Studio di progettazione

VX-765 studio: Cinque mesi di vita del veicolo-iniettato WT (WT + veicolo; n = 18) e J20 topi (J20 + veicolo: n = 14), e VX-765-iniettato J20 topi (J20 + VX-765: n = 13) topi sono stati longitudinalmente valutato in cinque punti differenti di tempo: di base prima del trattamento (baseline non trattata J20 sono stati raggruppati insieme; n = 19), dopo tre iniezioni IP a settimana di VX-765 o veicolo (Trattamento 1), dopo sei iniezioni aggiuntive nell’arco di 2 settimane (Trattamento 2), dopo un periodo di washout di 4 settimane (WO) e dopo altre tre iniezioni in 1 settimana (Trattamento 3) (Fig. 1 bis). Tutti gli animali testati sono stati inclusi nelle analisi a meno che (a) l’animale sia morto durante l’esperimento o (b) l’animale non abbia risposto comportamentale. Sono state utilizzate un totale di 25 cucciolate, distribuite su quattro diverse coorti e testate in tempi diversi. Tre di queste coorti sono state sottoposte a test NOR e open field, mentre la coorte 4 è stata utilizzata per Barnes maze. Dopo che gli animali sono stati testati al basale per confermare che gli animali J20 erano in deficit comportamentale, gli animali J20 sono stati assegnati in modo casuale al trattamento con veicolo o VX-765 indipendentemente dalle prestazioni comportamentali. Di tutti gli animali utilizzati, quattro topi J20 non hanno mostrato deficit comportamentali all’inizio dell’esperimento e non sono stati utilizzati. Due topi veicolo J20 + non si sono spostati affatto durante l’esperimento e i loro dati comportamentali esclusi; tuttavia, questi animali sono stati tenuti e sono stati ancora utilizzati per l’analisi post-mortem.

Casp1 validation study: Per convalidare gli effetti specifici di Casp1 di VX− 765, i topi J20 sono stati generati su uno sfondo Casp1−/ -. Sono stati utilizzati settantatré topi (n = 12-13 per genotipo, sei diversi genotipi), tutti allevati attraverso la fecondazione in vitro (IVF) da 35 femmine donatrici. I dettagli sull’allevamento sono descritti nella sezione Studi sugli animali di seguito. Tutti i topi sono stati valutati comportamentali tra i 7 e gli 8 mesi di età e nessun animale è stato escluso da questo studio.

Tutti i topi sono stati sacrificati ed elaborati a 8 mesi di età. Il punteggio comportamentale è stato accecato al genotipo murino e al trattamento, e tutti gli animali sono stati assegnati in modo casuale per analisi biochimiche o istologiche e analizzati alla cieca.

VX-765, VRT-043198 Test IC50 su caspasi ricombinanti

Studi sugli animali

Tutte le procedure sugli animali hanno seguito le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono state approvate dal comitato per la cura degli animali della McGill University. La linea di topo transgenico J20 (JAX Stock No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) esprime le mutazioni dell’APP umana svedese (670/671KM→NL) e Indiana (717V→F) sotto il PDGF-ßpromoter. I topi maschi J20 sono stati utilizzati come allevatori e il loro sperma è stato utilizzato per l’espansione della colonia IVF.

I genotipi sono stati determinati mediante biopsia della coda e RT-PCR. I topi sono stati alloggiati in gruppo (2-4 animali per gabbia) in gabbie macrolon standard in un ciclo di luce inversa/buio di 12 ore e condizioni ambientali controllate. Cibo e acqua erano disponibili ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) è stato sciolto in 20% cremophor in dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) e somministrato per via intraperitoneale. I topi J20 e WT trattati con veicoli hanno ricevuto solo cremophor.

Analisi della permeabilità della barriera emato–encefalica

I topi J20 e WT di cinque mesi sono stati anestetizzati con isoflurano e l’arteria carotide destra è stata separata. Una piccola incisione è stata fatta lungo la parete carotidea e un micro-catetere è stato inserito nell’ingresso dell’arteria carotide interna. Il catetere è stato fissato in posizione utilizzando filo di sutura. VX-765 (50 mg kg−1) è stato infuso a 50 µl min−1 (90-120 µl di volume totale). Il micro-catetere è stato lasciato un ulteriore 5 min per consentire la diffusione, dopo di che il sangue è stato raccolto mediante puntura intra-cardiaca. Il topo è stato perfuso transcardicamente con soluzione salina ghiacciata e l’ippocampo e la corteccia sono stati sezionati. I campioni sono stati inviati alla piattaforma di biofarmacia (Université de Montreal) per la cromatografia liquida e l’analisi di spettrometria di massa in tandem.

