabolismo del trabocco, con conseguente produzione di vari sottoprodotti, come etanolo, acetato e quantità minori di acidi organici . Di conseguenza, sono state utilizzate colture continue per studiare la relazione tra il tasso di crescita e la formazione di prodotti 3-HP specifici per biomassa in S. cerevisiae ST938. I quattro diversi tassi di diluizione D (h−1): 0,04, 0,09, 0,17 e 0,21 sono stati scelti per essere inferiori al µmax del ceppo S. cerevisiae ST938 determinato nella coltivazione in lotti. Sono stati studiati il rendimento della biomassa sul glucosio, nonché il rendimento di 3 HP, il tasso di produzione specifico di 3 HP e il tasso di assorbimento specifico del substrato (Fig. 2a-d, Tabella 1). Tutti i parametri colturali rilevanti, ossia le rese e i tassi con le rispettive deviazioni standard, sono riassunti nella tabella 1.
Selected rates and yields for C-limited aerobic chemostat cultivations of S. cerevisiae ST938 a 3-HP yield (C-mol C-mol−1) on glucose, b biomass yield on glucose (g mol−1), c specific 3-HP production rate (mmol gCDW−1 h−1) and d specific glucose uptake rate (mmol gCDW−1 h−1) at different dilution rates for S. cerevisiae ST938. Cultivations were carried out in triplicates at 30 °C and pH 5.5 under C-limited conditions. Errori corrispondono a deviazioni standard derivato dal triplice copia coltivazioni
La coltivazione di S. cerevisiae ST938 in C-condizioni limitanti ha mostrato un interruttore da prevalentemente metabolismo fermentativo osservato in modalità batch per un il metabolismo respiratorio in chemostati, che si riflette in un incremento della biomassa dei rendimenti come trascurabile etanolo e glicerolo formazione (Tabella 1). Inoltre, quantità minori di glucosio residuo inferiore a 0.1 mm è stato rilevato nei campioni prelevati dall’efflusso dei diversi reattori, verificando che le colture fossero limitate dal glucosio. Le condizioni limitate al carbonio riscontrate nelle colture chemostatiche allo stato stazionario sembravano promuovere la formazione di 3 – HP, poiché le rese di questo prodotto erano da 20 a 25 volte superiori alla resa determinata nella coltura batch (Tabella 1). Ciò è probabilmente dovuto alla conversione più efficiente del carbonio in energia sotto forma di ATP durante la respirazione rispetto alla fermentazione nelle colture batch. È interessante notare che le coltivazioni di S. cerevisiae ST938 in condizioni C-limitanti ha rivelato che con il declino dei tassi di crescita specifici è stato possibile osservare un costante aumento delle rese di carbonio 3-HP, con la più alta resa di 3-HP del 16,6% C−mol osservata a un tasso di diluizione di 0,04 h-1 (Fig. 2 bis). La resa di 3 HP sulla biomassa è dieci volte superiore alla resa nelle colture batch e aumentata più di due volte da 0,19 a 0,43 g gCDW−1 abbassando il tasso di diluizione da 0,21 a 0,04 h−1 (Tabella 1). La produttività specifica massima per 3-HP di circa 0,50 mmol gCDW-1 h-1 è stata osservata a tassi di diluizione di 0,17 e 0.21 h-1, che è circa quattro volte superiore a quello misurato nelle coltivazioni in lotti (Fig. 2c, Tabella 1). Come previsto, il tasso specifico di assorbimento del glucosio (qS) è aumentato con tassi di diluizione più elevati da 0,51 a 2,1 mmol gCDW−1 h−1 (Fig. 2d). Questi valori sono fino a 20 volte inferiori al tasso di assorbimento specifico massimo di glucosio di 10,7 mmol gCDW−1 h−1 osservato a µmax in condizioni di crescita limitate dal glucosio in modalità batch (Tabella 1). Valori ottenuti per il tasso specifico di assorbimento del substrato e il rendimento della biomassa con un tasso di diluizione pari a 0.09 h-1 (Tabella 1) erano in accordo con i dati provenienti da colture chemostatiche con S. cerevisiae wild−type a un tasso di diluizione di 0,10 h−1, indicando rispettivamente 1,1 e 1,25 mmol gCDW−1 h−1 e 0,49 g g-1 . È stato riscontrato che la resa della biomassa per substrato aumenta con l’aumentare dei tassi di diluizione, per S. cerevisiae wild-type, tuttavia, questo parametro è generalmente costante al di sotto del Dcrit fintanto che il metabolismo di mantenimento costituisce un considerevole dissipatore di carbonio che riduce la resa della biomassa a bassi tassi di diluizione . In caso di S. cerevisiae ceppo ST938, tuttavia, sembrava che il carbonio, che non era diretto verso la formazione di biomassa, stava contribuendo in una certa misura alla formazione di entrambi i 3-HP e sottoprodotti.
