Abstract
Voltage-gated L-type Cav1.2 canali del calcio accoppiano la depolarizzazione della membrana all’aumento transitorio della concentrazione di Ca2+ libera citoplasmatica che avvia una serie di funzioni cellulari essenziali tra cui la contrazione muscolare cardiaca e vascolare, l’espressione genica, la plasticità neuronale e l’esocitosi. L’inattivazione o la terminazione spontanea della corrente di calcio attraverso Cav1.2 è un passo critico nella regolazione di questi processi. Il significato fisiopatologico di questo processo si manifesta in ipertensione, insufficienza cardiaca, aritmia e una serie di altre malattie in cui l’accelerazione del decadimento della corrente di calcio dovrebbe presentare una funzione di beneficio. Il problema centrale di questo documento è l’inattivazione del canale del calcio Cav1.2 mediato da più determinanti.
1. Introduzione
La corrente Ca2+ verso l’interno voltaggio-gated () è un meccanismo comune di aumento transitorio della concentrazione libera citoplasmatica di Ca2+ innescata dalla depolarizzazione cellulare. Questa forma di segnalazione Ca2 + attiva i processi cellulari essenziali tra cui la contrazione cardiaca , la regolazione di un tono muscolare liscio , l’espressione genica, la plasticità sinaptica e l’esocitosi . La terminazione completa e rapida dell’afflusso di Ca2+ è mediata da un intricato meccanismo di inattivazione spontanea dei canali del calcio, che è cruciale per prevenire il sovraccarico di Ca2+ della cellula durante i potenziali d’azione e il ripristino della concentrazione di Ca2+ libera citoplasmatica sub-µM a riposo . Questo articolo si concentrerà sulle basi molecolari e sui determinanti multipli dell’inattivazione del canale del calcio Cav1.2.
2. Cav1. 2: Sfide e soluzioni
2.1. Complessità molecolare
Il canale del calcio Cav1.2 è un complesso oligomerico composto dalle subunità A1C, α2δ e β . Il poro del canale ionico è formato dal peptide a1C (Figura 1) codificato dal gene CACNA1C. Le subunità ausiliarie β e α2δ sono essenziali per l’espressione funzionale e il targeting della membrana plasmatica (PM) del canale . Esistono in più isoforme genomiche generate da quattro geni CACNB (CACNB1–4) e tre geni CACNA2D (CACNA2D1–3). Tutte e tre le subunità sono soggette a splicing alternativo. Aggiungendo alla complessità dell’organizzazione molecolare Cav1 .2, le subunità β tendono ad oligomerizzarsi. Tutti insieme, la variabilità genomica, lo splicing alternativo e l’etero-oligomerizzazione generano una pletora di varianti di splice Cav1.2 che sono espresse nelle cellule in modo specie, tessuto e dipendente dallo sviluppo, mentre il cambiamento del loro equilibrio fine può avere conseguenze fisiopatologiche significative .
2.2. Sfide nella selezione della cellula ospite
La diversità naturale di Cav1.2 complica l’interpretazione dei dati ottenuti da cellule native, per non parlare dei dati a canale singolo. Ciò è alla base dell’importanza della ricerca Cav1.2 nei sistemi di espressione ricombinante in cui la composizione molecolare del canale e la struttura dei suoi costituenti sono predefiniti. Tuttavia, questo approccio sperimentale ha incontrato il problema principale della selezione di una cellula ospite appropriata.
La maggior parte degli studi sui canali del calcio sono stati effettuati utilizzando cellule HEK293. Queste cellule forniscono un’elevata efficienza di espressione dei canali Ca2 + ricombinanti ma, sfortunatamente, contengono canali del calcio endogeni che presentano correnti Ca2+ fino a 3 pA/pF . Pertanto, le cellule HEK293 consentono lo studio adeguato dei canali Ca2 + ricombinanti solo quando l’ampiezza della corrente è abbastanza grande da ignorare il contributo dei canali endogeni. La corretta valutazione dei determinanti funzionali dei canali Ca2+, tuttavia, richiede l’uso di cellule ospiti completamente prive di subunità endogene del canale Ca2+. Le cellule COS1 o COS7 si adattano bene a questo requisito perché non generano alcuna corrente di calcio apprezzabile, non contengono subunità endogene del canale Ca2+ o i loro precursori e non mostrano alcuna induzione di subunità Cav1.2 endogene in risposta all’espressione di quelle ricombinanti . I parametri cinetici e la dipendenza dalla tensione di attivazione e inattivazione delle correnti del canale Cav1 .2 misurate nelle celle COS1 sono coerenti con i dati ottenuti in altri sistemi di espressione. Un importante vantaggio delle celle COS è il loro tasso di divisione relativamente lento che consente un migliore controllo sull’efficienza di espressione e assemblaggio delle subunità del canale Cav1.2 di dimensioni diverse.