Analisi comportamentale

Campo aperto: l’attività locomotoria è stata misurata utilizzando un sistema di tracciamento automatizzato HVS2100 (HVS Image, Hamptom, UK). I topi sono stati collocati nella camera a campo aperto (scatola di plexiglas 40 × 40 cm, senza soffitto e pavimento bianco) e hanno permesso di esplorare per 5 min.

Novel object recognition( NOR): i topi sono stati pre-esposti a due oggetti identici nella camera a campo aperto per 5 min. Due ore dopo la pre-esposizione, i topi sono stati rimessi nella camera ed esposti a un oggetto familiare e un oggetto nuovo per 5 min. I topi sono stati esposti a un oggetto specifico solo una volta in diverse sessioni di test e il nuovo posizionamento degli oggetti è stato controbilanciato all’interno di ciascun gruppo di trattamento. Sono stati valutati i tocchi percentuali dell’oggetto nuovo durante la fase di test e l’indice di discriminazione ((# touches novel − # touches familiar)/total touches).

Barnes maze: la piattaforma Barnes maze (91 cm di diametro, elevata 90 cm dal pavimento) consisteva in 20 fori (ciascuno di 5 cm di diametro). Tutti i fori sono stati bloccati ad eccezione di un foro di destinazione che ha portato ad una scatola di fuga incasso. Segnali spaziali, luce intensa e rumore bianco sono stati utilizzati per motivare i topi a trovare la fuga durante ogni sessione. Per l’adattamento di fase, ogni mouse ha esplorato la piattaforma per 60 s. Un mouse che non ha trovato la casella di fuga, è stato guidato e vi rimase per 90 s. Per la fase di acquisizione, ogni prova ha seguito lo stesso protocollo, con l’obiettivo di formare ogni mouse per trovare la destinazione e immettere la casella di fuga, entro 180 s. Topi è rimasto nella scatola per ulteriori 60 s. Quattro prove al giorno, circa 15 min di distanza, sono state eseguite per 4 giorni consecutivi. Nel test della sonda (giorno 5), ogni topo ha eseguito uno studio di 90 secondi. L’obiettivo era ancora nella stessa posizione, ma la scatola di fuga era bloccata. Sono stati misurati la latenza e gli errori per raggiungere l’obiettivo, oltre al numero di colpi del mouse a ciascuno dei fori (preferenza target). Il labirinto Y era composto da un labirinto simmetrico a forma di Y con tre braccia a 120° l’una dall’altra, designate A, B e C. Gli animali sono stati posizionati all’estremità distale del braccio A e hanno permesso di esplorare il labirinto per 5 min. Sono state registrate le voci totali del braccio e l’alternanza spontanea, definite come voci consecutive in tre bracci diversi. È stata determinata l’alternanza percentuale.

Elaborazione dei tessuti

Per l’immunoistochimica, i topi (n = 4-6 per gruppo) sono stati anestetizzati con isofluorano e perfusi transcardicamente con soluzione salina ghiacciata seguita da paraformaldeide ghiacciata al 4% (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) in soluzione salina tamponata con fosfato da 0,1 M. I cervelli sono stati post-fissati in formalina tamponata neutra al 10% (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada) per 16 h e trasferiti in etanolo al 70%. I cervelli sono stati inseriti in paraffina e sezionati a 4 µm.

