Abstract

Background. L’espressione di CD133 umano (prominin-1 umano) nelle cellule tumorali è stata postulata come un marker di staminali ed è considerata come un marker putativo delle cellule staminali tumorali (CSCs). Abbiamo progettato uno studio per descrivere il modello di espressione di CD133 nella pelle normale e nelle neoplasie cutanee epiteliali. Metodo. L’espressione immunoistochimica CD133 di quarantatré tumori eccrini e apocrini è stata confrontata con quella osservata in altri tumori epiteliali della pelle. Inoltre, la citometria a flusso è stata utilizzata per rilevare l’espressione CD133 di quattro neoplasie epiteliali della pelle, incluso un porocarcinoma. Risultato. È stata osservata immunoreattività CD133 all’apicale o alla superficie apicolaterale delle cellule che formano strutture ghiandolari. Le cellule provenienti da aree solide di tumori benigni o maligni non sono state macchiate. Le cellule di coltura derivate da porocarcinoma hanno mostrato un 22% di cellule positive CD133 utilizzando la citometria a flusso, mentre le colture di carcinoma a cellule squamose contenevano meno dello 0,1%. Conclusione. Queste osservazioni indicano che CD133 è un marcatore specifico di differenziazione ghiandolare che potrebbe essere incluso nel pannello diagnostico dei tumori cutanei con possibile differenziazione eccrina o apocrina. Tuttavia, l’uso dell’espressione CD133 come marker di CSCs deve essere interpretato con cautela negli esperimenti di pelle.

1. Introduzione

Negli ultimi anni, è stato riportato un crescente corpo di prove a sostegno della nozione che la capacità di sostenere la formazione e la crescita del tumore risiede esclusivamente in una piccola popolazione di cellule chiamate cellule staminali tumorali (CSCs). La ricerca di marcatori che dimostrano il fenotipo simile alle cellule staminali di queste cellule che iniziano il tumore è un campo di indagine attivo e diversi marcatori di cellule staminali sono stati descritti di recente nei tumori della pelle .

CD133 è l’omologo umano del mouse prominin-1, una glicoproteina di superficie cellulare a cinque domini transmembrana che ha ricevuto notevole attenzione a causa della sua espressione limitata a varie sottopopolazioni di cellule staminali somatiche . Questo antigene di superficie è stato scoperto come bersaglio di un anticorpo monoclonale definito come Mab AC133, un marker espresso da una sottopopolazione di cellule staminali ematopoietiche CD34 positive derivate dal fegato fetale umano e dal midollo osseo . Successivamente CD133 è stato rilevato in diversi tessuti umani normali, tra cui reni, prostata, cervello e pancreas, ed è risultato essere specificamente associato a microvilli e altre sporgenze della membrana plasmatica . Inoltre, questo antigene è stato identificato anche in neoplasie ematologiche e in diverse neoplasie umane solide, tra cui tumori gliali, carcinoma della prostata, carcinoma renale, epatocarcinoma, carcinoma colorettale e melanoma maligno . Lo scopo di molti di questi studi era determinare l’esistenza di CSCS, definito come un piccolo gruppo di cellule tumorali che hanno la capacità di auto-rinnovamento, iniziazione del tumore e mantenimento della crescita del tumore. Gli anticorpi usati abitualmente per la purificazione delle cellule AC133-positive colpiscono epitopi glicosilati scarsamente caratterizzati di specificità incerta. Sebbene l’attività funzionale di CD133 sia ancora controversa e la sua funzione fisiologica non sia ancora determinata , sta diventando chiaro che questa proteina di superficie cellulare è un marker unico sia delle protrusioni della membrana plasmatica che dei microdomini della membrana . È stato suggerito che in questa posizione cellulare CD133 può agire come regolatore della composizione lipidica della membrana o può partecipare ai meccanismi di polarità cellulare e migrazione .

