Risultati e Discussione

Nei sistemi dei mammiferi, Cdc42 attività ha dimostrato di essere importante nella regolazione della pelle delle cellule staminali/progenitrici differenziazione in cellule del follicolo pilifero, il controllo neuroepithelial staminali/progenitrici di polarità e cerebrale emisferica biforcazione e la regolazione del numero di cellule e la crescita nel periodo perinatale periodo di sviluppo (6-9). È interessante notare che un esame dell’attività di Cdc42 in topi adulti di varie età rivela che il livello relativo di Cdc42-GTP degli animali più anziani è significativamente superiore a quello di quelli più giovani in diversi tessuti, tra cui cuore, cervello, polmone, fegato, midollo osseo, milza e rene (Fig. 1 A e dati non mostrati), aumentando la possibilità che l’aumento dell’attività Cdc42 sia coinvolto nel normale processo di invecchiamento.

Per determinare se l’aumento dell’attività Cdc42 associata all’invecchiamento naturale possa avere rilevanza fisiologica, abbiamo esaminato il regolatore negativo Cdc42, Cdc42GAP, nei topi mirati al gene dopo aver raggiunto l’età adulta. Studi precedenti sui topi knockout Cdc42GAP omozigoti durante il periodo perinatale hanno indicato che vari tessuti/cellule contenevano un elevato Cdc42-GTP e che gli embrioni/cuccioli appena nati del genotipo Cdc42GAP −/− mostravano dimensioni ridotte dell’organo/organismo correlate ad un aumento dell’apoptosi spontanea in vari tipi di cellule (6). Nei topi adulti Cdc42GAP−/−, l’attività Cdc42 era costitutivamente più alta in più tipi di tessuto / cellule rispetto a quella dei topi WT corrispondenti, mentre il livello di RhoA-GTP o Rac1-GTP rimaneva simile a quello di WT (Fig. 1 B; dati non mostrati), suggerendo una specifica attività di guadagno di Cdc42 negli animali adulti simile a quella durante il periodo perinatale. La maggior parte dei topi Cdc42GAP – / – è morta durante il periodo neonatale a causa delle loro dimensioni ridotte e del loro fisico debole (6). Tuttavia, una percentuale di loro (≈7%) potrebbe sopravvivere al periodo neonatale in affidamento da femmine di nutrimento non correlate. Nonostante l’assunzione regolare di latte e le normali concentrazioni sieriche di glucosio e insulina riscontrate nei topi omozigoti nel periodo postnatale , l’aumento di peso dei topi Cdc42GAP−/− ha iniziato a decelerare a ≈3 mesi di età rispetto a ≈5 mesi di età per WT o topi eterozigoti, e gli omozigoti maturi erano ≈30% ridotti nel peso corporeo a causa di una diminuzione 1 C e dati non mostrati). La durata media della vita dei topi Cdc42GAP −/− era ≈12 mesi, mentre i topi di controllo (WT o eterozigoti) sono rimasti vitali fino a un’età mediana di ≈27 mesi (Fig. 1 D). La curva di sopravvivenza dei topi omozigoti è leggermente diversa dalla tipica curva di Gompertz, ma è simile a quelle riportate per BubR1 (un regolatore di checkpoint mitotico) knockout (10) o p44 (una breve isoforma del soppressore tumorale p53) transgenici (11) animali. Cifosi e mancanza di vigore nei topi Cdc42GAP−/− sono diventati evidenti all’età di ≈12 mesi (Fig. 1 E). I topi Cdc42GAP−/− scuoiati a 15 mesi di età hanno mostrato una chiara riduzione della massa corporea, una sostanziale perdita di tessuto adiposo subdermico, grave lordokyphosis e atrofia muscolare (dati non mostrati). Una scansione a raggi X ha mostrato un fenotipo di cifosi significativo e una ridotta densità minerale ossea (BMD) nei topi Cdc42GAP−/− all’età di 15 mesi (Fig. 1 F). Un’ulteriore quantificazione delle ossa sezionate dei topi Cdc42GAP−/− ha rivelato riduzioni di 3 e 2,6 volte della BMD nella tibia e nel femore, rispettivamente (SI Fig. 7). Inoltre, i topi Cdc42GAP−/− maschi e femmine hanno perso fertilità in età precoce rispetto a quella del peso corporeo. Nell’accoppiamento tra Cdc42GAP – / – femmine e maschi WT, gli omozigoti sono diventati sterili a 26 settimane di età rispetto a 48 settimane di età per WT (Fig. 1 G). Queste osservazioni indicano che la carenza di Cdc42GAP provoca il livello Cdc42-GTP costitutivamente elevato, dimensioni corporee ridotte, cifosi precoce, BMD ridotta, periodo di fertilità ridotto e durata della vita ridotta nei topi adulti.