Per western blot ed ELISA (n = 4-8 per gruppo), i topi anestetizzati sono stati dislocati cervicamente, l’ippocampo e la corteccia sezionati e immediatamente congelati su ghiaccio secco. Le proteine sono state estratte in 5× volume/peso con radioimmunoprecipitation dosaggio (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Di Na-desossicolato, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 di Proteasi Inibitori Cocktail (Sigma-Aldrich)) sul ghiaccio con un tessuto omogeneizzatore (OMNI Internazionale, Kennesaw, GA, USA). I campioni sono stati centrifugati (20.000 × g, 4 °C) per 20 minuti, il surnatante recuperato e la proteina quantificata utilizzando il metodo BCA. Il pellet insolubile RIPA è stato ulteriormente estratto in acido formico al 70% in dH2O, evaporato e resolubilizzato in Tris-HCl da 200 mm, pH 7,5.

Colorazione immunoistologica

Gli epitopi sono stati demaskati in citrato (10 mm Tris-Na citrato, pH 6,0) o EDTA (10 mm Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9.0) buffer di recupero dell’antigene e immunostained utilizzando il Dako Autostainer Plus automated slide processor e EnVision Flex system (Dako, Burlington, ON, Canada). Seguenti deparaffinizzazione e reidratazione, le sezioni sono state perossidasi trattati, bloccato nel siero-proteine libero di blocco, e immunostained con i seguenti anticorpi diluito in EnVision Flex Diluente dell’Anticorpo: 1:2000 di coniglio anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 di coniglio anti-GFAP (Dako Z-0334), 1:2000 di coniglio anti-Aß1-40 (F25276, laboratorio sviluppato), e 1:1000 mouse antisynaptophysin (Sigma-Aldrich S5768). Le sezioni sono state trattate con l’anticorpo secondario coniugato HRP del topo o del coniglio fornito con il kit e visualizzate con DAB. Le sezioni erano hematoxylin counterstained, disidratato, e coverslipped con Permount (Fisher Scientific). Le sezioni sono state scansionate digitalmente con MIRAX SCAN per l’analisi (Zeiss, Don Mills, ON, Canada). Dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione, i vetrini sono stati colorati con tioflavina acquosa filtrata all ‘ 1% (Sigma-Aldrich).

Analisi immunoistologica quantitativa

Le cellule Iba1-positive nella corteccia e nella porzione anteriore della regione CA1 dell’ippocampo sono state quantificate utilizzando una versione modificata del quadro di conteggio areale48. In breve, ogni quinta diapositiva è stata quantificata (risultando in quattro sezioni per cervello). Più immagini ×80 sono state scattate con la SCANSIONE MIRAX all’interno dell’area di interesse e il numero di cellule Iba1-positive è stato contato manualmente. È stata stimata la densità numerica (numero di cellule mm−3) nella regione CA1 anteriore e nella corteccia. Un numero minimo di 150 visite per area sono stati necessari per fare una stima affidabile. Sezioni aggiuntive sono state contate se non siamo riusciti a raggiungere il nostro numero minimo. La quantificazione è stata eseguita in cieco per il trattamento e il genotipo. Il software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) è stato utilizzato per misurare l’accumulo di Aß, la colorazione immunopositiva GFAP e sinaptofisina nella regione CA1 e nella corteccia. Sono state analizzate quattro sezioni per cervello e sono state scattate più immagini all’interno di ciascuna sezione per coprire la regione CA1 e la corteccia. La soglia è stata ugualmente regolata su tutti i cervelli per evidenziare l’area macchiata e le particelle sono state analizzate per determinare l’area totale di colorazione. I risultati sono espressi come area totale macchiata per area totale analizzata (µm2 mm-2). Le immagini rappresentative sono state ritagliate solo per conformarsi ai vincoli di dimensione e non hanno subito alcuna post-elaborazione.

