Automatizzato di sequenziamento del DNA mediante elettroforesi capillare

Separazione dei prodotti di un radio-etichettato o fluorescente dideoxy reazione di sequenziamento storicamente è stato fatto in un poli-acrilammide lastra di gel, per esempio il tipo utilizzato in un 96-lane ABI 377. Gli svantaggi di questo metodo includono la necessità di preparare un gel fresco per ogni sequenza, il caricamento manuale dei campioni nel gel, tempi di esecuzione relativamente lunghi (8 ~ 10 ore per la risoluzione di un frammento di DNA da 1 Kb) e difficoltà nel tracciamento automatico e/o manuale delle corsie.

Un metodo di separazione alternativo utilizza l’elettroforesi capillare. Vengono preparate una serie di reazioni standard di sequenziamento del DNA dideoxy, ciascuna in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a 8 righe x 12 colonne. Una serie di tubi capillari ultrasottili (0.1 mm foro interno, 50 ~ 80 cm di lunghezza ) sono riempiti con una miscela di perle di resina e collocati in una matrice multi-capillare. Un’estremità della matrice è montata in una piastra catodica caricata negativamente in modo che le loro estremità si allineino con ciascun pozzetto della piastra del campione. L’applicazione di alta tensione fa sì che il DNA etichettato in ciascun campione entri nel capillare corrispondente e migri verso il serbatoio dell’anodo caricato positivamente. A causa delle alte tensioni utilizzate, la separazione elettroforetica richiede solo 1 ~ 3 ore. Come nell’elettroforesi su lastra-gel, i frammenti più piccoli si muovono più rapidamente di quelli più grandi . Le tinture dell’estremità-etichetta sono attivate da un laser nella finestra del rivelatore e la lunghezza d’onda di fluorescenza di ogni frammento è letta da un fotometro mentre passa un punto fisso. A differenza del sistema slab gel, il laser e il fotometro sono fissi e immobili e possono attivare e leggere simultaneamente più capillari affiancati come flussi di dati separati: questo evita il problema di tracciare corsie separate in un slab gel. I dati di mobilità vengono inviati a un computer e per ogni campione viene generato un cromatogramma che è essenzialmente identico a quelli del sistema slab gel.

I sequencer capillari utilizzano tipicamente un robot per caricare automaticamente una pila di piastre campione. La matrice capillare è lavata con l’amplificatore fra i piatti, di modo che la macchina può essere lasciata funzionare incustodita per molti funzionamenti. Nelle strutture più grandi, le reazioni di PCR possono anche essere collegate direttamente alle piastre di sequenziamento in workstation robotiche che servono dozzine o centinaia di sequencer capillari. I dati cromatogramma sono collocati su un server, e possono essere scaricati dagli utenti centinaia o migliaia di miglia di distanza. Le economie di scala possono rendere più economico esternalizzare il sequenziamento del DNA piuttosto che acquistare, mantenere e fornire personale a una macchina interna.