2.3. Problemi di etichettatura e misurazione fluorescenti
La fusione di fluorofori simili a GFP ai termini N e / o C dell’A1c ricombinante o all’N-terminale di β non modifica marcatamente le proprietà elettrofisiologiche dei canali espressi, consente l’applicazione della microscopia fluorescente e FRET (fluorescent resonance energy transfer) allo studio della distribuzione subcellulare e dell’assemblaggio di Cav1.2, nonché aspetti complessi dell’architettura molecolare e della dinamica del canale. Il canale mantiene invariate le principali caratteristiche elettrofisiologiche quando la sequenza C-terminale A1C codificata dagli esoni distali 46-50 (Figura 1, residui 1833-2138 in a1C,77) viene sostituita da ECFP. Tuttavia, a1C fuso dal suo N-o/e C-termini a EYFP è altamente sensibile al photobleaching che irreversibilmente lo inattiva. Nota come fluorophore-assisted light inactivation (FALI), questa interessante proprietà limita l’applicabilità del fotobleaching accettore per le misure di FRET in Cav1.2 a causa dell’incertezza nello stato funzionale del canale . Tuttavia, l’analisi raziometrica del TASTO corretto tra i fluorofori, fusi alle code delle subunità A1C e / o β, riflette i riarrangiamenti strutturali reversibili dipendenti dallo stato del canale indotti dai cambiamenti della tensione transmembrana sotto il morsetto patch .
2.4. Cav1. 2 ricombinante: di cosa ha bisogno per l’espressione funzionale e come appare?
Le proprietà tipiche di un Cav1.2 ricombinante “wild-type” sono illustrate nella Figura 2(A) utilizzando un esempio dell’onnipresente isoforma umana a1C,77 (GenBank no. z34815). Quando l’A1C marcato con EYFP è stato espresso nelle sole cellule COS1, la proteina del canale contrassegnata con fluorescenza è stata distribuita diffusamente sul citoplasma e non ha generato corrente di calcio misurabile (Figura 2(A), pannello a). L’analisi quantitativa della distribuzione di a1C tra PM e citoplasma (Figura 2(B)) ha confermato la mancanza di targeting significativo del PM da parte di a1C indipendentemente dalla presenza di α2δ (barre a e b). L’espressione di Cavß in assenza di α2δ ha stimolato il targeting PM di a1C, ma il canale è rimasto silenzioso (Figura 2(A), pannello c) a meno che α2δ non fosse coespresso (pannello d). Pertanto, le subunità β e α2δ sono sufficienti per il canale funzionale; in queste condizioni sperimentali, le subunità β stimolano il targeting PM del complesso del canale e, in presenza di α2δ, facilitano il gating di tensione del canale Cav1.2.
La forma e l’aspetto della corrente di calcio di picco mostrato in Figura 2(A) (pannello d) è abbastanza tipico per il Cav1.2 modulato β2 . Le sue caratteristiche principali includono il tasso relativamente lento di decadimento e una grande frazione del sostenuto rimanente alla fine dell’impulso depolarizzante . È chiaro che durante potenziali d’azione di lunga durata tali proprietà possono portare a sovraccarico di calcio patogeno della cellula se non è bilanciato da robusti meccanismi compensatori. Era il ruolo ultimo di Cav1.2 nel definire la durata del potenziale d’azione nelle cellule cardiache che ha innescato la ricerca e lo sviluppo di calcio-antagonisti, una classe di farmaci che ormai ha un mercato da un miliardo di dollari. È questo ruolo di Cav1.2 che stimola l’attuale interesse per l’identificazione dei determinanti molecolari dell’inattivazione di Cav1.2 nella speranza di trovare farmaci più specifici e più efficaci.