Western blotting

Campioni di proteine murine (25-100 µg) sono stati preparati in Laemmli (5% 2-β-mercaptoetanolo, 1 mm Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 di cocktail di inibitori delle proteasi (Sigma-Aldrich)), bolliti per 5 min e separati da elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGINA). I campioni sono stati sondati con i seguenti anticorpi primari, diluiti in latte secco al 5% senza grassi in soluzione salina tamponata con Tris e tampone bloccante allo 0,1% Tween-20 o PBS (Thermoscientific): 1: 1000 mouse anti-human Aß1-16 (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 di coniglio anti-APP C-terminale (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 di coniglio anti-neprilisina (Abcam ab79423), 1:500 di coniglio anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 di coniglio anti-Caspasi-3 (Cell Signaling 9665), 1:1000 mouse antiactive Caspasi-8 (Cell Signaling 8592), 1:1000 di coniglio anti-Caspase-9 (Cell Signaling 9504), e 1:5000 mouse anti β-actina (Sigma-Aldrich A5441). Le macchie sono state rilevate con 1:5000 anticorpo secondario anti-topo collegato con HRP (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) o 1: 5000 anticorpo secondario anti-coniglio (Dako P0217) seguito da ECL (GE Amersham). Le bande immunoreattive sono state visualizzate utilizzando il sistema di imaging ImageQuant LAS 4000 (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA) e le analisi densitometriche sono state eseguite con il software di analisi del calibro di immagine (Fujifilm USA). Luminosità / contrasto delle macchie grezze sono stati ugualmente regolati su tutta l’immagine con il software Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) per generare immagini rappresentative. Non è stata apportata alcuna modifica aggiuntiva. Il software CanvasTM X (Acd system, Plantation, FL, USA) è stato utilizzato per creare figure finali. Le macchie grezze per western blots sono disponibili nella figura supplementare 11.

ELISA

Le citochine pro e anti-infiammatorie e i livelli di Aß nel cervello del topo sono stati determinati utilizzando kit di analisi immunitaria elettrochimiluminescenza di Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA). Gli standard e i campioni sono stati preparati secondo i protocolli del produttore ed eseguiti in duplice copia. Il pannello proinfiammatorio del topo di ten-plex è stato usato per l’ippocampo del topo e corticale ed i campioni. Un singolo kit Il-1β è stato utilizzato per misurare il plasma del mouse. Il pannello proinfiammatorio umano a quattro plex è stato utilizzato per i campioni di HPN (vedi sotto). Il kit umano Aß 6E10 a quattro pannelli è stato utilizzato per l’ippocampo e la corteccia del mouse e per i campioni HPN.

Estrazione di RNA e sintesi di cDNA

L’RNA totale è stato estratto dall’ippocampo e dalla corteccia del topo (n = 3 per gruppo) con Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, USA) seguito da omogeneizzazione con un ago da 20 gauge. Il mini kit miRNeasy, che include la fase di trattamento della DNasi su colonna, è stato utilizzato per purificare l’RNA totale (Qiagen). La qualità e la quantità di RNA sono state determinate utilizzando uno spettrofotometro (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). I prodotti sono stati visualizzati su RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Canada) macchiato 2% gel di agarosio. Gli esperimenti di PCR in tempo reale sono stati eseguiti con SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) su una macchina per PCR veloce in tempo reale Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L’amplificazione genica è stata eseguita con i seguenti primer: (18s) 5 ‘- GTAACCCGTTGAACCCCAT-3 ‘e 5′ – CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’; (IDE) 5 ‘- ACTAACCTGGTGGTGAAG-3 ‘e 5′ – GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5′- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ e 5′- CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3’. I risultati sono espressi come valori di induzione della piega normalizzati per indicare i geni di riferimento HPRT e 18S utilizzando il metodo Pfaffl.

Mouse synaptic plasticity RT2-Profiler PCR array

Il mouse synaptic plasticity RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) profila l’espressione di 84 geni coinvolti nelle alterazioni sinaptiche durante l’apprendimento e la memoria e cinque geni di pulizia (β-actina; β-2-microglobulina; gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi, GAPDH; β-glucuronidasi, Gusb; Proteina di shock termico 90 alfa (citosolica), Hsp90ab1) con PCR in tempo reale. L’RNA totale (465 ng per ogni campione) è stato trascritto in senso inverso (che includeva una fase di eliminazione del DNA genomico) seguendo il protocollo del produttore (First Strand cDNA Synthesis Kit, Qiagen). La reazione di PCR in tempo reale è stata eseguita in un ciclatore in tempo reale ABI 7500 (Fast Block) (Applied Biosystems) utilizzando il RT2 SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen). Le condizioni di ciclo erano le seguenti: 2 min a 50 °C, 10 min a 95 ° C, 40 cicli, 15 s ciascuno a 95 °C e 1 min a 60 °C. La soglia e la linea di base sono state impostate manualmente secondo le istruzioni del produttore. I dati sono stati normalizzati alla media geometrica dei cinque geni di housekeeping e analizzati con il metodo Ct comparativo (2−ΔCT).

