Risultati

Modulazione dei livelli di p107 cellulare attraverso proteolisi controllata. Abbiamo precedentemente dimostrato che il p107 endogeno, un membro della famiglia di proteine RB, che non è un substrato naturale di SCFßTrCP, può essere eliminato nelle cellule di carcinoma cervicale C33A mediante l’espressione ectopica di una ßTrCP chimerica ubiquitina-proteina ligasi (ßTrCP-E7N) che trasporta un peptide legante p107 derivato dai residui N-terminali 35-aa dell’oncoproteina HPV, E7 (E7N) (1). Tuttavia, le funzioni di molte proteine cellulari sono dettate dalla loro abbondanza intracellulare, e non semplicemente dalla loro presenza o assenza. Finora, non c’è stato un metodo affidabile per modulare con precisione i livelli di proteine intracellulari nelle cellule di mammifero.

Per prima cosa abbiamo studiato se i livelli di p107 potessero essere sistematicamente ridotti attraverso l’espressione controllata di diverse quantità di ßTrCP-E7N. Le cellule umane di carcinoma cervicale C33A sono state infettate con dosi crescenti di adenovirus ricombinante che trasportava ßTrCP-E7N o l’adenovirus di controllo per 24 ore. L’infezione è stata del 100%, anche alla dose più bassa utilizzata, come giudicato dall’espressione di GFP trasportata dall’adenovirus in tutte le cellule riceventi (dati non mostrati). Come mostrato in Fig. 1 (Superiore), i livelli endogeni di p107 sono stati sistematicamente ridotti al 78%, 25% e 5% dei livelli allo steady-state quando le cellule C33A sono state trasdotte con adenovirus ßTrCP-E7N ricombinante a mois di 10, 35 e 80, ma non le stesse dosi di virus di controllo Ad1. Pertanto, SCFßTrCP-BP ingegnerizzato offre un mezzo semplice e riproducibile per ridurre le quantità complessive di proteine bersaglio a livelli definiti per valutare gli effetti del dosaggio sulle attività biologiche.

P107 si associa stabilmente con ciclina A e Cdk2 attraverso un sito di legame ad alta affinità nelle cellule proliferanti (13-15). Per esaminare se queste proteine associate a p107 sono anche sottoposte a degradazione mirata da ßTrCP-E7N, l’immunoblotting è stato eseguito in cellule C33A infettate dal virus Ad-F-TrCP-E7N. Come mostrato in Fig. 1, i livelli endogeni di ciclina A e Cdk2 sono rimasti inalterati, mentre p107 è stato drasticamente regolato. Inoltre, i livelli di β-actina non mirata non sono stati influenzati da F-TrCP-E7N (Fig. 1). Questo risultato ha fornito una forte evidenza che la ßTrCP-E7N ubiquitina–proteina ligasi ingegnerizzata degrada specificamente il substrato mirato p107, ma non le sue proteine associate.

Degradazione selettiva di una specifica sottopopolazione posttranslazionalmente modificata della proteina bersaglio. La modificazione di una proteina cellulare a livello post-traduttivo, come la fosforilazione, è un mezzo fondamentale che le cellule impiegano per regolare la funzione o per conferire nuove attività alla proteina. Gli strumenti sperimentali per sezionare la funzione associata a uno specifico evento di modifica post-traduzione sono attualmente limitati. Poiché la proteina knockout opera a livello posttranslazionale che riconosce direttamente le proteine bersaglio, un’applicazione è quella di progettare uno specifico E3 in grado di selezionare una sottopopolazione di proteine posttranslazionalmente modificate per la degradazione, invece di distruggere l’intera popolazione.