In studi precedenti che riportano la colorazione immunoistochimica CD133 di epiteli ghiandolari umani, come ghiandole salivari, ghiandole lacrimali, dotti pancreatici, ghiandole endocervicali e ghiandole sudoripare, è stato descritto un modello peculiare di espressione CD133 . In questi epiteli, CD133 è stato indicato per essere localizzato alle sporgenze della membrana plasmatica alle aree apicali delle cellule polarizzate. Un simile modello di colorazione citoplasmatica apicale CD133 delle cellule che circondano un lume è stato osservato anche nei carcinomi dell’ovaio, del colon o del pancreas .

La scoperta dell’anticorpo CD133 che macchia le cellule della ghiandola sudoripare ci ha spinto a progettare uno studio che ora riportiamo, al fine di valutare l’espressione di CD133 nei tumori eccrini e apocrini della pelle.

2. Materiali e metodi

2.1. Casi

Una ricerca retrospettiva ha recuperato 43 tumori cutanei eccrini e apocrini precedentemente diagnosticati dai file del Dipartimento di Patologia dell’Ospedale universitario di Albacete. Sono stati ottenuti vetrini, blocchi di paraffina e rapporti istopatologici da tutti i casi. Slides were reviewed and adnexal skin tumors were diagnosed according to the criteria of the World Health Organization (WHO) classification , including eccrine spiradenoma (), nodular hidradenoma (), eccrine hidrocystoma (), poroma (), porocarcinoma (), syringocystadenoma papilliferum (), chondroid syringoma (), syringoma (), cylindroma (), hidradenoma papilliferum (), apocrine hidrocystoma (), microcystic adnexal carcinoma (), and apocrine carcinoma (). In questo studio sono stati inclusi anche casi di carcinoma a cellule basali () e carcinoma a cellule squamose () per confrontare i risultati ottenuti in queste neoplasie con quelli ottenuti nei tumori delle ghiandole sudoripare. Per valutare l’espressione di CD133 nella pelle normale, abbiamo analizzato la pelle da diverse aree ottenute dai margini di sei tumori della pelle resecati chirurgicamente e da tre autopsie.

Per la coltura di cellule tumorali della pelle, sono stati ottenuti sette campioni di tumori della pelle umana che corrispondevano a un porocarcinoma eccrino e sei carcinomi a cellule squamose. Il tessuto fresco di questi casi è stato incluso nel mezzo di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco, integrato con penicillina/streptomicina e fungizone, immediatamente dopo la resezione chirurgica.

2.2. Immunoistochimica

Formalina fissa, paraffina incorporato sezioni di tessuto 4 µm di larghezza sono stati tagliati, deparaffinized in xilene, e reidratati in una serie graduata di etanolo. L’attività endogena della perossidasi è stata bloccata con il 3% di H2O2 per 5 minuti. I vetrini sono stati trattati con recupero di epitopi indotti dal calore e immunostenuti con tre diversi anticorpi monoclonali anti-CD133: Anticorpo monoclonale AC133, anticorpo monoclonale 293C3 e anticorpo monoclonale AC141 (tutti da Miltenyi Biotec, Germania). Gli anticorpi sono stati testati a diverse diluizioni e tempi di incubazione. Il rilevamento del CD133 è stato eseguito utilizzando il sistema EnVision-HRP (Dako, Glostrup, Danimarca) in una piattaforma DakoCytomation Autostainer, secondo le istruzioni del produttore. La diaminobenzidina (DAB substrate system, Dako, Glostrup, Danimarca) è stata utilizzata come cromogeno. Dei tre diversi anticorpi anti-CD133 testati, solo uno, l’anticorpo monoclonale AC133, ha lavorato in paraffina. Gli altri due anticorpi testati non sono riusciti perché le sezioni incubate con questi anticorpi non hanno mostrato alcuna colorazione o perché l’immunotenente osservato quando sono state utilizzate alte concentrazioni di anticorpi è stato considerato aspecifico (colorazione simile è stata osservata nei controlli negativi). L’anticorpo monoclonale AC133 ha dato risultati affidabili sulle sezioni incorporate in paraffina testate. Stabiliamo per questo anticorpo una diluizione 1 : 10 e 40 minuti di incubazione a temperatura ambiente come condizioni di lavoro preferite. Successivamente tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in quelle condizioni.

