Sistemica agonistica immunoterapia del cancro induce differenziale di espansione di cellule t CD4 e CD8 in linfatico e gli organi periferici
la Combinazione di anti-CD40 con IL-2 ha dimostrato di indurre il ritardo della crescita e regressione in diversi modelli murini tumore . Simile ai dati pubblicati utilizzando modelli tumorali della linea cellulare , il trattamento del modello di neoplasia-escrescenza intraepiteliale mammaria (MIN-O), una linea di trapianto di tessuto, con immunoterapia anti-CD40 e IL-2 (IT) ha portato a risposte antitumorali significative (P = 0,0057) inclusa la regressione in >nel 50% dei topi trattati (File aggiuntivo 1: Figura S1A). Studi precedenti hanno dimostrato che queste risposte antitumorali sono dovute alle cellule T CD8, pertanto abbiamo valutato il fenotipo delle cellule T nella milza e all’interno del tumore e dei polmoni (un sito metastatico comune per molti modelli tumorali diversi). Mentre abbiamo notato l’espansione CD8 generalmente indotta dalla terapia in tutti gli organi, abbiamo notato alcune differenze nel fenotipo della memoria delle cellule T CD8 tra i siti degli organi (File aggiuntivo 1: Figura S1B-C).
Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che le forti terapie immunostimolanti per il cancro inducono una potente proliferazione delle cellule T CD4 e CD8 della memoria (CD44high) nella milza e nei linfonodi . È stato anche osservato che le cellule T CD4, ma non CD8, subiscono anche la morte cellulare indotta dall’attivazione in modo dipendente dall’interferone(IFN)-γ con conseguente insignificante espansione complessiva delle cellule T CD4 in numero in questi stessi organi rispetto al basale . Questi dati sono stati generati utilizzando letture di organi linfoidi. Tuttavia, alla luce dei fenotipi osservati nel cuscinetto MIN-O, i topi trattati con immunoterapia, l’espansione, l’attivazione e l’apoptosi delle cellule T attivate possono essere influenzati in modo differenziato nei tessuti periferici. Pertanto, abbiamo cercato di caratterizzare e confrontare ulteriormente l’attivazione delle cellule T negli organi periferici (dove possono risiedere il tumore primario e/o le lesioni metastatiche) e negli organi linfoidi secondari (che vengono spesso esaminati durante gli studi immunoterapici per valutare i meccanismi d’azione). Abbiamo valutato la frequenza, l’espansione e l’apoptosi sistemica delle cellule T CD8 e CD4 (Foxp3neg) sia negli organi linfoidi che periferici. Coerente con le precedenti relazioni del nostro gruppo, pur non alterando significativamente la loro frequenza complessiva (Fig. 1a), l’immunoterapia anti-CD40/IL-2 ha portato ad una significativa espansione del numero totale di cellule T CD8 nelle milza e nei linfonodi (Fig. 1 ter). In linea con gli aumenti del numero totale di CD8, la frequenza delle cellule T CD8 che incorporavano bromodeossiuridina (BrdU) in vivo è stata significativamente ampliata e la percentuale di cellule apoptotiche valutate mediante espressione extracellulare di Annexina V non è stata significativamente diversa dai controlli (Fig C-D). Al contrario, la frequenza totale delle cellule T CD4 è diminuita e il numero non è cambiato in modo significativo rispetto ai controlli all’interno degli stessi organi (Fig. 1 bis-b). Mentre le cellule T CD4 si espandevano come valutato dall’incorporazione di BrdU, una percentuale significativa di esse stava attraversando anche l’apoptosi (Fig. 1c-d) con conseguente variazione netta insignificante dei numeri totali. Questi dati erano in linea con quanto osservato in precedenza . Quando abbiamo valutato gli organi non linfoidi, inclusi polmoni e fegato, abbiamo visto tendenze simili nelle cellule T CD4 e CD8, vale a dire che le cellule T CD8 si espandevano e sopravvivevano in tutti gli organi successivi (Fig. 2a-b) mentre le cellule T CD4 (Foxp3neg) si stavano espandendo e contemporaneamente stavano attraversando l’apoptosi in misura simile con conseguenti cambiamenti insignificanti sia alle loro frequenze che ai loro numeri (Fig. 2c-d) nella periferia.
