Risultati

Caratterizzazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dell’intestino tenue.

Abbiamo applicato procedure standard per isolare le cellule immunitarie situate nell’epitelio (intraepiteliale, CIOÈ) e l’LP dall’intestino. In entrambi i preparati cellulari abbiamo trovato una popolazione distinta di cellule CD11c + B220 + Ly6C + che rappresentavano fino all ‘ 1% di tutte le cellule. In contrasto con pDC, mieloide (m) DC (CD11c + MHCII + CD3-B220-Ly6C – − erano presenti solo a numeri molto bassi nella preparazione IE (Fig. 1 Bis). Sia pDC della preparazione LP che IE hanno mostrato bassi livelli di espressione MHC di superficie di classe II (Fig. 1 Bis). Ulteriori analisi hanno rivelato che le cellule CD11c+B220+Ly6C + di entrambi i preparati esprimono uniformemente i marcatori pDC PDCA1 e 120G8 (Fig. 1 B). Cytospins da PDC ordinato (CD11c + B220 + Ly6C+) e DC mieloide (mDC) della preparazione di IE hanno rivelato una morfologia rotonda e liscia, plasmacellulare di pDC, mentre mDC ha mostrato i dendriti caratteristici (Fig. 1 C). Per caratterizzare ulteriormente la localizzazione del pDC all’interno dell’intestino abbiamo applicato anti-B220, anti-120G8 e anti-CD3 mAb in immunoistologia. Micrografie sono stati presi in modo casuale da sezioni e, come illustrato in Fig. 1 D, il posizionamento delle cellule 120G8+B220 + CD3 è stato determinato rispetto alle cellule epiteliali utilizzando l’analisi delle immagini (Analisi; Olympus, Amburgo, Germania). Valutando il posizionamento di ≈150 pDC abbiamo osservato che il 4,9% di queste cellule si trovava chiaramente all’interno dello strato cellulare epiteliale mentre un altro 6,7% si trovava a una distanza di 5-10 µm dalla punta apicale delle cellule epiteliali (Fig. 1 D). Questi dati dimostrano che una certa quantità di pDC si trova all’interno o vicino all’epitelio intestinale, mentre > l ‘80% delle cellule analizzate sono state posizionate a distanze > 15 µm, che le rende come cellule LP (Fig. 1 D). Poiché numeri simili di pDC erano presenti nella preparazione di IE e LP in seguito a procedure di isolamento standard, non è attualmente chiaro se la pDC della LP contamini la preparazione di IE o se la pDC localizzata nell’epitelio sia isolata in modo più efficiente. Poiché difficilmente troviamo mDC all’interno della preparazione IE, favoriamo quest’ultima possibilità. Tuttavia resta da determinare se entrambe le popolazioni hanno funzioni diverse o appartengono a una popolazione cellulare comune. Poiché la pDC della preparazione IE, in contrasto con la pDC della preparazione LP, può essere isolata con procedure piuttosto delicate, in questo studio sono stati utilizzati esclusivamente pDC della preparazione IE per saggi funzionali.

Espressione CCR9 su PDC intestinale.

Per identificare i meccanismi molecolari che consentono la migrazione del pDC verso l’intestino, abbiamo analizzato l’espressione delle molecole di homing. Sebbene sia ben stabilito che l’integrina AE (CD103) media l’adesione dei linfociti alle cellule epiteliali nell’intestino, non siamo riusciti a identificare l’espressione di questa integrina sulla pDC intestinale. Allo stesso modo, CCR7 (Fig. 1 E), essenzialmente coinvolto nell’homing dei linfociti negli organi linfoidi periferici non è espresso dalla pDC dell’intestino. Al contrario, abbiamo osservato alti livelli di CD18 (β2-integrina) e livelli intermedi di α4β7 mentre ≈50% di pDC esprimono ligandi P-selectina (Fig. 1 E). Di interesse, la stragrande maggioranza della pDC intestinale ha espresso elevate quantità del recettore della chemochina CCR9 (Fig. 1 E), mentre mDC del LP espresso no, o bassi livelli di CCR9 .

CCR9 Espressione di pDC isolata da diversi organi linfoidi.

Considerando l’espressione uniforme di CCR9 sulla pDC intestinale, abbiamo analizzato l’espressione di CCR9 sulla pDC isolata da organi linfoidi secondari tra cui milza, LN drenante della pelle, LN mesenterico e patch di Peyer (PP; Fig. 2 A) e usato CD4+ CD8 + timociti, noti per esprimere alti livelli di CCR9, come controllo positivo (11); Fig. 2 B). È interessante notare che solo una frazione di pDC presente in uno qualsiasi di questi organi espresso CCR9 (Fig. 2 A), mentre ≈95% di pDC isolato dal BM trasportava questo recettore (Fig. 2 C). La maggior parte dei pDC BM esprime anche CCR5 e CXCR3 mentre CCR2 è presente solo su circa il 25% delle celle. CXCR4, noto per trattenere le cellule al BM, è solo molto debolmente espresso (Fig. 2 C). Insieme, questi dati dimostrano che i pDC sono dotati di vari recettori chemochine prima di essere rilasciati dal BM. Questa caratteristica consente presumibilmente di ospitare non solo i luoghi di infiammazione ma anche l’intestino non infiammato.