Sezioni di pelle con ghiandole sudoripare normali sono state utilizzate come controlli positivi. Inoltre, quando presenti nelle sezioni, le normali ghiandole sudoripare della pelle adiacente alle neoplasie sono state utilizzate come controlli positivi interni. I controlli negativi sono stati eseguiti omettendo l’anticorpo anti-CD133 durante l’incubazione primaria dell’anticorpo.

La colorazione immunoistochimica delle aree solide e delle strutture acinari o duttali dei tumori è stata valutata separatamente. La colorazione CD133 è stata graduata utilizzando una scala semiquantitativa. Strutture acinari o duttali sono state valutate come segue: ( – ) nessuna colorazione; (+) colorazione di secretoria materiale nel lume dell’isolato ductules o acini e/o colorazione debole del apicale o luminale confine di pochi ductules o acini; (++) chiara colorazione del apicale o luminale bordo per la maggior parte ductules o acini presenti nel tumore; (+++) colorazione di apicale o luminale bordo di tutti ductules o acini presenti nel tumore. L’espressione di CD133 è stata valutata da due patologi senior (EP e SYNC) in modo cieco senza conoscenza delle informazioni cliniche e patologiche. In caso di valutazioni discrepanti, i vetrini sono stati rivalutati da entrambi i patologi sotto un microscopio multitesta e si è ottenuto un accordo.

2.3. Coltura di cellule tumorali da tumori cutanei

I frammenti tumorali sono stati disaggregati meccanicamente ed enzimaticamente per digestione con collagenasi di tipo IA (2 mg/mL) (Gibco, Invitrogen) in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37°C per 2 ore. Le cellule sono state filtrate attraverso una rete di nylon da 40 µm e sono state ulteriormente dissociate dal passaggio seriale attraverso pipette sierologiche. Il tessuto digerito è stato centrifugato a 1000 ×g per 10 min e il pellet lavato più volte per ottenere una sospensione monocellulare. Le cellule isolate sono state placcate in flaconi di coltura e coltivate a 37°C in mezzi DMEM/F12 contenenti siero bovino fetale al 10% e integrate con penicillina/streptomicina e fungizone.

2.4. Analisi di citometria a flusso

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su sospensioni cellulari preparate al primo passaggio di coltura primaria da tumori. Le cellule sono state staccate utilizzando EDTA allo 0,02% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 15 min a 37°C e lavate con PBS prima della colorazione. Le sospensioni cellulari sono state adattate a cellule / mL e incubate con la diluizione anticorpale raccomandata (1/10) per 20 min al buio (4°C). Campioni senza anticorpo primario sono stati utilizzati come controlli negativi. L’anticorpo utilizzato era anti-CD133 / 1 (AC133)-APC (Miltenyi Biotec). Gli anticorpi non legati sono stati rimossi lavando con PBS e le cellule sono state risospese in un volume adeguato di tampone. L’analisi è stata eseguita su un citometro a flusso LSRII (BD Biosciences). I dati sono stati analizzati utilizzando Summit V5.0.1. 5170 software (Dako).

3. Risultati

3.1. Risultati clinici

La coorte di pazienti era composta da 29 maschi e 23 femmine, di età compresa tra 24 e 90 anni (mediana, 49 anni). Il sito di presentazione era variabile, la maggior parte localizzata sulla regione della testa e del collo. I dati clinici sono riassunti nella Tabella 1. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a biopsia cutanea escissionale.

3.2. Risultati immunoistochimici

Dai tre diversi anticorpi monoclonali testati su sezioni di tessuto fissate alla formalina e incorporate in paraffina e, in conformità con precedenti rapporti, solo l’AC133 ha dato risultati sensibili e affidabili. Il pattern complessivo di colorazione immunoistochimica osservato con questo anticorpo era strettamente correlato all’architettura tissutale. La colorazione era localizzata principalmente sulla superficie apicale delle cellule che formavano strutture duttali o ghiandolari. I risultati immunoistochimici osservati in queste strutture utilizzando l’anticorpo anti-CD133 sono riassunti nella Tabella 1 e sono descritti di seguito. Le aree solide di uno qualsiasi dei tumori annessiali esaminati o dei carcinomi a cellule basali e squamose testati non hanno dimostrato la positività del CD133.