L’HPV16 E7 è stato trovato per legarsi selettivamente alla forma ipofosforilata di RB (16). Abbiamo studiato se la chimerica ßTrCP–E7N ubiquitina – proteina ligasi potesse distinguere ipo-e iperfosforilati RB e selezionare solo l’ipoforma per la degradazione. Le cellule umane di osteosarcoma U2OS esprimono entrambe le forme di RB che possono essere facilmente identificate, in base alla loro diversa mobilità elettroforetica su SDS / PAGE (Fig. 2A, corsia 1) (17). L’identità di queste due specie di RB è stata ulteriormente verificata mediante immunoblotting utilizzando anticorpi specifici per forme ipo – o iperfosforilate di RB (Fig. 2A, corsie 2 e 3). Le cellule U2OS sono state infettate con l’Ad-F-TrCP-E7N ricombinante o gli adenovirus Ad1 di controllo per 48 h e i livelli allo stato stazionario di RB-P e RB sono stati analizzati simultaneamente mediante Western blotting, utilizzando un anticorpo monoclonale anti-RB che riconosce entrambe le forme. Coerentemente con il legame preferenziale di E7N con RB ipofosforilato, l’espressione ectopica di F-TrCP-E7N ha comportato l’eliminazione di RB ipofosforilato, mentre l’RB-P iperfosforilato è rimasto intatto (Fig. 2B Superiore, confrontare corsie 4-6 con corsie 1-3). Questo risultato evidenzia la capacità della ligasi ubiquitina-proteina F-TrCP–E7N ingegnerizzata nella selezione di una sottopopolazione specifica di RB per la degradazione, che si basava sullo stato di alcune modificazioni post-traduttive della proteina bersaglio.

Full-length HPV16 E7 potrebbe interagire con gli inibitori della chinasi ciclina-dipendenti p21Waf1 e p27Kip1, ma il dominio di legame è stato mappato al dominio C-terminale (residui 40-98), invece del frammento E7N (residui 18-20). Per esaminare ulteriormente la specificità di F-TrCP-E7N, gli stessi estratti di cellule U2OS sono stati anche sondati con anticorpi contro p21Waf1 e p27Kip1. Come si vede in Fig. 2B (Medio), i livelli stazionari di p21Waf1 e p27Kip1 sono rimasti invariati. Presi insieme, il F-TrCP-E7N ingegnerizzato ha dimostrato la specificità proteolitica verso le proteine della famiglia RB, ma non altri regolatori del ciclo cellulare come Cdk2, ciclina A, p21Waf1 e p27Kip1.

Mutagenesi basata sulla struttura per generare una ligasi Ubiquitina-proteina altamente specifica ßTrCP–E7N. Il ßTrCP chimerico-E7N è ancora in grado di legare i substrati ßTrCP endogeni, tra cui IkB, β-catenina e ATF4 (3-7). La sovraespressione di ßTrCP-E7N potrebbe interferire con la degradazione di questi substrati nativi. Viceversa, il legame del substrato endogeno con ßTrCP – E7N potrebbe interferire con il corretto posizionamento del substrato destinato ad accettare l’ubiquitina dall’enzima coniugante ubiquitina e quindi ridurre l’efficienza della degradazione mirata (Fig. 3AUpper). Inoltre, ßTrCP interagisce con uno pseudo substrato hnRNP-U, che lega ßTrCP e i suoi derivati nel nucleo e preclude la loro interazione con i substrati (21). Introducendo mutazioni specifiche dei residui di aminoacidi su ßTrCP per eliminare il suo legame con β-catenina, IkB o hnRNP-U, prevediamo di migliorare non solo la specificità ma anche la disponibilità del ßTrCP-E7N ingegnerizzato per reclutare il substrato previsto (Fig. 3dopo).

Il dominio di legame del substrato di ßTrCP contiene sette ripetizioni WD40 nella regione C-terminale, che si piegano nella tipica struttura β-elica a sette pale conservata tra le proteine WD40 (3-7). Poiché l’integrità complessiva della struttura β-elica delle proteine WD40 è fondamentale per le loro funzioni, l’approccio di mutagenesi della delezione standard probabilmente indurrà alterazioni strutturali grossolane e, quindi, non è applicabile per la definizione dei siti di legame del substrato su ßTrCP. Tuttavia, la nota struttura cristallina delle proteine WD40 può essere sfruttata per identificare i residui superficiali coinvolti nel legame dei substrati ßTrCP. Un approccio di mutagenesi basato sulla struttura è stato progettato per identificare e mutare cinque residui caricati positivamente (R285, K365, R474, R521 e R524), previsti per risiedere sulla superficie superiore dell’elica β WD40, che sono coinvolti nel legame con le proteine associate a WD40 (Fig. 3 TER) (22). Questo approccio è stato dettagliato in Metodi di supporto, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS. Inoltre, vedi Fig. 6, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS. Inoltre, le sostituzioni di questi residui di Lys/Arg non altereranno probabilmente la struttura complessiva del ßTrCP.