Le sezioni H & E macchiate attraverso il corpo vertebrale del topo femmina di 8 mesi hanno mostrato che i topi Cdc42GAP −/− avevano una corteccia più sottile, piegata e trabecole più sottili rispetto ai topi WT (Fig. 2 Bis). Allo stesso modo, le sezioni di longitudine del femore dei topi omozigoti hanno mostrato una riduzione dello spessore osseo corticale rispetto a quello dei topi WT (dati non mostrati). Queste osservazioni sono in accordo con l’aspetto grossolano e le caratteristiche cliniche dell’osteoporosi. La milza, il fegato e i reni di adulti Cdc42GAP−/− topi sono stati ridotti in massa a causa di una diminuzione complessiva cellularità, che era evidente in H&E tinto sezioni della milza, e le cellule T e B contenenti polpa bianca regioni di 12 mesi Cdc42GAP−/− milza sono stati notevolmente ridotti rispetto a quelli di age-matched topi WT (Fig. 2 B e dati non mostrati), suggerendo atrofia linfoide pronunciata negli omozigoti. Coerentemente con l’apparente riduzione del tessuto adiposo subdermico, l’analisi istologica delle sezioni trasversali della pelle dorsale ha rivelato una quasi completa assenza di cellule adipose s.c. in topi Cdc42GAP- / − di 9 mesi (Fig. 2 C). Una perdita di massa muscolare e atrofia muscolare sono stati confermati anche dall’esame di H&E-macchiato sezioni muscolari scheletriche da 12 mesi Cdc42GAP-/-topi e l’età-abbinato WT topi (Fig. 2 C). I topi Cdc42GAP−/− hanno anche mostrato una marcata riduzione della rigenerazione dei capelli dopo la rimozione dei peli dorsali mediante rasatura, mentre l’età e il peso corrispondente al sesso mostravano una ricrescita dei capelli robusta(Fig. 8). La capacità di tollerare stress, come la guarigione delle ferite, un’attività associata all’invecchiamento (12) dei topi Cdc42GAP−/−, è stata significativamente ridotta rispetto a quella di WT (Fig. 2 D). L’analisi istopatologica delle sezioni della ferita ha mostrato poca reepitelizzazione nel bordo della ferita dei topi Cdc42GAP−/−, mentre la completa reepitelizzazione dei topi WT era evidente 4 giorni dopo l’introduzione della ferita (Fig. 2 E). Oltre a queste osservazioni, un certo numero di fenotipi ematopoietici dei topi omozigoti, tra cui anemia, ridotta cellularità della milza e del midollo osseo, difetti dell’attecchimento delle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo e maggiore sensibilità delle cellule staminali ematopoietiche alla mobilizzazione indotta (13, 14) erano coerenti con l’invecchiamento precoce nel sistema ematopoietico. È importante sottolineare che un esame di giovani topi omozigoti (< 4 mesi) prima della manifestazione di fenotipi evidenti non ha rivelato anomalie importanti nell’osso, nella pelle e nella milza (SI Fig. 9 A e B e dati non mostrati), suggerendo che i fenotipi simili all’invecchiamento dei topi Cdc42GAP-/− non sono dovuti a un disturbo dello sviluppo precoce. Inoltre, un certo numero di fenotipi dei topi omozigoti, tra cui ridotto spessore osseo corticale, cifosi e perdita di massa muscolare e tessuti epidermici, potrebbe essere trovato nei topi WT vecchi (>2,5 anni) (SI Fig. 9 C e D e dati non mostrati). Come riassunto nella tabella SI 1, collettivamente questi risultati forniscono una forte evidenza che la carenza di Cdc42GAP causa fenotipi simili all’invecchiamento precoce negli animali.