3.2.1. Tessuto normale

L’espressione di CD133 è stata osservata sulla superficie endoluminale o apicale delle cellule degli acini e dei dotti terminali delle normali ghiandole eccrine (Figura 1(a)). I canalicoli intercellulari formati sulla membrana laterale delle cellule eccrine situate nella porzione secretoria delle normali ghiandole sudoripare erano chiaramente colorati (Figura 1(b)), così come la secrezione trovata nel lume dei dotti eccrini. La colorazione delle normali ghiandole apocrine ai dotti terminali è stata osservata al bordo apicale delle cellule, sebbene con una distribuzione irregolare. Nelle aree acinari di queste ghiandole, dove la secrezione di decapitazione apocrina era evidente, CD133 mostrava solo una colorazione debole o negativa.

a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

CD133 in normali ghiandole eccrine macchie il endoluminale superficie delle cellule e la secrezione della ghiandola di sudore (a). Si osservano anche canalicoli intercellulari sulla membrana laterale delle cellule eccrine (b).

3.2.2. Tumori

CD133 non è stato espresso in nessuno dei carcinomi a cellule squamose o basali testati. Utilizzando l’anticorpo AC133 i tumori annessiali analizzati in questo lavoro hanno mostrato il seguente schema di colorazione (riassunto nella tabella 1).

Tumori benigni con differenziazione Eccrina o apocrina. Tutti i casi di spiradenoma eccrine hanno presentato l’immunoreattività CD133 alla membrana apicale delle strutture simili a condotti presenti all’interno dei noduli tumorali. Anche la superficie luminale delle cellule epiteliali che formano le cisti uniloculari di tutti i casi di hidrocystoma eccrino analizzati è stata positiva. Dotti e piccole cisti presenti in tre dei sei casi di poroma eccrine hanno mostrato un’intensa colorazione dello strato cellulare interno dai tubuli proliferati, e questa colorazione si trovava al bordo endoluminale delle cellule. Gli altri tre casi di poroma analizzati hanno mostrato lo stesso pattern di colorazione nella maggior parte dei tubuli, ma con un pattern di colorazione (++) o (+) di positività CD133. Strutture simili a condotti, presenti nei quattro casi di cylindroma, hanno mostrato anche immunoreattività alla membrana apicale delle cellule epiteliali. La colorazione dei quattro siringomi condroidici era prominente, e tutti i ductuli presenti, che formavano strutture ramificate occasionali, mostravano un’intensa positività alla membrana apicale (Figura 2). I dotti dilatati e tortuosi, che conducono negli spazi cistici di tutti i casi di siringocystoadenoma papilliferum, hanno mostrato immunoreattività alla porzione apicale delle cellule epiteliali o alla superficie luminale delle cisti, con un’intensità che variava da (++) a (+++) (Figura 3). I cinque casi diagnosticati come hidradenoma nodulare hanno mostrato strutture isolate simili a condotti che erano positive per CD133 con una colorazione apicale delle cellule che formavano i tubuli (Figura 4) che variava in intensità da (++) a (+++). I due casi di hidradenoma papilliferum hanno mostrato anche l’espressione di CD133 nella porzione apicale delle strutture ghiandolari. Solo due dei sei casi di siringoma testati hanno mostrato una colorazione coerente sulla superficie luminale dei piccoli dotti che formavano i tumori, che erano rivestiti di solito da due strati di cellule epiteliali cubiche. I casi di hidrocystoma apocrino non hanno dimostrato alcuna immunoreattività positiva.

Figura 2

CD133 Positività alla superficie interna dei tubuli ramificati del siringoma condroidico. Non si nota alcuna colorazione delle cellule stromali o delle cellule epiteliali esterne.

Figura 3

Le proiezioni papillari di syringocystadenoma papilliferum rivestite da epitelio colonnare pseudostratificato sono CD133 positive. La positività è molto intensa sulla superficie endoluminale.

Figura 4

Colorazione lineare CD133 delle cellule colonnari che rivestono i tubuli di un caso di hidradenoma. Solo le cellule che si trovano sulla superficie interna dei tubuli sono macchiate.