Le cellule T CD4 e CD8 hanno risposte differenziali proliferative e apoptotiche alle terapie immunostimolanti negli organi linfoidi. I topi sono stati trattati con immunoterapia anti-CD40/IL-2 e valutati per vari parametri immunitari il giorno 12 di trattamento in organi linfoidi (milza o LN). Percentuale (a) e numero totale (b) di cellule T CD4 (Foxp3-ve) e CD8 negli organi linfoidi. Percentuale di proliferanti (c), come valutato da BrdU, e apoptotici (d), come valutato dalla superficie espressione Annexin V, di CD4 (Foxp3-ve) e CD8 cellule T in organi linfoidi. Questi dati sono rappresentativi di 2-5 esperimenti indipendenti con 3 topi per gruppo. I dati sono presentati come media ± SEM. Statistics were derived using ANOVA with Bonferroni’s post-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: P > 0.05
CD4 and CD8 T cells have differential proliferative and apoptotic responses to immunostimulatory therapies in peripheral organs. I topi sono stati trattati con immunoterapia anti-CD40/IL-2 e valutati per vari parametri immunitari il giorno 12 del trattamento in organi periferici (polmoni o fegato). Percentuale (a) e numero totale (b) di cellule T CD4 (Foxp3-ve) e CD8 negli organi periferici. Percentuale di cellule T CD4 (Foxp3-ve) e CD8 proliferanti (c), valutate dalla BrdU, e apoptotiche (d), valutate dall’espressione dell’allegato V di superficie. Questi dati sono rappresentativi di 2-3 esperimenti indipendenti con 3 topi per gruppo. I dati sono presentati come media ± SEM. Statistics were derived using ANOVA with Bonferroni’s post-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: P > 0.05
di cellule T di memoria fenotipi variare tra organi linfoidi secondari e periferiche non-tessuti linfoidi in cellule T CD8, ma non le cellule T CD4 seguito
In topi, le cellule CD4 e CD8 T può essere ulteriormente suddiviso in memoria e ingenuo fenotipi base CD62L (L-selectina) e l’espressione di CD44 con il CD44lowCD62L+ popolazione considerata ingenua (TN), CD44highCD62L+ popolazione considerata memoria centrale (TCM), e il CD44highCD62Lneg popolazione considerata effettrici e/o di memoria effettrici (TE/EM). È noto che le cellule T CD4 e CD8 differiscono nella loro distribuzione di questi sottoinsiemi negli organi linfoidi e periferici. Mentre le frequenze naïve all’interno delle popolazioni CD4 e CD8 rimangono relativamente simili, la popolazione CD44high è più memoria centrale distorta nelle cellule T CD8 e memoria effettore distorta nelle cellule T CD4 in un organismo a riposo . Tuttavia, negli organi periferici, le cellule T residenti nei tessuti all’interno dei sottoinsiemi delle cellule T CD4 e CD8 sono prevalentemente del fenotipo della memoria effettrice .
Studi precedenti hanno dimostrato che le cellule del fenotipo della memoria (CD44high) sono il tipo cellulare principale che si espande dopo le immunoterapie stimolatorie . Per comprendere meglio la composizione delle cellule T CD4 e CD8 attraverso vari organi, abbiamo valutato il loro stato di fenotipo di memoria in ogni organo che LO segue. A riposo, la popolazione CD44high di cellule T CD8 negli organi linfoidi era prevalentemente TCM (>90%) mentre negli organi periferici, era una combinazione con ~ 60% TCM (Fig. 3 bis, c, e, – f). In generale, SI traduce in un’espansione complessiva della frequenza CD44high attraverso tutti gli organi. Le frequenze TCM sono rimaste invariate o leggermente aumentate, mentre le popolazioni TE / EM si sono notevolmente espanse (Fig. 3e-f) da ~10% a 30% negli organi linfoidi e, in modo impressionante, da ~30-85% negli organi periferici.