2.5. Ultima ma non meno importante complicazione: Clustering Cav1.2
Un singolo miocita ventricolare contiene ~300.000 canali Cav1.2, ma solo ~3% dei canali sono aperti al picco . Contrariamente alla credenza popolare, i canali Cav1.2 non sono distribuiti uniformemente sulla membrana plasmatica. Nelle cellule del muscolo neuronale e cardiaco nativo formano grandi cluster. L’imaging a singola molecola dei canali EYFPN-A1c/ß2a/α2δ ricombinanti funzionali espressi nelle cellule HEK293 ha rivelato cluster composti da ~ 40 canali mobili nella membrana plasmatica . Sia la spettroscopia di correlazione della fluorescenza che il recupero della fluorescenza dopo esperimenti di fotobleaching hanno prodotto una costante di diffusione laterale di µm2 / s. Il significato funzionale della mobilità dei cluster Cav1.2 non è chiaro. Si ritiene che nelle cellule del muscolo cardiaco tale mobilità possa essere trattenuta dalle interazioni con altre proteine, ad esempio i recettori della ryanodina . La dimensione dei cluster Cav1.2 e la loro densità specifica nella membrana plasmatica dipendono dal tipo di subunità β espressa . La distanza tra i termini delle subunità vicine a1C varia da 67 Å con ß1b neuronale/cardiaco a 79 Å con β3 vascolare. La più alta densità di cluster Cav1.2 nella membrana plasmatica e la dimensione del cluster più piccola sono state osservate con ß1b presente. La comprensione dei meccanismi molecolari che definiscono l’architettura e le proprietà dei cluster Cav1.2 è importante per una migliore comprensione della fisiopatologia dell’accoppiamento tra l’attività Cav1.2 e le risposte indotte nella trasduzione del segnale Ca2+.
3. Inattivazione dipendente da tensione e Ca2 + del canale del calcio Cav1.2
Nel caso dei canali del calcio Cav1.2, due diversi meccanismi controllano l’inattivazione della corrente Ca2+. Un meccanismo è guidato da ioni Ca2+ sul lato citoplasmatico della membrana plasmatica, mentre l’altro dipende dalla tensione transmembrana. Sperimentalmente, la sostituzione di Ca2 + per Ba2 + come vettore di carica elimina l’inattivazione dipendente da Ca2+(CDI) in modo che i canali del calcio conduttori di Ba2+inattivino in modo dipendente dalla tensione mediante meccanismi veloci (FI) e lenti (SI). Questi tre meccanismi di inattivazione, FI, SI e CDI, e i loro principali determinanti sono illustrati nella Figura 3.
3.1. L’inattivazione dipendente da Ca2 + e il dominio di legame alla calmodulina di a1C
Esistono diversi determinanti della CDI, ma non è stato fino al 1997 che il sito di rilevamento di Ca2+di CDI era stato ridotto a un tratto della sequenza C-terminale 80-amminoacido di a1C codificata dagli esoni 40-42 (Figura 2) contrassegnato dal blocco rosso nella Figura 3(A) (pannello a). Una variazione di giunzione naturale in questa regione in a1C, 86(Figura 3 (B)) ha completamente inibito il CDI in quanto è evidente dalla mancanza di decelerazione della corrente con Ba2+ come vettore di carica (pannello c, traccia nera) rispetto a (traccia rossa). Un’altra caratteristica del CDI inibito era la mancanza della dipendenza della dimensione corrente di tensione (Figura 3(B), pannello d, simboli aperti) che rimane in contrasto con la dipendenza a forma di U della costante di tempo di inattivazione rapida () sul potenziale di membrana nel Cav1.2 wild-type (vedi Figura 3(A), pannello d). Due sequenze distinte, L e K, sono state identificate all’interno di questo tratto di 80 aminoacidi le cui mutazioni a1C,86-like nell’A1C wild-type sono conformi alle stesse caratteristiche , suggerendo l’esistenza di due sensori CDI adiacenti. Uno di questi è stato delineato nella regione K come motivo IQ di legame calmodulina- (CaM-) e, in seguito, il collegamento del motivo IQ a CDI come sito di legame funzionale Ca2+-CaM è stato confermato in tre studi indipendenti dall’uso di mutanti CaM privi di affinità con Ca2+. Corrispondentemente, il motivo LA è stato collegato al CDI come sito di rilegatura apo-CaM dotato dello stato di riposo del canale. Una singola molecola CaM legata a questo Ca2 + – dipendente CaM-binding domain (CBD) di a1C è il principale sensore Ca2+ del canale .