Tumori maligni con differenziazione eccrina o apocrina. Non è stata dimostrata alcuna immunoreattività alla superficie luminale delle cisti del caso diagnosticate come carcinoma apocrino. I due carcinomi adnexali microcistici analizzati in questo studio hanno mostrato una forte positività CD133 alla superficie apicale delle cellule che formavano la piccola e grande lumina delle strutture tubolari. L’immunocarcinoma CD133 potrebbe essere dimostrato nelle cellule molto atipiche che circondavano le strutture tubolari del caso di porocarcinoma (Figura 5).

(a)

(b)

(a)
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Figure 5

Ductal structures of porocarcinoma seen in H&E sections (a) are CD133 positive (b).

3.3. Caratterizzazione di colture primarie da tumori della pelle umana e analisi di citometria a flusso

Sette campioni derivati da tumori della pelle umana sono stati elaborati con l’obiettivo di ottenere sospensioni monocellulari. A causa di un numero insufficiente di cellule ottenute dai tumori o di contaminazione fungina o batterica, solo quattro campioni sono stati coltivati con successo e analizzati per l’espressione epitopica CD133/1 della superficie cellulare. Queste biopsie coltivate con successo includono un porocarcinoma eccrino e tre carcinomi a cellule squamose. L’esame microscopico delle cellule coltivate ha rivelato diverse morfologie che variavano costantemente al tipo di tumore istologico. Le cellule del carcinoma a cellule squamose hanno mostrato l’aspetto epitelioide o delle cellule del fuso mentre le cellule derivate dal porocarcinoma eccrino avevano una forma più arrotondata e raggruppate in isolotti di cellule piccole e atipiche. La presenza di cellule epiteliali in queste colture è stata confermata attraverso l’espressione positiva di E-caderina e EpCam come marcatori epiteliali.

Per determinare se le colture di cellule tumorali della pelle contenessero una popolazione di cellule positive CD133, abbiamo usato la citometria a flusso per esaminare l’espressione del marcatore di superficie CD133/1 con l’anticorpo AC133. Tutti i campioni di carcinoma a cellule squamose contenevano meno dello 0,1% di cellule positive, mentre quasi il 22% di cellule positive è stato rilevato nel porocarcinoma eccrino. La figura 6 mostra istogrammi rappresentativi dei due tipi di tumore cutaneo valutati.

(a)

(b)

(a)
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Figure 6

CD133 expression profiles in human skin primary tumour cells. Analysis of CD133/1 expression in samples from eccrine porocarcinoma (b) and from squamous cell carcinoma (a). Flow cytometry of porocarcinoma derived cell cultures show a 22% of CD133/1 epitope positive cells and CD133 immunostaining. Carcinoma a cellule squamose mostra colorazione negativa per CD133 e 0% positivo CD133 cellule su citometria a flusso.