Il fenotipo della memoria delle cellule T differisce negli organi linfoidi e periferici dopo l’immunoterapia. I topi sono stati trattati con immunoterapia anti-CD40/IL-2 e valutati per vari parametri immunitari il giorno 12 del trattamento in organi linfoidi (milza o LN) o periferici (polmoni o fegato). a-b diagrammi di punti rappresentativi dell’espressione CD44 vs CD62L nelle cellule T CD8 (a) e CD4 (Foxp3-ve) (b) nei topi di controllo e trattati IT. grafici a torta CD raffiguranti memoria centrale (bianco) vs effector/effector memory (nero) frequenza nella sottopopolazione CD44high nelle cellule T CD8 (c) e nelle cellule T CD4 (d); frequenze di CD44high raffigurate all’interno di fette di torta per data popolazione. (e-f) Frequenza della memoria effettore/effettore (e) e della memoria centrale (f) CD8 (pannelli di sinistra) e CD4 (Foxp3-ve) (pannelli di destra) Cellule T in vari organi di controllo o topi trattati con anti-CD40/IL2. Questi dati sono rappresentativi di 4-5 esperimenti indipendenti con 3 topi per gruppo. I dati sono presentati come media ± SEM
All’interno della popolazione CD44high delle cellule T CD4, i topi a riposo erano più fortemente inclinati verso il fenotipo TE / EM con circa il 60-70% nel linfoide e il 75-95% nei tessuti periferici (Fig. 3 ter, lettera d). Come si è verificato nelle cellule T CD8, dopo di ESSO la proporzione elevata cd44 si è espansa, ma a causa del fatto che era così fortemente inclinata al fenotipo TE / EM in tutti gli organi nei topi a riposo, le frequenze di CD4 TE / EM erano in gran parte coerenti in tutti gli organi nei topi trattati con IT (Fig. 3 e). Le frequenze TCM CD4 sono rimaste relativamente basse e coerenti in tutti gli organi, sia pre-che post-IT (Fig. 3 septies).
L’espressione dei marcatori di attivazione nelle cellule T CD4 e CD8 dipende dalla posizione e dal fenotipo della memoria
Oltre alle differenze nella proliferazione e nell’apoptosi, abbiamo anche notato abitualmente che le cellule T CD4 e CD8 in modo differenziato upregulano l’attivazione e le molecole inibitorie che LO seguono. L’esempio più notevole di questo è il PD-1 che, sulla base di studi incentrati sugli organi linfoidi secondari (milza e LN), è stato preferenzialmente sovraregolato sulle cellule T CD4 e non CD8 e si ritiene probabilmente coinvolto nel processo preferenziale AICD che si è verificato nelle cellule T CD4 ma non CD8 che LO seguono . Un altro esempio potrebbe essere la sovraregolazione preferenziale di NKG2D su cellule T CD8 ma non CD4 che conferisce capacità litica indotta da astante dopo una forte esposizione alle citochine al sottoinsieme di memoria CD8. Studi precedenti del nostro laboratorio e dati presentati in Fig. 3 hanno dimostrato che tra le cellule T CD4 e CD8, le cellule primarie che proliferano attivamente e rispondono ad ESSO sono le cellule fenotipiche ad alta memoria cd44 . Pertanto, ci siamo concentrati su questa popolazione.
Nella popolazione CD44high, è stato dimostrato che le cellule T proliferanti CD8 non riescono a upregolare i marcatori coerenti con l’attivazione di uno stimolo specifico antigene come CD25 e PD-1, ma upregulate i marcatori che consentono loro di acquisire un fenotipo astante, vale a dire NKG2D, conferendo la capacità di agire di più in modo NK-like, antigene Al contrario, CD44high, proliferanti (Foxp3neg) cellule T CD4 sproporzionatamente upregulate PD-1 (in contrasto con le cellule T CD8 e Foxp3+, cellule T CD4 regolatorie) che abbiamo suggerito permette loro di essere preferenzialmente mirati per l’induzione di apoptosi . Coerentemente con questi precedenti rapporti, abbiamo osservato fenotipi simili tra splenici e linfonodali residenti, trattati con cellule T CD44highCD8+, che hanno significativamente sovraregolato NKG2D ma non PD-1 (Fig. 4a, c), e CD44highCD4+ cellule T, che robusto upregulated PD-1, ma non NKG2D (Fig. 4 ter, lettera d). Quando abbiamo valutato gli stessi marcatori fenotipici nelle popolazioni di cellule T residenti negli organi periferici non linfoidi, il fenotipo delle cellule T CD44highCD8 + era notevolmente diverso da quello di quelli residenti negli organi linfoidi secondari. Mentre le cellule T CD44highCD8 + residenti nei polmoni e nel fegato erano ancora NKG2D + CD25neg (Fig. 4a, c), la frequenza delle cellule NKG2D+ in questa popolazione sembrava aumentare dal 20-30% negli organi linfoidi al 40-50% negli organi periferici (Fig. 4 bis). Inoltre, in contrasto con gli organi linfoidi in cui l’espressione di PD-1 era invariata, l’espressione di PD-1 era aumentata significativamente sia nei polmoni che nel fegato dopo di ESSA nella popolazione CD44highCD8+ (Fig. 4 quater). Al contrario, il fenotipo delle cellule T CD44highCD4 era notevolmente simile alle cellule T CD4 della milza e dei linfonodi in tutti gli organi (Fig. 4b, d) con espressione comparabile di PD-1 e sovraregolazione minima di NKG2D. CD25 non è stato sovraregolato in cellule T CD4 o CD8 in qualsiasi sito (dati non mostrati). Questo è stato inaspettato perché abbiamo precedentemente suggerito che l’espressione differenziale di PD-1 era probabilmente il meccanismo alla base dell’induzione differenziale dell’apoptosi tra le cellule T CD4 e CD8 a seguito di regimi IT forti e immunostimolanti. Tuttavia, negli organi periferici, le cellule T CD4 continuano ad essere colpite in modo sproporzionato dall’apoptosi nonostante il fatto che l’espressione PD-1 sia paragonabile tra le cellule T CD4 e CD8. Questo modello emerso era anche interessante perché l’aumentata espressione del marker di attivazione nella periferia sembrava correlare direttamente con la predominanza di TE/EM, in particolare nel caso di PD-1.