Variazione di giunzione di a1C nella regione CBD di a1C, 86 non solo inibisce completamente CDI, ma rimuove anche SI(Figura 3 (B), pannello c) e priva il canale di sensibilità differenziale alla modulazione β-subunità (Figura 3(B), pannello e) nonostante il fatto che β rimane associato a a1C, 86 (Figura 3(B), pannello b). Ciò indica che tutte e tre le proprietà del canale—modulazione CDI, SI e β-subunità—sono collegate tra loro .
3.2. Inattivazione lenta
Sono state presentate numerose evidenze che gli amminoacidi confinati nella parte distale dei segmenti S6 in a1C svolgono un ruolo importante in SI . Lo studio sistematico di questa regione ha delineato il “determinante annuale dell’inattivazione lenta” (ADSI) come una struttura composta da quattro aminoacidi altamente conservati di quattro segmenti transmembrana S6, che costituiscono l’estremità citoplasmatica del poro(Figura 3 (A), pannello a). La loro mutazione simultanea (S405I in IS6, A752T in IIS6, V1165T in IIIS6 e I1475T in IVS6) genera il canale A1C, IS-IV. L’analisi della cinetica corrente del canale A1C, IS-IV ha mostrato un’accelerazione tremenda del componente inattivante rapidamente ( ≤ 10 ms) che comprende circa il 50% dell’ampiezza totale (o). L’inattivazione lenta tensione-dipendente di a1C, IS-IV è completamente inibita e il canale rimane conduttore per la durata della depolarizzazione. La sostituzione di Ca2 + per Ba2 + come vettore di carica (pannello c) non ha modificato significativamente questo modello di inattivazione, mentre l’analisi della dipendenza dalla tensione di per il componente inattivante di attraverso l’a1C,canale IS-IV (pannello d) ha confermato la mancanza di CDI. La sostituzione di ß1a per ß2a (pannello e) non ha modificato l’inattivazione della corrente del canale A1C,IS-IV suggerendo la mancanza di modulazione differenziale della subunità β, mentre l’analisi di co-immunoprecipitazione (pannello b) ha fornito prove dirette di associazione tra a1C,IS-IV e β.
Nel loro insieme, i risultati presentati in Figura 3 suggeriscono che esiste un cross-talk tra ADSI, CBD e β, supportato da interazioni dirette tra loro e / o piegatura conformazionale specifica dei costituenti del fascio polipeptidico sottostante il poro. Infatti, sia l’interazione di β con CBD che l’importanza della conformazione funzionale sono state direttamente dimostrate in cellule vive che esprimono il Cav1.2 ricombinante.