Utilizzando il kit di mutagenesi QuikChange multisito-directed (Stratagene), abbiamo contemporaneamente mutato questi residui in colla. Questo mutante composto contrassegnato con FLAG, designato F-TrCP (m1)-E7N, è stato testato per il suo legame sia con gli obiettivi knockout endogeni (IkB) che con quelli previsti (p107). Le cellule HeLa sono state transitoriamente trasfettate con F-TrCP (m1)-E7N o F-TrCP-E7N e le loro interazioni con IkB e p107 sono state determinate dalla coimmunoprecipitazione. F-TrCP-E7N e F-TrCP hanno mostrato affinità simili alla proteina IKB fosforilata, mentre le mutazioni del composto m1 hanno abolito il legame F-TrCP(m1) – E7N (Fig. 3C Medio). Al contrario, livelli simili di p107 sono stati rilevati negli immunocomplessi di F-TrCP-E7N o F-TrCP (m1) – E7N (Fig. 3C inferiore), indicando che la ligasi ubiquitina-proteina ingegnerizzata F-TrCP(m1)–E7N è completamente funzionale nel reclutamento degli obiettivi cellulari previsti. Questi risultati sono in accordo con le previsioni strutturali in Fig. 3B, e definire ulteriormente i residui di aminoacidi su ßTrCP critici per il riconoscimento del substrato endogeno.

Il F-TrCP ingegnerizzato(m1)-E7N è stato ulteriormente analizzato per la sua potenza nel degradare il p107 endogeno. Le cellule C33A sono state cotrasfettate con F-TrCP, F-TrCP-E7N o F-TrCP(m1)-E7N, insieme a un plasmide di espressione CD19. Quarantotto ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e arricchite per coloro che ricevono i plasmidi trasfettati utilizzando le perle immunomagnetiche coniugate all’anticorpo monoclonale anti-CD19. I livelli endogeni di p107 sono stati successivamente determinati mediante immunoblotting. Come mostrato in Fig. 3D, l’espressione ectopica di F-TrCP(m1)-E7N ha determinato una riduzione del 95% dei livelli endogeni di p107, mentre è stata osservata una down-regulation dell ‘ 82% di p107 per F-TrCP-E7N (Fig. 3D Superiore, confrontare corsie 4 e 3). Inoltre, l’espressione di F-TrCP (m1)-E7N non ha avuto alcun effetto osservabile sulla degradazione indotta da fattore di necrosi tumorale (TNF)-α di IkB da SCFßTrCP nativo, o sulla distruzione di p27kip1 dalle ligasi SCFSkp2 ubiquitina–proteina (dati non mostrati). Pertanto, l’espressione ectopica dell’F-TrCP ingegnerizzato (m1)-E7N non interferisce con l’attività generale di ubiquitinazione SCF soffocando i componenti SCF principali (Skp1, CUL-1 e Rbx1/Roc1) condivisi dalle proteine F-box endogene.

La degradazione mirata di p107 è stata ulteriormente valutata in singole cellule C33A mediante test di immunofluorescenza indiretta. Coerentemente, p107 è stato ampiamente eradicato in cellule C33A che esprimono F-TrCP-E7N o F-TrCP (m1)-E7N, ma non F-TrCP da solo (Fig. 3 E). Collettivamente, questi risultati indicano che eliminando i siti di legame dei substrati ßTrCP endogeni, la ligasi ubiquitina-proteina ingegnerizzata F-TrCP(m1)–E7N ha dimostrato una maggiore specificità e una robusta attività proteolitica verso il bersaglio previsto.

Dominio di legame minimo come peptide di targeting per un reclutamento efficiente del substrato. Per ottenere un’elevata specificità del reclutamento del substrato e ridurre al minimo il targeting non specifico di altre proteine cellulari, abbiamo testato se il dominio minimo di interazione p107/RB di E7N (designato E7m), che comprende residui 21-29 di E7 che coprono il motivo LXCXE (23), potrebbe ottenere un legame e una degradazione efficienti di p107. Una ligasi chimerica della ubiquitina-proteina è stata costruita in cui ßTrCP ed E7m sono stati collegati covalentemente insieme da un distanziatore flessibile 20-aa compreso 10 copie delle ripetizioni di Gly-Ser (10GS designato). F-TrCP-E7N o F-TrCP-10GS-E7m sono stati transitoriamente trasfettati in cellule C33A e il loro legame con il p107 endogeno è stato valutato mediante immunoprecipitazione in estratti preparati dopo il trattamento con l’inibitore del proteasoma MG132 per inibire la degradazione come conseguenza di questa interazione. Come mostrato in Fig. 4A (corsie 2 e 3), F-TrCP-10GS-E7m aveva un’affinità leggermente aumentata a p107 rispetto a quella dell’originale F-TrCP-E7N. F-TrCP-E7N e F-TrCP-10GS-E7m sono stati ulteriormente valutati per la loro efficienza nella degradazione di p107 mediante trasfezione transitoria in cellule C33A come in Fig. 3D. Come mostrato in Fig. 4B, F-TrCP-E7N e F-TrCP-10GS-E7m hanno indotto fino al 92% e al 95% di down-regulation di p107, indicando che il ßTrCP ingegnerizzato che trasporta il dominio minimo di legame p107 funziona in modo efficiente come l’originale F-TrCP-E7N nelle proteine bersaglio degradanti.

