Circolanti cellsEdit
Le tecniche necessarie per ottenere cellule isolate variare a seconda del tipo di cellula richiesto. Le cellule circolanti come le cellule del sangue o alcune cellule tumorali possono essere isolate prelevando un campione di sangue. Poiché i campioni di sangue contengono una miscela di diversi tipi di cellule, è necessario utilizzare un metodo per separare le cellule in diversi tipi. Il metodo più comunemente usato per questo è la citometria a flusso, durante la quale un analizzatore automatico ispeziona uno stretto flusso di cellule. In una versione di questa tecnica, una luce viene brillata sul flusso di cellule, e l’analizzatore rileva la luce riflessa o fluorescenza prima di utilizzare queste informazioni per manovrare rapidamente le cellule di interesse in una camera di raccolta.
Tessuti solidimodifica
Quando si tratta di tessuti solidi, ottenere tessuto per l’isolamento cellulare può essere più difficile. Il tessuto umano in eccesso può talvolta essere ottenuto al momento dell’intervento chirurgico pianificato, ad esempio campioni di appendice atriale destra vengono spesso asportati e scartati durante la chirurgia a cuore aperto come la chirurgia di bypass coronarico. Altri tessuti come campioni di pancreas o vescica possono essere prelevati come biopsia. In alternativa, il tessuto degli animali viene spesso ottenuto sacrificando l’animale.
Dopo aver ottenuto un campione di tessuto, deve essere circondato o perfuso da una soluzione ad una temperatura appropriata contenente i sali e i nutrienti necessari per mantenere in vita le cellule. Questo può essere eseguito semplicemente sommergendo il tessuto nella soluzione, o può comportare disposizioni più complesse come la perfusione di Langendorff. Le soluzioni comunemente utilizzate includevano modifiche della soluzione di Tyrode o della soluzione di Krebs e Henseleit Queste soluzioni contengono precise concentrazioni di elettroliti tra cui sodio, potassio, calcio, magnesio, fosfato, cloruro e glucosio. Le concentrazioni di questi elettroliti devono essere attentamente bilanciate, prestando attenzione alla pressione osmotica. L’acidità della soluzione deve essere regolata, spesso utilizzando un tampone di pH come l’HEPES. L’isolamento delle cellule da alcuni tessuti può essere migliorato ossigenando la soluzione. Nelle fasi iniziali, perforare il tessuto con una soluzione che non contiene calcio è utile in particolare quando si isolano i miociti cardiaci, poiché l’assenza di calcio causa la separazione dei dischi intercalati.
Gli enzimi proteolitici possono quindi essere aggiunti alla soluzione. Gli enzimi che digeriscono il collagene (collagenasi) vengono spesso utilizzati quando si isolano le cellule dal cuore o dalla vescica. Possono essere utilizzati anche enzimi generici che digeriscono molti tipi di proteine (proteasi). Quando si isolano le cellule dal tessuto cerebrale, possono essere necessari altri enzimi che abbattono il DNA (DNAASI).
Questi enzimi, oltre a digerire la matrice extracellulare, possono anche digerire altre importanti proteine essenziali per il funzionamento delle cellule di interesse. Se le cellule sono esposte a questi enzimi per troppo tempo, i risultati della morte cellulare, ma se non sono esposti agli enzimi abbastanza a lungo, la digestione della matrice extracellulare non sarà completa. Dopo che gli enzimi sono stati rimossi dal tessuto perfusendolo con una seconda soluzione che non contiene enzimi, le cellule possono essere separate meccanicamente o dissociate. Una semplice tecnica per dissociare le cellule comporta il taglio del tessuto in piccolo pezzo prima di agitare i pezzi in una soluzione utilizzando una pipetta.