3.3. Ruolo della piegatura della C-coda di a1C
La microscopia quantitativa del TASTO tensione-dipendente combinata con il morsetto della toppa nella cella in tensione ha indicato che la coda del C-terminale della subunità di a1C è conforme ai riarrangiamenti conformazionali voltaggio-gated reversibili . L’ancoraggio della coda C a1C al foglio interno della membrana plasmatica tramite il dominio di omologia pleckstrin (PH) fuso al terminale C di a1C (a1C -) ha abolito questo riarrangiamento conformazionale e inibito sia il SI che il CDI (Figura 4(A)) in un modo molto simile a quello osservato con A1C,IS-IV (Figura 3(C)). Questa modifica che limita la mobilità del terminale carbossilico a1C ha avuto importanti implicazioni sulla trasduzione del segnale Ca2+. L’attivazione trascrizionale CREB-dipendente associata all’attività di Cav1.2 è stata completamente soppressa nonostante la robusta generata dal canale “C-ancorato” in risposta alla depolarizzazione. Il rilascio della coda C a1C mediante l’attivazione dell’idrolisi PIP2 dopo l’attivazione della fosfolipasi C ripristina completamente tutte queste funzioni carenti, tra cui SI, CDI e l’accoppiamento efficace della trascrizione CREB-dipendente . Pertanto, è la piegatura funzionale specifica della coda C-terminale a1C che è cruciale per l’inattivazione. È fondamentale per la trasduzione del segnale perché è progettato per ingabbiare il Ca2 + permeante in CAM collegato al CBD e per spostare efficacemente questo Ca2+ in gabbia verso bersagli di segnalazione a valle associati alla trascrizione CREB-dipendente o alla contrazione del muscolo cardiaco . Soprattutto, questa funzione si verifica in stretto coordinamento con gli stimoli extracellulari che attivano il canale. In termini di trasduzione del segnale, SI è un blocco all’interno del canale che viene rilasciato dal Ca2+ permeante per accelerarne la chiusura e avviare il movimento della coda del terminale C.
3.4. Ruolo dell’A1C N-Terminus
Tutte le funzioni sopra menzionate dipendono anche dall’integrità dell’A1C N-terminus. Le proprietà di inattivazione del canale ricombinante a1C / β / α2δ non sono notevolmente alterate dai cambiamenti strutturali della parte prossimale della coda a1C N, ad esempio, dalla fusione di una proteina fluorescente , dal dominio del pH o dallo splicing alternativo di esoni 1/1A che generano l’isoforma lunga di a1C . La primissima analisi funzionale dell’effetto della delezione parziale dell’A1c N-terminale ha mostrato che è coinvolto nell’inattivazione mentre β impedisce l’inibizione del canale da parte della N-coda. Utilizzando la microscopia FRET combinata con patch clamp, abbiamo scoperto che l’inattivazione causa un forte riorientamento reciproco di A1C e ß1a NH2-termini, ma la loro distanza rispetto alla membrana plasmatica non viene modificata in modo apprezzabile . Questa relativa mancanza di mobilità è conferita da β in modo da facilitare la risposta del canale al gating di tensione. Esperimenti sul disaccoppiamento della subunità A1c Coda N-terminale dalla regolazione del canale sono stati effettuati in assenza di β. L’ancoraggio dell’A1c N-tail nel foglio interno della membrana plasmatica attraverso il dominio del PH collegato ha creato condizioni in cui PHN-a1C e α2δ erano sufficienti per generare una robusta corrente verso l’interno (Figura 4(B)). Questo canale, tuttavia, è privo di CDI e di qualsiasi inattivazione dipendente dalla tensione. Infatti, né Ba2+ né Ca2+ corrente ha mostrato decadimento apprezzabile (vedi tracce sovrapposte). Il rilascio della N-coda di A1C sopra idrolisi PIP2 dall’attivazione della fosfolipasi C completamente ha inibito il canale β-carente . Proprietà simili, ad eccezione di un’attivazione molto più lenta della corrente, sono state osservate sulla cancellazione dell’intera coda N-terminale (ma 4 aminoacidi) di a1C(Figura 4 (C)). Con entrambi i tipi di disaccoppiamento della coda N-terminale a1C—sia attraverso una cancellazione o mediante ancoraggio PM,—un ritardo nell’attivazione della corrente dell’intera cella sembra essere associato al prolungamento della prima latenza. Le registrazioni a canale singolo hanno rivelato che la cancellazione della coda N ha sostanzialmente stabilizzato lo stato aperto del canale ΔN-a1C/α2δ, che ha mostrato aperture più lunghe durante la depolarizzazione di lunga durata .
Quindi, il CDI è mediato dai determinanti CBD della coda C a1C, dall’ADSI nella regione dei pori citoplasmatici e dal ripiegamento del C A1c e N-termini. La calmodulina integra questi determinanti, fornendo un interruttore Ca2+-dipendente che termina l’inattivazione lenta, rilascia la coda a1C C e sposta la Ca2+/calmodulina associata che agisce come stimolo attivante della trasduzione del segnale Ca2+.