Analisi di chemiotassi di Flt3L-PDC espanso.

Sulla base della forte espressione di CCR9 su BM e PDC intestinale, abbiamo confrontato la capacità di migrazione di pDC e mDC verso la chemochina CCL25 / TECK, che è l’unico ligando noto per questo recettore (12). La frequenza di pDC varia tra diversi ceppi di topi ed è ben noto che, ad esempio, i topi C57BL/6 (B6) ospitano molto meno pDC rispetto ai topi 129SV (13). Tuttavia, indipendentemente dal background genetico, il numero di pDC che può essere isolato dai tessuti murini è insufficiente per condurre test standard di chemiotassi in vitro. Per superare questa limitazione abbiamo ampliato la popolazione DC in vivo impiantando una linea cellulare tumorale Flt3-L-secernente (B16-FL) in topi B6 per 14 giorni (14).

Durante questo periodo di tempo, la percentuale di cellule CD11c+ presenti nella milza è aumentata dal 3% al 30-35% (dati non mostrati). L’ottanta per cento del pDC espanso in vivo ha espresso CCR9, con livelli molto simili a quelli presenti su BM pDC (Fig. 2 C e Fig. 4 C) considerando che in vivo mDC espanso ha espresso solo piccole quantità di questo recettore (SI Fig. 6 TER). Milza pDC sono stati arricchiti da CD11C + MACS-ordinamento, con conseguente 95% di purezza per CD11c+ cellule che contenevano ≈15% Ly6C+B220+ pDC. I test di migrazione transwell in vitro hanno rivelato una forte risposta chemiotattica della pDC a CCL25, così come a CXCL9, un ligando per CXCR3 e a CXCL12, che è un ligando per CXCR4. Solo una risposta debole è stata osservata verso CCL19, che funge da ligando per CCR7. mDC ha mostrato poca risposta chemiotattica verso CCL25 e CXCL9 e moderata risposta verso CXCL12 e CCL19 (Fig. 3 Bis).

Ridotto numero di pDC nell’intestino tenue di topi CCR9-carenti.

Sulla base di queste osservazioni, abbiamo caratterizzato la distribuzione di pDC in topi CCR9-carenti. Abbiamo trovato percentuali simili di pDC nel polmone e nel fegato (SI Fig. 7) così come nei linfonodi inguinali e mesenterici mentre il numero di PDC splenico era leggermente aumentato nei topi CCR9−/−. Al contrario, abbiamo osservato una>diminuzione del 90% dell’intestino e una riduzione del 50% della PP pDC (Fig. 3 B).

pDC Migrano preferenzialmente verso l’intestino tenue.

Sulla base dei risultati descritti finora, sembrava probabile che pDC richiedono CCR9 per homing al piccolo intestino. Per dimostrare questa ipotesi, abbiamo adottato cellule da donatori B6 e CCR9−/− che trasportavano un tumore secernente Flt3-L per 14 giorni. Sotto l’influenza di Flt3L pDC ampliato in misura simile in B6 e CCR9−/− topi (Fig. 4 A e SI Fig. 8) ed erano indistinguibili per quanto riguarda l’espressione di CCR2, CCR5 e CXCR3 mentre CCR9 è stato rilevato solo su PDC derivati da donatori B6 ma non CCR9-carenti (Fig. 4 C). Senza ulteriore purificazione, gli splenociti di questi donatori sono stati etichettati con 5 (6)-carbossifluoresceina diacetato N-succinimidil estere(CFSE) e 5 (6)-carbossitetrametilrodamina N-succinimidil estere (TAMRA) rispettivamente. Una miscela di cellule WT e CCR9 carenti, aggiustate per contenere un numero uguale di pDC, è stata trasferita per via endovenosa in destinatari B6. Dopo 18 ore di trasferimento, abbiamo prima analizzato la composizione delle cellule WT trasferite adottivamente presenti nella preparazione IE e LP e abbiamo notato che il 54% e il 25% di tutte le cellule recuperate rispettivamente dalla frazione IE e LP erano pDC (Fig. 4 B). Questi risultati dimostrano che tra le diverse popolazioni cellulari trasferiti pDC casa più efficiente per l’intestino. Questi trasferimenti competitivi hanno anche rivelato che la pDC CCR9-carente è in gran parte compromessa nella loro capacità di ospitare l’intestino come riflesso dal basso rapporto di migrazione di CCR9-carente vs. WT pDC trovato nella preparazione IE e LP (Fig. 4 D). Al contrario, CCR9-carente e B6 pDC migrati con efficienza simile ai linfonodi periferici e mesenterici (Fig. 4 D). La natura dell’etichettatura cellulare non ha avuto alcun impatto su questi esperimenti perché l’interscambio dei coloranti tra le cellule B6 e CCR9−/− ha prodotto risultati identici (dati non mostrati). Anche se questi dati dimostrano chiaramente che pDC richiedono CCR9 per homing efficiente per l’intestino, va detto che le proprietà di traffico di pDC da topi trattati con Flt3-ligando potrebbero essere diverse da quelle presenti in situazioni fisiologiche.