La colorazione dei tessuti degli adulti di 9 mesi, inclusi fegato, reni e milza, per la β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal) ha rivelato una forte attività di questo marcatore di senescenza nei topi omozigoti che non era rilevabile nei tessuti dei topi WT con età e sesso (Fig. 3 A e SI Fig. 10), indicando che i tessuti adulti Cdc42GAP – / – possono subire una senescenza prematura. È interessante notare che l’aumento dell’apoptosi dei tessuti omozigoti osservati durante il periodo perinatale era assente negli omozigoti adulti quando l’elevata attività SA-β-gal era evidente (rif. 6 e dati non mostrati). Cdc42GAP – / – cellule di fibroblasti embrionali di topo (MEF), che contengono ≈3 volte più alto Cdc42-GTP ma normali contenuti di Rac1-GTP o RhoA-GTP rispetto alle cellule WT MEF (6), hanno mostrato un aumento significativo dell’attività SA-β-gal e hanno accumulato una morfologia senescente appiattita e allargata a partire dal passaggio 6 quando le cellule WT MEF erano negative per l’attività SA-β-gal 3 B e SI Fig. 11). Le cellule Cdc42GAP – / – MEF hanno iniziato a rallentare la crescita nei passaggi 5-7 quando le cellule MEF WT corrispondenti crescevano esponenzialmente (Fig. 3 C) (6), e subirono una massiccia senescenza replicativa dopo il passaggio 7, mentre la maggior parte delle cellule WT MEF non raggiunse la senescenza fino al passaggio 13 (SI Fig. 11 e dati non mostrati). Inoltre, una percentuale significativamente più alta di cellule Cdc42GAP – / – MEF al passaggio 7 formava focolai più grandi nel nucleo rispetto alle cellule WT (SI Fig. 12). Questi risultati indicano che la carenza di Cdc42GAP induce la senescenza precoce dei tessuti / cellule.

Un fattore ben riconosciuto che contribuisce all’invecchiamento precoce dei mammiferi e alla senescenza cellulare è l’aumentata instabilità genomica (15). L’analisi di diffusione della metafase ha mostrato che>Gli splenociti primari del 30% di topi omozigoti di 8 mesi erano aneuploidi, mentre gli splenociti WT abbinati all’età e al sesso non avevano aneuploidia rilevabile (Fig. 3 D), indicando che il tessuto Cdc42GAP – / – ha subito instabilità genomica. A sostegno di questa scoperta, le cellule Cdc42GAP−/− MEF hanno mostrato un aumento significativo delle cellule a doppio nucleo sotto colorazione DAPI rispetto alle cellule WT al passaggio 7 (SI Fig. 12). L’analisi del cariotipo dei passaggi successivi delle cellule MEF (passaggio 6-7) ha inoltre rivelato che, sebbene la maggior parte dei cromosomi delle cellule WT (≈80%) rimanesse intatta, il 42% delle cellule Cdc42GAP−/− conteneva almeno un’aberrazione cromosomica, il 20% conteneva due o più aberrazioni e il 14% conteneva tre o più aberrazioni (Fig. 3 E). Anche la percentuale e il grado di aneuploidia aumentavano significativamente nelle cellule Cdc42GAP−/− MEF, con > il 32% delle cellule che mostravano numeri cromosomici anormali compresi tra 72 e 102, mentre la maggior parte delle cellule WT erano diploidi (Fig. 3 E e SI Fig. 13). L’analisi del cariotipo dei danni cromosomici indica che le aberrazioni delle cellule MEF omozigoti erano diverse, tra cui rottura cromatidica, separazione prematura dei cromatidi fratelli (un segno distintivo di un checkpoint di assemblaggio del mandrino difettoso), traslocazione, rotture cromosomiche, cromosoma dicentrico e frammentazione cromosomica (Fig. 3 F e SI Tabella 2), suggerendo che il macchinario per la riparazione dei danni al DNA è compromesso nelle cellule Cdc42GAP -/ -. La colorazione immunofluorescente di phospho – H2 AX nel nucleo cellulare, un marker di risposta al danno del DNA (16), mostra che, sebbene il 10% delle cellule di passage 7 Cdc42GAP−/− MEF fosse positivo per il marker del danno al DNA, <l ‘ 1% delle cellule WT fosse positivo (Fig. 3 G). La correlazione tra l’insorgenza e la progressione dei fenotipi simili all’invecchiamento dei topi Cdc42GAP-/− e il grado e la gravità osservati delle aberrazioni genomiche nelle cellule Cdc42GAP− / − supporta un ruolo di Cdc42 nello sviluppo delle caratteristiche progeroidi.