Espressione differenziale di attivazione e marcatori inibitori nelle cellule T CD8 dipendenti dalla posizione. I topi sono stati trattati con immunoterapia anti-CD40/IL-2 e valutati per vari parametri immunitari il giorno 12 del trattamento in organi linfoidi (milza o LN) o periferici (polmoni o fegato). Percentuale NKG2D+ (a-b) e PD-1 + (c-d) delle cellule T CD8 (a, c) e CD4 (Foxp3-ve) (b, d) attraverso vari organi. Grafici a torta raffiguranti CD8 EM / CM di ciascun organo in determinate condizioni di trattamento / organo. Questi dati sono rappresentativi di 2-4 esperimenti indipendenti con 3 topi per gruppo. I dati sono presentati come media ± SEM. Le statistiche sono state derivate usando ANOVA con il post-test di Bonferroni, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
Recentemente è stato dimostrato che le cellule TE / EM circolanti esprimono livelli elevati di PD-1 negli esseri umani a riposo . Pertanto, abbiamo ipotizzato che le cellule CD8+ TE/EM possano esprimere preferenzialmente questi marcatori di attivazione rispetto a CD8 + TCM con conseguente frequenza differenziale delle cellule T CD44highCD8 + che esprimono marcatori di attivazione in organi linfoidi secondari e periferici che LO seguono. Pertanto, abbiamo valutato l’espressione NKG2D e PD-1 su cellule CD8 + CD44highCD25neg TE/EM e TCM su tutti gli organi in topi a riposo e trattati IT. Nei topi di controllo, sia NKG2D (Fig. 5a) e PD – 1 (Fig. 5c) sono stati espressi ad una frequenza più elevata sul sottoinsieme TE/EM della popolazione CD8 + CD44highCD25. Tuttavia, la frequenza complessiva della popolazione TE/EM tra le cellule T CD8 + nei topi a riposo è relativamente bassa rispetto alla TCM (grafici a torta Fig. 5a), quindi, nel complesso l’espressione sia di PD-1 che di NKG2D è prevalentemente bassa (Fig. 4) poiché TCM costituisce la maggior parte delle cellule T CD8+ a riposo. Nei topi trattati con immunoterapia, sia l’espressione NKG2D che PD-1 sono state aumentate in tutti gli organi (Fig. 4). Ancora una volta, sia NKG2D (Fig. 5b) e PD – 1 (Fig. 5d) sono stati espressi più altamente sulle cellule T TE / EM CD8 + rispetto alle cellule T TCM CD8+. Negli organi linfoidi, dove la popolazione TE/EM si è espansa rispetto al controllo, era ancora significativamente inferiore alle cellule CD8 + TCM (grafici a torta, Fig. 5b) con conseguente meno significative espansioni in questi siti. Contrariamente agli organi linfoidi, le cellule CD8+ TE / EM costituivano la maggior parte degli organi periferici analizzati (grafici a torta, Fig. 5b) rendendo così l’espressione complessiva di NKG2D e PD-1 significativamente più alta in questi siti. Ancora una volta è importante notare che negli organi linfoidi dei topi trattati con immunoterapia, l’espressione complessiva di entrambi i marcatori di attivazione era significativamente inferiore rispetto agli organi periferici a causa dell’inclinazione della TCM nei linfatici sulla periferia nella popolazione CD8. I livelli di espressione non variavano notevolmente tra TE / EM da diversi organi (non c’erano differenze significative tra organi linfoidi e periferici) all’interno degli stessi gruppi di trattamento, ma generalmente aumentavano nel trattamento IT rispetto al controllo, una tendenza che era più significativamente pronunciata con NKG2D rispetto a PD-1 (Fig. 5). Al contrario, l’espressione del marcatore di attivazione TCM è rimasta relativamente costante non solo tra gli organi dei topi all’interno di un gruppo di trattamento, ma anche tra i gruppi di controllo e quelli trattati dall’IT (Fig. 5 bis-b). Presi insieme, questi dati suggeriscono che la costituzione del pool memoria/attivato (TCM vs TE/EM) pesa pesantemente sul fenotipo della popolazione di cellule T attivate, in particolare con le cellule T CD8 poiché la loro costituzione varia notevolmente tra organi linfoidi e non linfoidi.