I pDC vengono reclutati nell’intestino infiammato.

Poiché è noto che il pDC svolge un ruolo importante nell’immunità antivirale (4, 10) abbiamo ipotizzato che il pDC possa essere reclutato nell’intestino durante i processi infiammatori per rafforzare la difesa di prima linea. La tossina del colera (CT) è nota per indurre infiammazione intestinale quando somministrata per via orale ed è stato riportato che entro 2 ore dopo l’applicazione orale il numero di mDC reclutati transitoriamente nell’intestino aumenta di 4 volte (15). Abbiamo osservato che, oltre a mDC, i numeri di pDC aumentavano anche di 3 volte quando si alimentavano topi B6 con 10 µg di CT (Fig. 4 E). Di interesse, la configurazione sperimentale identica non ha mai portato ad alcun aumento di pDC né nella preparazione IE né nella preparazione LP di topi CCR9-carenti dopo 1, 2 o 3 ore di trattamento CT (Fig. 4 E e dati non mostrati). Il requisito specifico per CCR9 su pDC per il loro reclutamento nell’intestino durante i processi infiammatori è stato confermato dal trasferimento adottivo di WT e pDC CCR9-carente a destinatari CCR9-carenti seguito dall’applicazione di CT come descritto sopra. Mentre i pDC WT trasferiti adottivamente erano ampiamente presenti nella preparazione IE e LP, i pDC carenti di CCR9 erano quasi completamente esclusi da questi compartimenti (Fig. 4 F). Insieme, questi risultati mostrano che durante gli eventi infiammatori la pDC può essere reclutata nella mucosa intestinale e che questo meccanismo si basa in larga misura sulla CCR9.

Un ruolo per la pDC intestinale per la rapida mobilizzazione della DC mieloide LP.

Recentemente è stato dimostrato che l’applicazione orale del ligando resiquimod TLR7/8 (R848) provoca la rapida mobilizzazione di LP DC e che il TNFa, eventualmente rilasciato da pDC, è coinvolto in questo processo (16). Abbiamo quindi ipotizzato che il pDC intestinale potrebbe essere la fonte di TNFa che potenzialmente innesca la mobilitazione del vicino mDC. Per testare questa ipotesi, abbiamo stimolato in vitro B6 pDC della preparazione IE e LP per 16 h con R848. Infatti, pDC secreto notevoli quantità di TNFa, ma non è riuscito a produrre qualsiasi quantità rilevabile di IL-2, IL-4, IL-5, o IFNy (Fig. 5 Bis). Abbiamo quindi analizzato la mobilitazione di LP mDC in vivo dopo l’applicazione orale di R848. Mentre i topi B6 e CCR9−/− non trattati non differivano per quanto riguarda la presenza di mDC intestinale (Fig. 5 B), entro 2 h R848 orale ha indotto la mobilizzazione di ≈60% di mDC in peso ma solo 10.8% in topi CCR9−/−. È importante sottolineare che, una volta che i topi CCR9 carenti i. v. hanno ricevuto PDC splenico di donatori WT trattati con Flt3L 16 h prima applicazione orale di R848, questa carenza nella mobilizzazione mDC intestinale potrebbe essere completamente salvata (Fig. 5 C). Questi esperimenti mostrano che un homing CCR9-dipendente di pDC all’intestino è coinvolto nella rapida mobilizzazione di mDC intestinale dopo l’applicazione orale di un ligando TLR7/8. Poiché è stato dimostrato da altri nel modello di ratto che l’applicazione di LPS induce anche la mobilizzazione di LP mDC (17), abbiamo applicato 50 µg di LPS IP a WT e CCR9-carenti animali. Di interesse, in queste condizioni sperimentali non siamo riusciti a osservare alcuna differenza tra WT e CCR9-carenti animali per quanto riguarda la mobilitazione di LP mDC (SI Fig. 9).