Questa è la prima di una serie in tre parti sulla trasformazione di E. coli. Entro la fine di questo si dovrebbe essere un esperto di E. coli trasformazione e su quali ceppi di scegliere per le diverse applicazioni. Se sei già un esperto, spero che sarà un piacevole aggiornamento per voi. In entrambi i casi, si prega di commentare qui sotto se avete qualcosa da aggiungere.

Utilizzando l’elettricità per la trasformazione

DNA estraneo può essere introdotto in E. coli competente utilizzando elettroporazione o trasformazione chimica. Quando si utilizza l’elettroporazione si applica una corrente elettrica attraverso la cella. Si pensa che la corrente crei “pori” momentanei nelle membrane cellulari, che forzano il DNA caricato negativamente nelle cellule mediante un effetto di tipo elettroforesi. Per rendere elettro-competente E. coli, lavare accuratamente le cellule per rimuovere tutti i sali medi. Ciò garantisce che la carica non venga condotta attraverso il mezzo. Inoltre, eseguire l’elettroporazione a 0°C per ridurre al minimo i danni da calore alle cellule.

Sostanze chimiche: Funzionano anche

Per rendere le cellule chimicamente competenti, risospendere E. coli in una soluzione di CaCl2 a 0°C. In queste condizioni, si pensa che lo ion Ca2 + crei pori nella membrana, aiuti il legame del DNA alla membrana cellulare e mascheri la carica negativa sul DNA. Insieme, questi facilitano il passaggio del DNA attraverso la membrana cellulare idrofobica. Forza il DNA nelle cellule applicando un breve shock termico di 42°C, che si traduce in una corrente termica che spazza il DNA nelle cellule.

I pro e i contro di ogni

L’elettroporazione è meno ingombrante della trasformazione chimica e generalmente fornisce maggiori efficienze di trasformazione (misurate in colonie formate per microgramma di DNA). Tuttavia, è più costoso. Richiede un apparato specializzato per consegnare la carica e le cuvette per trasferire la carica alla sospensione della cella. L’elettroporazione è sensibile al sale-si possono perdere campioni preziosi se il sale in eccesso viene trasportato nella cuvetta.

Personalmente, preferisco la trasformazione chimica. Anche se ci vuole circa mezz’ora in più, trovo che i risultati sono più prevedibili e mi piace il fatto che un maggior volume di DNA può essere aggiunto se la concentrazione è troppo bassa. Non è possibile aumentare il volume di DNA con elettroporazione a causa del rischio di aggiungere troppo sale alla soluzione. Sebbene lo svantaggio comunemente citato della trasformazione chimica sia la sua minore efficienza, ora è possibile acquistare cellule ultra-competenti, come XL10-gold di Stratagene, quindi questo non è più un problema.

Articoli di questa serie:

• E. coli Elettroporazione vs Trasformazione chimica (questo articolo)
• E. coli competente: Comprare o non comprare?
• Scelta di un ceppo di E. coli competente

Originariamente pubblicato il 18 settembre 2007. Rivisto e aggiornato il 11 luglio 2016.