Per concludere, le differenze sperimentate in colture continue a diversi tassi di diluizione e in confronto a set-up simili con S. cerevisiae wild-type suggeriscono che il percorso biosintetico integrato per produrre 3-HP ha un enorme impatto sulla fisiologia del lievito, che è presumibilmente amplificato da risposte adattive allo stress. Infine, C-coltivazione chemostat limitata al tasso di diluizione più basso di 0.04 h-1 ha portato alla più alta resa in carbonio da 3 CV.
Studiare la limitazione dell’azoto e del fosfato per le rese aumentate di 3 HP nelle colture chemostatiche su piccola scala
Dopo la caratterizzazione di S. cerevisiae ST938 nelle circostanze C-limitanti, le coltivazioni nelle circostanze azoto – e fosfato – limitanti sono state effettuate, poichè precedentemente hanno dimostrato di essere favorevoli per la produzione di vari metaboliti nativi e Qui, le corrispondenti coltivazioni sotto limitazione di azoto (N) e fosforo (P) sono state studiate nel sistema di coltivazione continua su piccola scala (Fig. 1) con un tasso di diluizione impostato di 0,04 h−1, che in precedenza aveva portato alle più alte rese di carbonio di 3-HP in condizioni C-limitate (Tabella 1). I parametri e le rispettive deviazioni standard dalle colture N e P limitate del ceppo di lievito ST938 sono riassunti nella tabella 2.
Per N – e P-limitata condizioni di coltivazione, nessun residuo di ammonio o di fosfato sono stati rilevati in campioni prelevati dalla efflusso dei diversi reattori, verificando che le culture siano limitate rispetto al corrispondente substrato limitazione (Tabella 2). Tuttavia, quantità minori di glucosio residuo nell’intervallo 0,63 e 0,19 mm sono state rilevate sotto limitazione N e P (Tabella 2). Durante la limitazione del C, i livelli di glucosio residuo erano ben al di sotto di 0,1 mm (Tabella 2). Le colture che applicano limitazioni N e P hanno rivelato una resa di 3 HP del 17,7 e 21,1% C-mol, rispettivamente, mostrando un valore significativamente più alto in condizioni P-limitate rispetto alla resa di carbonio di 3 HP del 16,6% C-mol calcolata per condizioni di coltivazione C-limitate (Tabelle 1, 2). Allo stesso modo, la produttività specifica per 3-HP è stata significativamente aumentata per colture N – e P-limitate rivelando valori di 0,22 e 0,23 mmol gCDW−1 h−1 rispetto a 0,17 mmol gCDW−1 h−1 raggiunto in colture C-limitate. Inoltre, le rese di 3 HP sulla biomassa hanno mostrato valori comparabili di 0,43 e 0.44 g gCDW−1 per condizioni di limitazione C e N, tuttavia, in caso di limitazione P, è stata osservata una maggiore resa di 0,50 g gCDW – 1. A causa delle basse concentrazioni complessive di sottoprodotti quantificati, questi sono trascurabili (Tabella 2). I valori per il tasso specifico di assorbimento del substrato (qS) per la limitazione C – e P-erano comparabili e un valore leggermente elevato di 0,61 mmol gCDW−1 h−1 è stato ottenuto in condizioni N-limitate. Rese di biomassa per substrato rivelate per condizioni N-e P-limitate valori simili di 72,4 e 75,2 g mol-1, rispettivamente. Rispetto alla resa della biomassa di 78.4 g mol−1 raggiunto