II Effetto dell’ipertermia da solo in Vitro
Nel 1967, Harris utilizzò un test di clonazione unicellulare per ottenere curve di sopravvivenza al calore delle cellule renali di maiale pseudodiploidi. Le curve erano composte da una spalla iniziale seguita da un declino esponenziale della frazione superstite ed erano quindi simili alle curve ottenute dall’uccisione di radiazioni di cellule in coltura (Puck e Marcus, 1955). Anche Westra e Dewey (1971) e Palzer e Heidelberger (1973a) hanno dimostrato questo fenomeno. Ciò non implica tuttavia la somiglianza del meccanismo letale delle due modalità.
Un diagramma di Arrhenius del reciproco del tasso di inattivazione espresso in funzione del reciproco della temperatura assoluta sia per le cellule ovariche di criceto cinese (CHO) che per le cellule renali di maiale ha rivelato un’energia di attivazione di 141 kcal / mole per entrambi i tipi nell’intervallo di temperatura da 43,5° a 46,5°C (Westra e Dewey, 1971). L’entità dell’energia di attivazione è simile a quella riportata per diversi enzimi e proteine (Johnson et al., 1954), ed è significativamente maggiore dell’energia di attivazione riportata per il DNA (Eigner et al., 1961; Greer e Zambehof, 1962) suggerendo che la denaturazione proteica potrebbe essere la lesione letale del calore. Tuttavia, l’entropia di attivazione per le due linee cellulari era diversa.
La conoscenza e la comprensione attuali del / dei target / i e dei meccanismi / i di abbattimento del calore sono limitate. Mentre sono state descritte una serie di alterazioni indotte dal calore della struttura cellulare e del metabolismo, nessuna di esse è stata collegata esclusivamente alla morte cellulare. Non è stato trovato alcun mezzo per riscaldare selettivamente gli organelli subcellulari per ottenere informazioni sull’obiettivo o sugli obiettivi critici del calore. Tuttavia, sono state suggerite diverse possibilità.
Un certo numero di ricercatori ha scoperto che lo shock termico riduce la capacità delle cellule di incorporare la timidina nel DNA (Mondovi et al., 1970; Reeves, 1971; Plagemann ed Erbe, 1972). Questa inibizione dell’incorporazione della timidina potrebbe essere dovuta a danni al meccanismo di trasporto della timidina, che si pensa controlli l’incorporazione del DNA (Plagemann ed Erbe, 1972). Tuttavia, è stato dimostrato che il pool di precursori etichettato non diminuiva sufficientemente per spiegare la grande diminuzione dell’incorporazione della timidina nelle cellule renali di maiale (Plagemann ed Erbe, 1972).
Dewey et al. (1971) ha scoperto che il calore ha indotto aberrazioni cromosomiche nelle cellule CHO sincrone. La frequenza di aberrazione era troppo bassa per spiegare la letalità cellulare nelle cellule M e G1 (meno di un’aberrazione per cellula quando la sopravvivenza era ridotta al 37%), ma poteva spiegare l’uccisione cellulare delle cellule della fase S. Inoltre, il calore e l’analogo della timidina bromodeossiuridina (BUdR), quando agiscono insieme, hanno ucciso le cellule in modo additivo, suggerendo che le stesse strutture sono state danneggiate da entrambi gli agenti. È stato quindi ipotizzato che il calore e il BUdR producano entrambe lesioni espresse come danni nel DNA, ma che il calore produca danni nelle proteine cromosomiche, possibilmente riparando gli enzimi e che BUdR produca danni nel DNA. Quindi, il danno nella proteina cromosomica potrebbe interagire con il danno BUdR nel DNA o potrebbe provocare un’inibizione nella riparazione del danno al DNA. Questa ipotesi è supportata dalla somiglianza tra le energie di attivazione per l’uccisione di calore (141 kcal/mole) e l’inattivazione delle proteine (Westra e Dewey, 1971). Il danno al DNA mediato dalla proteina che si è verificato durante G1 apparentemente non si è manifestato come aberrazioni cromosomiche, probabilmente a causa dell’associazione più stabilizzata tra questi componenti della cromatina durante G1. Si pensava che il meccanismo di uccisione delle cellule mitotiche fosse la distruzione del fuso, che causava l’alta frequenza di cellule tetraploidi osservate in questi esperimenti.
La sensibilità al calore varia considerevolmente tra le linee cellulari. Le cellule prostatiche di topo non sono state uccise fino a 5 ore a 43°C, mentre la sopravvivenza delle cellule prostatiche trasformate da idrocarburi era 0,37 dopo 2 1/2 ore di trattamento termico (Chen e Heidelberger, 1969). Il numero di minuti di calore necessari per ridurre la sopravvivenza delle cellule leucemiche L1210 e delle cellule HeLa al 37% sulla porzione esponenziale della curva di sopravvivenza (D0) ha dimostrato di essere 12 min e 30 min a 43°C, rispettivamente (Palzer e Heidelberger, 1973a). Inoltre, il tasso di inattivazione del calore delle cellule CHO (Westra e Dewey, 1971) era dieci volte maggiore del tasso di inattivazione delle cellule renali di maiale (Harris, 1967).