Per determinare il possibile meccanismo dei danni al DNA accumulati nelle cellule Cdc42GAP−/−, abbiamo confrontato il livello endogeno delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) delle cellule omozigoti con quello delle cellule WT, poiché Rac1 e Rac2, due Rho GTPASI strettamente correlate, sono noti regolatori del ROS cellulare (17). SI Fig. 14 mostra che le cellule Cdc42GAP – / – hanno mostrato un’attività ROS simile a quella delle cellule WT, indicando che Cdc42GAP regola la stabilità genomica attraverso un meccanismo endogeno ROS-indipendente. A causa delle somiglianze di più fenotipi di topo Cdc42GAP−/− a quelli di un certo numero di modelli di topo mirati al gene di molecole di riparazione del danno al DNA, inclusi i modelli di topo Brca1−/−p53+/−, Ku80−/− e Mtr−/−Wrn (12, 18, 19), abbiamo ulteriormente sondato la reattività delle cellule Cdc42GAP−/− passate precocemente a vari agenti di danno al DNA. Nel test di crescita della risposta al danno del DNA, le cellule carenti di Cdc42GAP hanno mostrato un ampio difetto dell’attività di riparazione del danno al DNA (Fig. 4), che si è manifestata come percentuali significativamente più elevate di morte cellulare tra le cellule omozigoti rispetto alle cellule WT dopo il trattamento aumentando le dosi di H 2O2, irradiazione ionizzante, camptotecina, metil-metano solfonato o mitomicina C. Pertanto, le diverse anomalie genomiche accumulate riscontrate nei passaggi successivi delle cellule Cdc42GAP – / – possono essere attribuibili, almeno in parte,alle attività di riparazione dei danni al DNA.

Una conseguenza del danno genomico sostenuto nelle cellule è l’induzione di più geni DNA-danno-risposta e / o senescenza (20, 21). Le espressioni di p53, p21Cip1, p16Ink4a e phospho-p53 (Ser-15) nelle cellule Cdc42GAP−/− MEF erano significativamente più alte di quelle delle cellule WT MEF dopo passaggi simili, mentre p19ARF nelle cellule omozigoti mostrava una tendenza di aumento simile con passaggi, come le cellule WT (Fig. 5 Bis). I livelli proteici di p53, p21Cip1, p16Ink4a, phospho-p53 (Ser-15) e il marcatore del danno al DNA phospho-H2 AX nei tessuti Cdc42GAP−/− di topi di 8 mesi erano anche significativamente più alti di quelli nei tessuti corrispondenti di topi WT abbinati (Fig. 5 B). Questi risultati forniscono la prova che l’attivazione della via regolata da p53, p21Cip1 e p16Ink4a in particolare, è associata a senescenza precoce indotta da carenza di Cdc42GAP. Per esaminare la questione se l’elevata attività di Cdc42 nelle cellule Cdc42GAP-carenti sia sufficiente a spiegare il fenotipo di senescenza precoce, abbiamo espresso un mutante attivante di Cdc42, Cdc42F28L, nelle cellule primarie WT MEF e analizzato per l’attività SA-β-gal delle cellule rispetto a quella di corrispondenza delle cellule che esprimono EGFP in diversi passaggi. L’espressione di Cdc42F28L ha causato un aumento significativo della popolazione cellulare positiva SA-β-gal (35% nelle cellule Cdc42F28L rispetto al 7% nelle cellule che esprimono EGFP)nelle cellule MEF passate precocemente (Fig. 5 C), indicando che l’attivazione del Cdc42 è sufficiente per l’induzione della senescenza cellulare precoce.