Coltura cellulare neuronale e assonale degenerazione test

Dodici – sedici settimane di età tessuto corticale fetale sono stati ottenuti dal Laboratorio di ricerca Difetti alla nascita (Università di Washington, Seattle, USA) in conformità con un protocollo approvato dal McGill institutional review board. HPN sono stati coltivati da cervelli che sono stati dissociati con tripsina, trattati con desossiribonucleasi I e filtrati attraverso 130, 70 e 30 µm nylon mesh21. Le cellule dissociate sono state centrifugate per 10 min a 300 × g e risospese in un mezzo essenziale minimo (MEM) con sali di Earle e integrate con BCS decompletato al 5%, 1× penicillina-streptomicina, 1 mm piruvato di sodio e 2 mm l-glutammina (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Le cellule sono state seminate ad una densità di 3×106 cellule ml-1 su 5 µg mL−1 poli-l-lisina-rivestito sei-well piastre di coltura del tessuto (Sigma-Aldrich). Il mezzo MEM è stato cambiato ogni 2 giorni e la proliferazione degli astrociti è stata limitata con il trattamento antimitotico fluorodeossiuridince (FdU) (1 mM, Sigma) per i primi 4 giorni. Le colture neuronali sono state coltivate 7-10 giorni prima di condurre esperimenti. Sono stati testati quattro diversi preparati neuronici in momenti diversi. Uno dei preparati neuronici non era stabile e la cultura, incluso il siero + controllo che non ha ricevuto alcun farmaco, è morto nel mezzo dell’esperimento. Pertanto, sono stati utilizzati tre diversi preparati di neuroni da tre donatori geneticamente diversi.

La tossicità del VX-765 è stata valutata con 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). I neuroni sono stati trattati con 25-200 µM VX−765 o 0.1% DMSO (più alta concentrazione di DMSO utilizzata) per 72 h. I neuroni sono stati quindi incubati con 0.5 µg ml-1 MTT (Sigma-Aldrich) per 4 h a 37 °C (5% CO2). I cristalli di formazan sono stati sciolti in 100 µl DMSO per 30 min. L’assorbanza è stata misurata a 560 e 670 nm utilizzando il lettore di piastre Synergy H4.

La degenerazione assonale è stata indotta dalla trasfezione di APPWT o dallo stress da privazione del siero. VX-765 è stato somministrato come strategia di pretrattamento (1 ora prima dello stress) o come strategia di trattamento postbeading (48 ore dopo lo stress). I neuroni sono stati trasfettati da Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Canada) con perline d’oro rivestite con pPudCE41-eGFP per la visualizzazione della fluorescenza. I neuroni che sono stati APPWT stressati sono stati trasfettati con pPudCE41-eGFP / APPWT. In breve, i neuroni sono stati trattati con mezzo integrato con 25 o 50 µM VX-765, inibitore Casp1 5 µM Z-YVAD-fmk o DMSO. Le immagini a fluorescenza sono state scattate ogni 24 ore (fino a 72 ore dopo il trattamento) con un microscopio Nikon Eclipse Ti (Nikon, Mississauga, ON, CA) e una fotocamera CCD coolSNAP HQ2 (Photometrics, Tucson, AZ, USA) utilizzando il software NIS Elements AR 3.10 (Nikon). La percentuale di bordatura neuronale è stata misurata contando il numero di neuroni eGFP-positivi in rilievo rispetto al numero totale di neuroni eGFP-positivi in ogni punto temporale. Un minimo di 150 neuroni eGFP-positivi è stato contato per ogni condizione. Il mezzo condizionato è stato campionato (integrato con 1 mm Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 di cocktail di inibitori delle proteasi (Sigma-Aldrich)) e i neuroni sono stati raccolti in buffer di lisi cellulare (50 mm HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mM EDTA) per l’analisi.

Analisi statistiche

Il numero di animali o esperimenti indipendenti e le analisi statistiche utilizzate (confronti ANOVA e post-hoc) sono tutti indicati nelle legende di figura. Tutti i valori sono espressi come media ± s.e. m., con valori F e p indicati nelle legende figura. Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).