La quantità di ritardo di divisione dopo il riscaldamento (Westra e Dewey, 1971; Palzer e Heidelberger, 1973b) è stata trovata molto più lunga del ritardo prodotto da una dose di radiazioni che riduce la sopravvivenza di una quantità simile (Westra e Dewey, 1971). Ciò suggerisce che le lesioni responsabili del ritardo della divisione o le lesioni responsabili della letalità sono diverse per le due modalità.
Determinando la riduzione della sopravvivenza causata da una dose costante di calore su cellule sincronizzate, è stato dimostrato per le cellule CHO (Dewey et al., 1971; Westra e Dewey, 1971), lievito (Schenberg-Frascino e Moustracchi, 1972), cellule HeLa (Palzer e Heidelberger, 1973b) e cellule meristematiche (de la Torre et al., 1971) che le cellule di fase S (de la Torre et al., 1971; Dewey et al., 1971; Westra e Dewey, 1971; Schenberg-Frascino e Moustacchi, 1972; Palzer e Heidelberger, 1973b) e le cellule in fase M (Westra e Dewey, 1971) erano le più sensibili rispetto alle cellule in altre fasi del ciclo cellulare. Questa scoperta è in diretto contrasto con gli studi di irradiazione, dove entrambi in vitro (Sinclair, 1968; Dewey et al., 1970) e in vivo (Gillette et al., 1970; Dawson et al., 1973), la fase S è la fase più radioresistente. A causa della specificità del ciclo cellulare della letalità del calore, è stata suggerita l’induzione di una sincronia parziale a seguito di ripetuti trattamenti termici (de la Torre et al., 1971) e osservato (Martin e Scloerb, 1964).
Diversi ricercatori hanno riferito che le cellule neoplastiche sono più sensibili al calore rispetto alle cellule normali (Mondovi et al., 1969; Levine e Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle e Dickson, 1971). Ciò può derivare da carenze nutrizionali o da altri fattori che possono rendere il tessuto maligno più sensibile al calore. Tuttavia, esistono eccezioni (Chen e Heidelberger, 1969; Kachani e Sabin, 1969) e nella maggior parte dei casi la morfologia o il metabolismo alterati sono stati equiparati all’uccisione cellulare. Pertanto, nei dati che suggeriscono una sensibilità selettiva al calore delle cellule tumorali (Mondovi et al., 1969, 1970; Levine e Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle e Dickson, 1971; Overgaard e Overgaard, 1972a; Kim et al., 1974), non è stato dimostrato che per il criterio della morte riproduttiva, le cellule tumorali sono più sensibili al calore rispetto alle cellule normali da cui è sorto il tumore.
L’applicazione frazionata del calore è stata studiata solo brevemente. Palzer e Heidelberger (1973a) hanno esaminato il recupero di cellule HeLa asincrone tra dosi divise di calore. I loro dati indicano che le cellule erano in grado di riparare i danni da calore subletale in 6 ore. Inoltre, la fluttuazione nella frazione superstite ha suggerito una sincronizzazione parziale della popolazione asincrona come risultato della prima dose. C’è stata una diminuzione della sopravvivenza dopo un aumento iniziale dovuto alla riparazione del danno da calore subletale. La sopravvivenza diminuita è stata interpretata come il risultato della ridistribuzione delle cellule in una fase più sensibile del ciclo cellulare a causa della sincronizzazione parziale indotta dalla prima dose dell’agente letale.
Gerweck et al. (1974) ha studiato la capacità del calore di uccidere le cellule ipossiche in vitro. L’ipossia è stata prodotta nelle cellule CHO mediante una tecnica di gassificazione rapida. Le curve di sopravvivenza alle radiazioni per le cellule CHO aerobiche e ipossiche hanno rivelato un rapporto di aumento dell’ossigeno (OER) di 2,5, indicando che è stata raggiunta l’ipossia radiobiologica. Il riscaldamento era per immersione in acqua a 45,5°C per intervalli di tempo variabili. Sono state quindi costruite curve di sopravvivenza al calore delle cellule aerobiche e ipossiche che hanno rivelato che le cellule ipossiche erano almeno sensibili al calore e forse leggermente più sensibili al calore delle cellule aerobiche. Il D0 per le cellule ipossiche era di 1,2 min e per le cellule aerobiche di 1,8 min.
Schulman e Hall (1974) hanno scoperto che le cellule di criceto cinese ipossico V79 erano più sensibili al calore rispetto alle cellule aerobiche V79. Quarantatre gradi Celsius erano necessari per produrre danni nelle cellule aerobiche, mentre 41°C producevano danni nelle cellule ipossiche.
In sintesi, l’uccisione di calore delle cellule di mammifero in coltura ha le seguenti caratteristiche: ad una data temperatura, un diagramma del logaritmo della frazione superstite in funzione del tempo di trattamento è tipicamente esponenziale preceduto da una spalla iniziale, indicando che le cellule hanno la capacità di accumulare danni da calore subletale e quindi vengono uccise esponenzialmente con l’aumentare del tempo di trattamento. Studi a dose frazionata indicano che le cellule hanno anche la capacità di riparare questo danno da calore subletale. Notevole variazione nella sensibilità al calore esiste tra le varie linee cellulari. Esiste una sensibilità all’età cellulare con le cellule S-fase e M-fase più sensibili al calore. L’obiettivo danneggiato dal calore è sconosciuto, ma un’interazione proteina—DNA è almeno una possibilità plausibile. Le cellule ipossiche sembrano essere più sensibili al calore rispetto alle cellule ossigenate.