Per esplorare ulteriormente la possibilità che il fenotipo di senescenza delle cellule Cdc42GAP−/− possa essere salvato da un difetto p53, abbiamo generato topi Cdc42GAP+ / −p53+ / − e abbiamo tentato di preparare le cellule MEF dal crossbred. Di 44 embrioni, sei con il genotipo Cdc42GAP−/−p53+/− e nessuno del genotipo Cdc42GAP−/− p53 – / – sono stati ottenuti. Le cellule Cdc42GAP – / – p53+/− MEF crescevano ad una velocità compresa tra quella delle cellule p53+/− e WT e mostravano una popolazione senescente basale paragonabile a quella delle cellule p53+ / – o WT al passaggio 7, mentre le cellule p53−/− e Cdc42GAP – / – MEF proliferavano con una curva lineare e una curva di raddoppio della popolazione di piega ed erano resistenti alla senescenza e inclini alla senescenza a passaggi simili, rispettivamente (Fig. 5 D ed E). Questi risultati indicano che la senescenza prematura indotta da attivazione Cdc42 dipende da p53.

La limitata durata della vita di cellule e animali può derivare da senescenza replicativa in risposta a vari stress, tra cui danni al DNA (22), erosione dei telomeri (23), ROS (24) e/o oncogeni attivati in modo inappropriato (25). I topi Cdc42GAP−/− presentano un modello animale di gain-of-Cdc42-activity che imita l’attivazione mitogenica indotta dal segnale Cdc42 (6) e consentono una valutazione dei possibili effetti dell’attivazione Cdc42 sulla fisiologia animale e cellulare. Dimostriamo che la carenza di Cdc42GAP causa l’insorgenza precoce della senescenza nelle cellule e fenotipi simili all’invecchiamento precoce nell’animale. In particolare, il targeting genico Cdc42GAP induce un aumento globale dell’attività Cdc42 e promuove l’instabilità genomica cellulare con ridotta capacità di riparazione del danno al DNA, che a sua volta può attivare p53 e p16 Ink4a, portando alla senescenza precoce (Fig. 5 F). In precedenza, Cdc42 è stato trovato per essere attivato in cellule senescenti per modulare l’aggiustamento morfologico (26). È stato anche proposto di essere coinvolto nel cambiamento morfologico delle cellule regolate da p53, nell’apoptosi e nella proliferazione (27-29) e nell’apoptosi controllata dalla chinasi c-Jun N-terminale (30, 31), eventi che sono stati associati alla senescenza cellulare e all’invecchiamento animale (32, 33). I nostri risultati che l’attivazione di Cdc42 è associata all’invecchiamento naturale e che la carenza di Cdc42GAP causa un difetto di riparazione del danno al DNA per consentire alle cellule di accumulare anomalie genomiche che portano alla senescenza precoce suggeriscono ulteriormente un legame funzionale tra l’attività di Cdc42 e l’invecchiamento dei mammiferi.

L’attivazione della via p53 o l’interruzione dei geni coinvolti nella riparazione del danno al DNA o nella regolazione della stabilità genomica ha dimostrato di indurre l’invecchiamento precoce nei topi (11, 12, 33, 34). Coerentemente con le precedenti osservazioni che Cdc42 potrebbe non essere coinvolto nella regolazione delle attività del superossido cellulare (17), abbiamo scoperto che il danno al DNA accumulato nelle cellule Cdc42GAP−/− non è associato all’attività del ROS perché le cellule omozigoti non mostrano un aumento dell’attività del ROS. La delezione Cdc42GAP provoca una marcata riduzione della capacità di riparazione del danno al DNA in un ampio spettro, comprese le risposte all’agente di reticolazione del DNA e all’induttore di rottura a doppio filamento o a singolo filamento, suggerendo che l’attivazione prolungata di Cdc42 può smorzare la capacità di riparazione del danno al DNA. La diversità del danno genomico trovato nelle cellule Cdc42GAP – / – è anche coerente con un impatto da un difetto globale di riparazione del danno al DNA. Le domande importanti che rimangono da affrontare includono quali determinanti molecolari specifici sono coinvolti nella riparazione del danno al DNA regolata da Cdc42GAP e quali segnali a monte causano un aumento del Cdc42-GTP durante il normale processo di invecchiamento.