in condizioni C-limitate, questi valori sono simili. Il nostro studio supporta la logica secondo cui rese di prodotto più elevate per substrato sono state raggiunte in condizioni limitanti N e P. Di conseguenza, sembra che un più alto tasso specifico di assorbimento del substrato in caso di limitazione N combinato con la minima formazione di sottoprodotti abbia favorito in ultima analisi la formazione del prodotto. In condizioni P-limitanti si sono formate le minime quantità di sottoprodotti, che potrebbero favorire la sintesi del prodotto. Si può inoltre ipotizzare che alcuni cambiamenti metabolici possano portare a una quantità ridotta di carbonio rilasciata come CO2.
In sintesi, le colture chemostatiche con limitazione N e P hanno rivelato un aumento delle rese di 3 HP e dei tassi di produzione specifici rispetto alle condizioni C – limited, con la limitazione P che consente le rese più elevate del prodotto.
Trasferibilità dei parametri fisiologici misurati in piccola scala chemostati di fed-batch culture in 1-L bench-top bioreattori in C e P limitando le condizioni
Dal momento che questo ulteriore studio finalizzato a valutare la trasferibilità e la comparabilità dei parametri fisiologici misurati in diverse condizioni di coltivazione, la coltivazione parametri ottenuti i C e P limitando le condizioni determinati in chemostato culture sono stati trasferiti a 1-L agitato da banco per reattori in esecuzione in fed-batch mode. Il concetto di questo approccio era quindi quello di mantenere costanti le condizioni e i parametri chiave per le colture chemostat e fed-batch per garantire la comparabilità. Queste condizioni comprendevano (i) lo stesso rapporto C:P applicato nelle colture chemostatiche P-limitanti, (ii) le identiche condizioni di processo come pH e temperatura e (iii) gli stessi tassi di crescita specifici applicati nei chemostati, ottenuti attraverso un profilo di alimentazione esponenziale. Per ottimizzare il titolo del prodotto, i parametri con la resa massima del prodotto per substrato dagli esperimenti chemostat (D = 0.04 h−1) sotto C-e P-limitazione sono stati scelti per il trasferimento al sistema fed-batch. A causa di restrizioni tecniche nel set-up, le colture in lotti alimentati sono state effettuate a un tasso di crescita di 0,05 h−1, che è leggermente superiore rispetto al tasso di diluizione impostato di 0,04 h−1 nelle colture chemostat. La coltivazione fed-batch consisteva in una fase iniziale di batch per generare biomassa seguita da una fase di alimentazione esponenziale e limitata ai nutrienti per controllare il tasso di crescita. Solo la fase di alimentazione è stata considerata rilevante per la valutazione della trasferibilità dei parametri ottenuti dal sistema di coltivazione continua, poiché solo durante questa fase la concentrazione del substrato controllava e quindi limitava la crescita microbica. I profili di coltivazione in lotti nutriti di S. cerevisiae ST938 che applicano condizioni limitanti C e P sono mostrati in Fig. 3, e i corrispondenti parametri di coltivazione con la rispettiva deviazione standard sono riassunti nella tabella 3.