3.5. Espressione e inattivazione di Cav1.2 in assenza di β e α2δ
Le subunità β e α2δ sono essenziali per l’espressione funzionale del canale Cav1.2? L’analisi degli effetti del CaM esogeno (CaMex) sull’espressione e sulle proprietà di Cav1.2 in assenza di β o α2δ ha chiaramente dimostrato che né β né α2δ sono essenziali. La sovraespressione di CaMex modifica solo leggermente il gating di tensione del canale a1C/ß2d / α2δ spostando la dipendenza dalla tensione di attivazione e inattivazione verso potenziali più negativi, facilitando (ma non accelerando) l’inattivazione e aumentando la densità di circa 2 volte . Il CDI viene mantenuto, come è evidente dall’effetto della sostituzione di Ca2+ con Ba2+ come vettore di carica che ha aumentato significativamente il corso temporale di inattivazione della corrente (Figura 5(A)). La nuova comprensione dei ruoli di β e α2δ viene con la scoperta che CaMex rende l’espressione e l’attività del canale a1C in assenza di β(Figura 5 (B)) o α2δ(Figura 5 (C)), ma non entrambe queste subunità ausiliarie. Sebbene CaMex sia strutturalmente estraneo a β e α2δ, supporta il traffico, il CDI e il gating dei canali. L’analisi quantitativa ha mostrato che CaMex non ha stimolato la ridistribuzione di A1C nel PM sul citoplasma, ma ha migliorato significativamente il targeting della membrana plasmatica dei canali A1C/α2δ. D’altra parte, CaMex non ha migliorato la distribuzione relativa dei canali a1c/ß2d e a1c/ß2d/α2δ nella membrana plasmatica sul citoplasma. Pertanto, a seconda della subunità ausiliaria presente, l’attività del canale supportata da CaMex di a1C/ß2d e a1C/α2δ è sotto il controllo di diversi meccanismi. Nonostante ciò, i canali a subunità singola ausiliaria facilitati da CaMex mostrano proprietà abbastanza simili tra cui cinetiche di inattivazione significativamente più lente della corrente di calcio e un forte spostamento della dipendenza dalla tensione di attivazione e inattivazione verso potenziali più negativi. Simili ai canali convenzionali A1C/ß2d/α2δ, questi canali mantengono la CDI e l’alta sensibilità ai bloccanti dei canali del calcio diidropiridina . Tuttavia, solo il canale A1C/β / CaMex mostra la facilitazione della corrente di calcio mediante forte prepulse di depolarizzazione (dati non mostrati).
Poiché la CAM associata al CBD è coinvolta nella CDI, è chiaro che l’effetto di CaMex è mediato da diversi siti di legame CAM. Uno dei potenziali candidati di tale sito è presente nella parte distale della coda N-terminale a1C . Resta da vedere se questo sito svolge effettivamente un ruolo di integrazione nel fascio normativo di diversi determinanti molecolari che supportano l’inattivazione di Cav1.2. Un’altra possibilità limita il ruolo di CaMex all’attivazione di silent Cav1.2 all’interno dei grandi cluster, dove la limitata disponibilità locale di CAM può essere la ragione della bassa attività frazionaria descritta nella Sezione 2.5. Qualunque siano i meccanismi associati alla regolazione di Cav1.2 da CaM, sembrano avere poche implicazioni pratiche per l’uso in medicina in questo momento esattamente perché CaM è un peptide onnipresente e multifunzionale che regola molte altre funzioni cellulari, mentre la sua presenza in Cav1.2 è vitale per CDI.