4. Discussione

I progressi nella biologia delle cellule staminali cutanee e nella comprensione della carcinogenesi dipendono fortemente dalla disponibilità di marcatori specifici per popolazioni di cellule staminali distintive . Marcatori noti di cellule staminali della pelle o di cellule staminali che sono state identificate in altri organi o tumori possono essere utilizzati per il rilevamento di CSCs cutanee. Uno di questi marcatori che possono essere testati nella pelle è la proteina CD133 (prominin-1). I primi dati che riportano l’espressione di CD133 utilizzando l’anticorpo monoclonale AC133, prodotto contro un nuovo antigene della glicoproteina delle cellule staminali, hanno mostrato che CD133 è stato espresso selettivamente su cellule staminali ematopoietiche CD34 e cellule progenitrici derivate dal fegato fetale umano e dal midollo osseo, nonché dal sangue . Da allora, diversi rapporti hanno dimostrato che prominin-1 può essere utilizzato per identificare e isolare le cellule staminali umane da varie fonti, tra cui il sistema ematopoietico , la prostata , il pancreas o il rene . Inoltre, anticorpi monoclonali contro CD133 sono stati utilizzati per l’identificazione e l’isolamento di una popolazione putativa di cellule iniziatrici del tumore o CSCs in un certo numero di carcinomi umani e nel melanoma maligno . Nel glioma, l’aumento del numero di cellule tumorali positive CD133, così come la presenza di cluster di queste cellule, è stato proposto come un fattore prognostico significativo, indipendente da altri fattori come il grado tumorale . Tuttavia, altri studi, utilizzando diversi e nuovi cloni anti-CD133, hanno suggerito che l’espressione di CD133 non è limitata alle cellule staminali e progenitrici e sembra essere espressa in cellule epiteliali adulte di topi e tessuti umani . Ad esempio, utilizzando un clone CD133, chiamato 13A4, derivato da mouse prominin-1, Weigmann et al. dimostrato espressione di prominin-1 sulla superficie apicale delle cellule neuroepiteliali e tubuli prossimali renali adulti, e Karbanová et al. , facendo uso di un anticorpo monoclonale (80B258) generato contro un polipeptide umano prominin-1, immunoreactivity osservato in tessuti umani adulti, particolarmente in epiteli ghiandolari. Questi risultati indicano la necessità di ulteriori studi per chiarire se l’antigene AC133, precedentemente trovato nella citometria a flusso limitato alle cellule progenitrici CD34 positive, sia espresso nelle cellule epiteliali adulte . È stato suggerito che l’espressione variabile CD133 osservata è correlata all’affinità differenziale dei diversi anticorpi a varie forme glicosilate di CD133 . L’anticorpo monoclonale AC133 riconosce un epitopo glicosilato di prominin-1 e, curiosamente, la glicosilazione di questa proteina può cambiare a seconda dello stato di differenziazione cellulare o può essere alterata durante il processo di trasformazione maligna . Nel nostro studio sui tumori della pelle umana, abbiamo osservato che l’espressione di CD133 dipende notevolmente dalla formazione di duttuli delle ghiandole sudoripare e dalla secrezione delle ghiandole sudoripare. L’immunoreattività CD133 è stata osservata principalmente sulla superficie apicale / endoluminale di strutture simili a condotti o cisti della maggior parte dei tumori eccrini benigni e maligni. Nessuno dei tumori studiati, né benigni né maligni, presentava cluster isolati o piccoli di cellule neoplastiche positive CD133 in aree solide. Un simile modello di colorazione CD133 della membrana cellulare apicale delle cellule secretorie è stato precedentemente riportato in normali strutture tubulari come i tubuli prossimali del rene o nelle ghiandole tumorali del cancro del colon-retto . La colorazione CD133 è stata trovata anche sulla superficie apicale / endoluminale delle cellule che formano un lume nei carcinomi ovarici . In questi casi, la posizione apicale di CD133 è stata implicata in una possibile funzione secretoria di questa molecola. La distribuzione morfologica della colorazione CD133 dimostra una correlazione con strutture secretorie ben riconosciute di tessuti e ghiandole normali, suggerendo una relazione funzionale di CD133 con la secrezione. Infatti, nel nostro studio, i tumori sospettati di essere originati nelle aree duttali delle ghiandole sudoripare, come i siringomi, hanno mostrato un pattern di colorazione meno intenso rispetto a quelli originati nelle porzioni acinari.

L’espressione CD133 sulla superficie cellulare delle cellule tumorali differenziate è un argomento contro CD133 come marcatore specifico delle cellule staminali tumorali nella pelle. Tuttavia, l’esistenza di una piccola popolazione CD133+ CSC non può essere completamente esclusa, come è stato dimostrato in altri organi, dove CD133 è espresso sulla superficie cellulare di entrambi, CSCS e cellule tumorali differenziate .

Presi insieme, i nostri risultati dimostrano una specifica espressione immunoistochimica dell’anticorpo AC133 sulla superficie secretoria delle cellule normali e neoplastiche differenziate delle ghiandole eccrine. Gli esperimenti che utilizzano questo anticorpo come marker di CSCs nella pelle devono essere interpretati con cautela. L’anticorpo AC133 è un marcatore sensibile e specifico della differenziazione ghiandolare cutanea, utile per la diagnosi di tumori con possibile differenziazione eccrina o apocrina.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati a Pedro Javier Benito Castellanos e a Laura Abendaño per il supporto tecnico.