Erogazione mediata da retrovirali del ßTrCP ingegnerizzato per una degradazione sostenuta di bersagli endogeni. Successivamente abbiamo esaminato se le ligasi ubiquitina–proteine ingegnerizzate potessero essere espresse stabilmente per ottenere una degradazione sostenuta del bersaglio previsto. Le cellule della leucemia promielocitica HL-60 sono state trasdotte con i retrovirus ricombinanti che esprimono PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N o il controllo F-TrCP-E7N(ΔDLYC), in cui il sito di legame RB/p107 è stato eliminato (1). Le cellule infette con transgeni chimerici F-TrCP integrati cromosomicamente sono state isolate mediante ordinamento FACS, basato sull’espressione di GFP dai virus, e la degradazione del p107 endogeno è stata valutata dalle cellule HL-60 infette immediatamente dopo l’infezione (Fig. 5A), o dopo 3 mesi di coltura in mezzo di crescita (Fig. 5 TER). Inoltre, perché due altri membri della famiglia RB proteine, RB e p130, sono anche espressi in cellule HL-60, abbiamo esaminato se un singolo F-TrCP-E7N può indirizzare contemporaneamente il degrado di tutta la RB famiglia di proteine che interagiscono con la stessa LXCXE motivo di E7N. Espressione ectopica di retrovirally transduced F-TrCP-E7N indotta drammatica la down-regulation del hypophosphorylated forma di RB, così come p107 (Fig. 5A) e p130 (dati non mostrati) nelle cellule HL-60, immediatamente dopo l’infezione e l’ordinamento FACS (Fig. 5A), o 3 mesi dopo l’infezione e la coltura continua (Fig. 5B, corsia 3). Al contrario, l’espressione stabile di F-TrCP-E7N(ΔDLYC) nelle cellule HL-60 non ha avuto alcun effetto sull’alterazione di p107, RB (Fig. 5A, corsia 3) e livelli p130 (dati non mostrati). Coerente con l’osservazione che F-TrCP-E7N degrada preferenzialmente RB ipofosforilato nelle cellule U2OS (Fig. 2), la riduzione delle specie RB iperfosforilate mediante espressione stabile di F-TrCP-E7N era meno pronunciata, rispetto a quella della forma ipofosforilata nelle cellule HL-60 (Fig. 5A, confrontare corsia 2 di pRB e pRB-P).

In caso di trattamento con acido retinoico all-trans (ATRA), le cellule HL-60 escono dal ciclo cellulare e subiscono una differenziazione terminale. È stato osservato un accumulo di RB ipofosforilato, che in precedenza era stato segnalato per contribuire all’arresto della crescita indotta da ATRA, mentre il RB iperfosforilato non era rilevabile (24, 25). Per esaminare se il macchinario SCFßTrCP può essere sfruttato anche durante l’uscita del ciclo cellulare, le cellule HL-60 che esprimono stabilmente F-TrCP-E7N o F-TrCP(m1)-E7N sono state trattate con 1 µM ATRA per 72 h e sono state valutate la degradazione delle proteine della famiglia RB. Le cellule HL-60 che esprimono stabilmente F-TrCP-E7N hanno determinato una diminuzione del 95%, 98% e 85% dei livelli di RB, p107 e p130 rispettivamente, rispetto alle cellule infettate dal virus pBMN-GFP di controllo (Fig. 5B, corsia 2). Poiché ATRA attiva anche la trascrizione di geni sotto il controllo del virus Moloney murine leukemia LTR di pBMN-GFP (26), l’aumentata espressione di F-TrCP-E7N sul trattamento ATRA probabilmente ha contribuito ulteriormente all’efficiente down-regulation di p107, p130 e RB ipofosforilato (Fig. 5 TER).