4. β-Subunità Modulazione di Cav1.2
La notevole variabilità molecolare delle subunità β, riflessa nelle alterate proprietà di inattivazione del Cav1.2 differenzialmente modulato , esemplificata nella Figura 3(A) (pannello e) presenta una nuova opportunità per lo sviluppo di approcci innovativi per il trattamento delle malattie associate al maltrattamento di Ca2+. Diverse osservazioni recenti forniscono una base per una visione così ottimistica. In primo luogo, subunità β mostrano una tendenza a formare omo – ed etero-oligomeri che è stato direttamente dimostrato da una varietà di tecniche biochimiche in entrambe le cellule native e nel sistema di espressione ricombinante. Mentre un aumento di β homooligomerization aumenta significativamente la densità di, heterooligomerization delle varianti della giuntura β2 con altre subunità β può anche cambiare la tensione-dipendenza e la cinetica di inattivazione di Cav1 .2. La β-oligomerizzazione è mediata da diversi determinanti molecolari e quindi necessita di interventi multipli da gestire, ad esempio in caso di sovraespressione patogena di β2. Tuttavia, sembra essere più fattibile colpire β2 stesso; il determinante molecolare dell’inattivazione lenta e incompleta β2-specifica (vedi Figura 2(A), pannello d) è stato identificato come il determinante C-terminale di 40 aminoacidi (ß2CED) presente in tutte le 7 varianti di giunzione β2 conosciute in natura. Disaccoppiamento della sua interazione Ca2 + -e CaM-indipendente con CBD(Figura 3 (A), pannello a) recupera le proprietà di inattivazione caratteristiche per ß1b/β3-modulato Cav1.2 esibendo inattivazione rapida e completa di, come è stato dimostrato in esperimenti di delezione. A mio avviso, tale disaccoppiamento selettivo di ß2CED dal legame al suo recettore nella CBD è una nuova strategia interessante per gestire il sovraccarico di Ca2+ perché altre subunità β non devono essere influenzate. Inoltre, un cross-talk tra Cav1.2 e il bersaglio più vicino Ca2+/CaM-dipendente protein chinasi II sarà conservato.
5. Conclusioni
Questo lavoro ha dimostrato che sappiamo come accelerare l’inattivazione del Cav1.2 a meno di 10 ms (Figura 3(C)), privarlo completamente dell’inattivazione (Figure 4(B) e 4(C)), o eliminare la dipendenza della sua espressione da β o α2δ senza conseguenze significative per l’inattivazione. Abbiamo delineato i ruoli finali di A1C termini e CaM per l’inattivazione, eppure nessuno di questi studi ci ha avvicinato all’obiettivo finale di gestire il maltrattamento del calcio associato a Cav1.2 eccetto di bloccanti di canale di calcio vecchi e, sfortunatamente, non troppo selettivi. L’unico nuovo obiettivo fattibile è la modulazione β2 patogena di Cav1.2, in cui viene stabilita l’interazione effettore-recettore.
In termini di biologia molecolare, Cav1.2 è certamente tra i sistemi normativi più complicati conosciuti. Notevole diversità molecolare di ciascuno dei Cav1.2 costituenti dà origine a molteplici varianti genetiche / di giunzione del canale che sono soggette a segregazione in cluster grandi e diversi e al continuo cambiamento funzionale attraverso l’omo – ed etero-oligomerizzazione di β e di altri componenti di segnalazione, per non parlare di specie, tessuti e variabilità dello sviluppo. Siamo sorpresi dalla ridondanza delle proprietà di più isoforme Cav1 .2 e siamo ancora più sorpresi quando alcune di esse, mostrando solo proprietà elettrofisiologiche “convenzionali”, risultano essere associate a una malattia. Nel cercare una spiegazione, la nostra intuizione non dovrebbe essere intuitivamente focalizzata solo sulle caratteristiche della dipendenza corrente-tensione del calcio, ampiezza e durata. La risposta finale , come l’organizzazione spaziale e temporale degli eventi di segnalazione CREB associati a specifiche isoforme Cav1.2, e la sua competizione con altri meccanismi di segnalazione (ad esempio, dipendenti dal campo), o altre isoforme Cav1.2 presenti, possono fornire nuove idee e aprire nuove frontiere per l’indagine dei ruoli delle singole varianti di giunzione Cav1.2 in cellule e tessuti
Abbreviations
| ADSI: | Annual determinant of slow inactivation |
| CaM: | Calmodulin |
| CBD: | Calmodulin-binding domain |
| CDI: | Ca-dependent inactivation |
| ECFP: | Enhanced cyan fluorescent protein |
| EYFP: | Enhanced yellow fluorescent protein |
| FALI: | Fluorophore-assisted light inactivation |
| FI: | Fast inactivation |
| FRET: | Fluorescent resonance energy transfer |
| GFP: | Green fluorescent protein |
| SI: | Slow voltage-dependent inactivation. |