I fenotipi differenziali delle cellule T CD8 per posizione sono correlati con una maggiore espansione e attivazione del marker upregulation sul fenotipo delle cellule T della memoria effettore / effettore. I topi sono stati trattati con immunoterapia anti-CD40/IL-2 e valutati per vari parametri immunitari il giorno 12 del trattamento in organi linfoidi (milza o LN) o periferici (polmoni o fegato). Frequenze di NKG2D+ (a-b) e PD-1+ (c-d) in CD25negCD44highCD8+ cellule T in controllo (a, c) e anti-CD40/IL-2 (b, d) topi trattati come stratificati da TCM (CD62L+, bianco) e TE/EM (CD62L-, nero). Questi dati sono rappresentativi di 2-3 esperimenti indipendenti con 3 topi per gruppo. I dati sono presentati come media ± SEM. Le statistiche sono state derivate usando ANOVA con il post-test di Bonferroni, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
Valutazione delle cellule T nei pazienti trattati con alte dosi sistemica terapia immunostimolante
poi abbiamo voluto valutare se questi risultati tradursi in pazienti che ricevono immunostimolante terapie per il cancro. Attualmente non ci sono studi che valutino la combinazione agonistica anti-CD40 con IL-2 umano ricombinante, tuttavia abbiamo regolarmente confrontato la nostra terapia di combinazione con altri trattamenti immunostimolanti sistemici inclusi agonisti TLR ad alte dosi e terapie con citochine sistemiche ad alte dosi e mostrato cambiamenti fenotipici e funzionali simili alle cellule T osservati nel nostro modello preclinico . Per valutare se i pazienti nella clinica hanno mostrato cambiamenti simili nell’espressione del marker superficiale, abbiamo raccolto cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da pazienti con melanoma metastatico sottoposti a terapia IL-2 ad alte dosi sistemiche. I pazienti hanno ricevuto 6×10^5 UI / Kg ogni 8 ore per un totale pianificato di 14 dosi. I campioni di PBMC sono stati raccolti un giorno prima dell’inizio della terapia (basale) o il giorno 8 del primo ciclo di terapia (giorno 8) per valutare il fenotipo delle cellule T. Confrontando i campioni al basale e al giorno 8, si è verificato un aumento significativo delle cellule del fenotipo di memoria PD-1 + (CD45RO+) sia nei sottoinsiemi delle cellule T CD4 che CD8 a seguito di terapia con IL-2 ad alte dosi (Fig. 6 bis-c). Quando questa popolazione è stata ulteriormente suddivisa in memoria centrale (CD62L+) e memoria effettuatore/effettuatore (CD62L -) al punto temporale del giorno 8, il sottoinsieme di memoria effettuatore/effettuatore ha espresso un’espressione PD-1 significativamente più alta rispetto al sottoinsieme di memoria centrale (Fig. 6d-e). Insieme, questi dati sono correlati con ciò che è stato osservato negli studi murini suggerendo che questi dati sono applicabili agli studi sull’uomo e possono essere un indicatore di ciò che si sta verificando localmente.
Memoria effettore / effettore Cellule T da cellule T umane sottoposte a terapia IL-2 esprimono PD-1 sovraregolato. Le PBMC sono state isolate prima della terapia e al giorno 8 di trattamento da pazienti sottoposti ad alta dose di terapia sistemica IL-2 per il melanoma. Le PBMC sono state valutate per l’espressione del sottoinsieme delle cellule T di PD-1 mediante citometria a flusso. una strategia di gating rappresentativo per la colorazione dei PBMC umani. frequenza BC dell’espressione PD-1 sulle celle T CD4 (b) e CD8 (c) di memoria. (d-e) Frequenza dell’espressione PD-1 su sottoinsiemi centrali (CD45RO + CD62L+) e memoria effettore (CD45RO + CD62L -) nelle celle T CD4 (d) e CD8 (e). Sei campioni di pazienti sono stati inclusi in questo set di dati. I dati sono presentati come media ± SEM. Le statistiche sono state derivate usando il test T dello studente, * P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001