L’effetto delle proteine della famiglia RB sulla normale progressione del ciclo cellulare è stato esaminato nei fibroblasti dell’embrione di topo con interruzioni nei geni RB, p107 e p130 e si è scoperto che non risponde ai segnali che inducono l’arresto di G1, come il ritiro del fattore di crescita o il danno al DNA (27, 28). Tuttavia, gli effetti collettivi dei membri della famiglia RB nella proliferazione delle cellule tumorali non sono stati studiati, a causa della mancanza di strumenti genetici inversi efficienti. Le cellule HL-60 stabili che esprimono F-TrCP (m1)-E7N da questo studio ci hanno permesso di valutare come le cellule tumorali carenti per tutte e tre le proteine della famiglia RB hanno risposto ai segnali di arresto G1. Nelle cellule HL-60 in crescita esponenziale che esprimono F-TrCP(m1)-E7N che hanno indotto la degradazione costitutiva delle proteine della famiglia RB, è stata osservata una marcata accelerazione della progressione del ciclo cellulare rispetto a quelle infette dal virus pBMN-GFP di controllo (Fig. 5C a sinistra). Questo risultato è coerente con il controllo alterato delle transizioni G1–S osservate nei fibroblasti dell’embrione di topo triplo knockout RB–/–, p107–/– e p130–/– (27, 28).

Il trattamento ATRA ha inibito la transizione di fase da G1 a S nelle cellule HL-60 infettate dal controllo pBMN-GFP (Fig. 5C) o virus F-TrCP-E7N(ΔDLYC) (dati non mostrati), che è coerente con quanto riportato per le cellule HL-60 non infette (Fig. 5 QUATER) (24). Un ritardo iniziale nella transizione G1-S è stato osservato anche nelle cellule pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 a 48 h dopo ATRA. Tuttavia, non è stato possibile ottenere un arresto completo di G1 nella fase successiva (72-96 h)e le cellule hanno continuato il corso della progressione del ciclo cellulare (Fig. 5 QUATER). Al contrario, le cellule di controllo pBMN-GFP/HL-60 sono state tutte bloccate in G1 tra 72 e 96 h. Queste osservazioni suggeriscono che la degradazione mediata da F-TrCP(m1)-E7N dei membri della famiglia RB compromette un evento ATRA-risposta tardivo necessario per il completamento dell’arresto della crescita, mentre l’attenuazione precoce della progressione di G1-S Inoltre, è stata osservata una drastica riduzione del numero di cellule tra 72 e 96 ore dopo il trattamento con ATRA a causa della massiccia morte cellulare durante l’uscita e la differenziazione del ciclo cellulare indotta da ATRA (29). Sorprendentemente, le cellule HL-60 che esprimono F-TrCP(m1) – E7N hanno mostrato un aumento medio di 2-3 volte nelle popolazioni subG1 rispetto a quella delle cellule HL-60 infettate dal virus di controllo (dati non mostrati), che è coerente con l’aumento della morte cellulare nelle cellule embrionali di fibroblasti di topo a triplo knockout RB -/–, p107–/– e p130–/– in condizioni di inibizione della crescita (28). Collettivamente, l’espressione costitutiva di F-TrCP (m1)-E7N ha indotto la down-regolazione dell’intera famiglia di proteine RB, che porta ad un’inibizione dell’arresto della crescita e ad un aumento della morte cellulare durante il trattamento con ATRA.

L’arresto G1 indotto da ATRA comporta la regolazione coordinata di più segnali/componenti cellulari che controllano negativamente il ciclo cellulare (rivisto in ref. 30). Dimberg et al. (31) ha riferito che l’ATRA innesca una sequenza di eventi nelle cellule mieloidi che coinvolgono un aumento precoce dell’espressione di p21waf1, la stabilizzazione di p27kip1 e, successivamente, la defosforilazione di RB all’inizio dell’arresto di G1. Poiché ßTrCP (m1)-E7N degrada solo i membri della famiglia RB e non ha alcun effetto sulla stabilità di p21waf1 e p27kip1, è probabile che solo la risposta ATRA tardiva, dipendente da RB, sia influenzata, il che è coerente con la resistenza delle cellule pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 per completare G1 arrestat72–96 h (Fig. 5 QUATER). L’inibizione della crescita precoce osservata da ATRA a 48 h (Fig. 5C) potrebbe essere attribuito, almeno in parte, alla up-regulation di p21waf1 e p27kip1, la cui stabilità non è influenzata dall’espressione costitutiva F-TrCP (m1)-E7N (Fig. 2 e 5).