Coltivazione aerobica in batch in fermentatori da banco da 1 L di S. cerevisiae ST938 utilizzando una rampa di alimentazione esponenziale a D = 0,05 h-1 con il substrato limitante carbonio a o fosforo B. I cerchi neri si riferiscono al titolo della biomassa, i quadrati rossi al titolo 3-HP e la linea tratteggiata blu alla quantità assoluta di glucosio alimentato ai reattori
La resa di biomassa osservata nelle colture fed-batch è stata di 77,9 e 67,7 g mol−1 per la limitazione di C e P, rispettivamente. La resa della biomassa per le colture C-limited era comparabile tra chemostat e fed-batch, mentre per la limitazione P, una resa della biomassa leggermente diminuita è stata osservata durante il funzionamento fed-batch (Tabelle 2, 3), che è all’interno delle deviazioni standard osservate per entrambe le rese della biomassa. La resa di carbonio per substrato per 3-HP era del 15,9% per la limitazione C, che è quasi identica rispetto al valore calcolato nel sistema chemostat (Fig. 4 bis). Le rese di 3-HP determinate in questo studio sono ulteriormente in stretto accordo con una resa di carbonio per substrato del 14% ottenuta in precedenti studi C-limited fed-batch a pH 5.0 con un ceppo S. cerevisiae progettato per utilizzare la via β-alanina e del 13% con un S. cerevisiae che utilizza la via dipendente dalla malonil-CoA reduttasi . Maggiori rese di carbonio 3-HP per substrato attraverso la via β-alanina sono state determinate in studi con Escherichia coli che indicavano un valore del 42% nelle colture in lotti nutriti su glucosio .
Confronto dei parametri di coltivazione sotto diverse limitazioni determinate in chemostati su piccola scala e reattori da banco da 1 L in modalità fed-batch. a 3-HP carbon yield (%C-mol) e b 3−HP yield sulla biomassa (g gCDW-1). Gli errori corrispondono a deviazioni standard derivate da colture triplicate
Per condizioni P-limitanti, tuttavia, il nostro studio ha rivelato un notevole aumento della resa in carbonio 3-HP del 25,6% (Fig. 4 bis). Le rese osservate di 3 HP sulla biomassa sono state rispettivamente di 0,38 e 0,65 g gCDW−1 per condizioni limitanti C e P. Per la limitazione C ciò ha confermato i valori osservati nel set-up chemostat (Fig. 4 ter). A causa dell’aumento della resa di 3-HP per substrato in condizioni di limitazione del P e della leggera diminuzione della resa della biomassa per substrato, la resa di 3-HP per biomassa è stata significativamente aumentata rispetto all’esperimento chemostat. In contrasto con le coltivazioni effettuate in chemostatici, non è stato rilevato alcun accumulo significativo di etanolo o glicerolo nelle colture in lotti nutriti. Un bilancio chiuso del carbonio per le condizioni limitanti C e P indicava che non si formavano quantità rilevanti di altri (sottoprodotti) (Tabella 3). Questa differenza nello spettro del sottoprodotto potrebbe spiegare l’aumento della resa di 3 HP per glucosio.
In confronto alle colture condotte in chemostatici, i tassi specifici di assorbimento del glucosio determinati in colture fed-batch mostrano valori considerevolmente più alti di 0,75 e 0,77 mmol gCDW−1 h−1 per condizioni limitanti C e P, rispettivamente. Come accennato in precedenza, il set point per il fattore esponenziale del profilo di alimentazione è stato impostato su 0,05 h−1 e variato fino a 0,059 h−1, risultando in un tasso di crescita specifico più elevato del 30-45% nelle colture fed-batch rispetto agli esperimenti chemostat con 0.04 h-1 (Tabella 3), causando un aumento dei tassi specifici di assorbimento del glucosio. Tuttavia, per le fermentazioni C-limited, la resa della biomassa sul glucosio era comparabile tra chemostat e coltivazione fed-batch. Allo stesso modo, i tassi di produzione specifici di 3 HP sono stati elevati nelle coltivazioni in lotti alimentati, con 0,24 mmol gCDW-1 h-1 e 0,38 mmol gCDW−1 h−1, rispettivamente. Le rese di 3 HP per substrato erano comparabili tra la coltivazione chemostat e la coltivazione fed-batch, suggerendo che le rese fossero un parametro di coltivazione robusto e resistente alle perturbazioni indotte da piccole fluttuazioni nel set-up di coltivazione. Non è stato rilevato alcun residuo di fosfato, così come di glucosio, nei campioni prelevati dai diversi reattori per condizioni di limitazione del P, confermando che le colture devono essere limitate rispetto alla corrispondente limitazione. Allo stesso modo, per la limitazione del C non è stato rilevato alcun glucosio residuo nei campioni.
Il qui presentato miglioramenti di un sistema chemostat su piccola scala, precedentemente sviluppato da Klein et al. , compreso tra l’altro un aumento del numero di reattori a 24 e una riduzione del volume di coltivazione a 6,5 ml. Questo maggiore grado di parallelizzazione rende il sistema un adeguato strumento di screening ad alto rendimento, poiché vari sistemi chemostatici comparabili su piccola scala operano con volumi di lavoro più elevati e con un numero inferiore di reattori: il sistema CosBios (continuous parallel shaken bioreactor) utilizza sei rispettivamente otto vasi di coltura paralleli con un volume di coltura di 20-25 mL . Il sistema di bioreattori a serbatoio mescolato modificato per colture continue (bioREACTOR, 2mag AG) funziona con otto reattori paralleli ad un volume di lavoro di 10 mL . Il sistema mini-chemostato (MC) sviluppato da Bergenholm et al. comprende 16 reattori paralleli e richiede un volume di lavoro di 40 ml. Il nostro sistema è quindi ben applicabile per lo screening semplice ed economico delle prestazioni microbiche in modalità continua. Potrebbe essere rilevante, tuttavia, in ulteriore misura il sistema monitorando parametri aggiuntivi, come i gas di scarico, per consentire un’analisi dettagliata della distribuzione del carbonio, che è di particolare importanza per le caratterizzazioni fisiologiche delle deformazioni.
Poiché il nostro studio ha suggerito che la limitazione di N e P sia favorevole alla formazione di 3 – HP in S. cerevisiae, gli esperimenti futuri potrebbero comportare un ulteriore screening dei tassi di crescita con la limitazione di N e P applicata al fine di trovare la produzione ottimale di 3-HP con ciascuna rispettiva limitazione. Il nostro studio ha inoltre mostrato la trasferibilità dei parametri fisiologici da chemostat a colture in lotti nutriti. Ciò ritiene fattibile solo se non si accumulano composti tossici o inibitori durante la coltivazione in batch, poiché i parametri fisiologici cambierebbero nel tempo e si discosterebbero dai parametri acquisiti nei chemostati. Come approccio generale, gli esperimenti chemostat possono servire come strumento per indagare l’influenza di un potenziale composto tossico o inibente aggiungendo la sostanza al mangime stesso. Poiché tutti gli altri parametri sono costanti, l’influenza del composto e la sua concentrazione possono essere valutati e valutati direttamente. Nel nostro studio, non è stata rilevata alcuna formazione di sottoprodotti nelle coltivazioni in lotti alimentati e una risposta allo stress presumibilmente simile è stata indotta a causa di acidi deboli, che hanno permesso alle condizioni fisiologiche nei chemostati su piccola scala di assomigliare a quelle in condizioni di lotti alimentati.
In sintesi, questo studio ha dimostrato che il concetto di condizioni limitanti C e P per la produzione di 3 – HP è stato studiato in un nuovo sistema di coltivazione chemostat parallelizzato e potrebbe essere trasferito con successo a bioreattori da banco da 1-L che operano in modalità fed-batch. Pertanto, i parametri fisiologici acquisiti nei chemostati possono essere utilizzati per la progettazione e la valutazione delle prestazioni delle colture fed-batch utilizzando parametri basati sulla resa per l’impostazione del processo.
