Discussione

Il presente studio ha scoperto un ruolo per la proteina SR luminal Ca-binding, CSQ2 nella regolazione dell’accoppiamento eccitazione–contrazione e CICR nel cuore. In particolare, mostriamo che la sovraespressione Ad-mediata di CSQ2 ha aumentato drasticamente la grandezza di entrambi i transienti Ca indotti da cell in media cellulare e scintille Ca spontanee in cellule cardiache isolate. L’analisi della fase di aumento e della velocità di variazione di questi segnali Ca ha indicato che la loro dimensione aumentata era dovuta al rallentamento della terminazione dei flussi di rilascio Ca sottostanti dalla SR. Oltre a prolungare il rilascio di Ca attivo, la dinamica della ricarica funzionale delle riserve di Ca SR è stata rallentata anche nelle cellule con elevati livelli di proteina CSQ2, come indicato dal tempo di recupero rallentato per scintille Ca ripetitive. Abbiamo essenzialmente ottenuto i risultati opposti nei miociti, in cui i livelli di CSQ2 sono stati ridotti dalla trasduzione antisenso Ad-mediata. Questi miociti hanno mostrato un rilascio di Ca più breve ma una restituzione accelerata dei siti di rilascio di Ca. Inoltre, nei miociti periodicamente stimolati con livelli ridotti di CSQ2, l’applicazione di isoproterenolo ha causato oscillazioni aritmogene di intracellulare . Questi risultati mostrano che CSQ2 è un fattore determinante della funzione di rilascio CA SR che agisce governando la durata del rilascio CA e la refrattarietà del sito di rilascio. Alla luce dei disturbi isoproterenolo-dipendenti osservati nel Ca cycling ritmico nei miociti che sottoesprimono CSQ2, i nostri risultati sono rilevanti per comprendere i meccanismi cellulari delle aritmie indotte da catecolamine legate a mutazioni del gene CSQ2.

Meccanismi molecolari di azione CSQ2. Attribuiamo gli effetti osservati di CSQ2 sul rilascio di SR Ca alla capacità di questa proteina di funzionare come un buffer molecolare che controlla il libero nello spazio luminale SR (vedi schema proposto in Fig. 5). È noto da studi a doppio strato lipidico che il legame di Ca all’aspetto luminale del complesso RyR (cioè, sensore Ca luminal) aumenta l’attività del canale, mentre a luminale abbassato, l’attività del canale è ridotta (EC50 ≈ 1 mM; ref. 26). Poiché molti RYR sarebbero in uno stato attivato a normali livelli di Ca luminal a riposo (≈1 mm), l’abbassamento del luminale durante il processo di rilascio diminuirebbe quindi l’attività complessiva del canale (un processo chiamato disattivazione dipendente dal Ca luminal; ref. 3). I nostri risultati suggeriscono che stabilizzando il luminal libero locale nelle vicinanze di RyRs durante il processo di rilascio, CSQ2 rallenta la chiusura luminale Ca-dipendente del canale RyR, aumentando così la quantità di Ca rilasciata dalla SR al citosol. CSQ2 controlla anche le dinamiche di recupero dell’intra-SR libero durante il ri-assorbimento di Ca fungendo da sink per Ca nel lume SR. Pertanto, CSQ2 non solo potenzia l’efflusso CA SR, ma stabilizza anche CICR modulando la restituzione funzionale, o la prontezza, dei siti di rilascio CA dopo ogni rilascio. Recentemente, abbiamo invocato un meccanismo simile per spiegare gli effetti dei chelanti Ca a bassa affinità (sali organici) caricati nell’SR sul rilascio di Ca (3). L’importanza dei nostri risultati attuali è che mostrano come il processo di rilascio è controllato da una proteina Ca-legante endogena, residente in SR, CSQ2. Essi rivelano anche le conseguenze patologiche della ridotta quantità di CSQ2 nella SR delle cellule cardiache.

È stato proposto che CSQ2 potrebbe influenzare la funzione del canale di rilascio Ca attraverso interazioni dirette con proteine che comprendono il complesso del canale di rilascio Ca (cioè RyR, junctin e / o triadin) (ref. 13; per la revisione, vedi ref. 9). I nostri studi non hanno rivelato differenze considerevoli nei parametri del rilascio di SR Ca tra le cellule contenenti livelli elevati di circa 3 volte di proteina CSQ2 e le cellule in cui i buffer organici sono stati caricati nell’SR (3). Così, la spiegazione più semplice per i nostri risultati è che la prevalente effetti di CSQ2 sulla SR Ca rilascio sono dovuti per il buffering azioni di questa proteina all’interno della SR. Delucidazione del meccanismo dettagliato da cui CSQ2 e le proteine associate come junctin e triadin regolano il rilascio di Ca attesa di studi che coinvolgono la manipolazione dei livelli e l’espressione di forme mutanti di queste proteine con alterata capacità di interagire tra loro e RyR.

La velocità massima di rilascio di Ca dai miociti stimolati era simile indipendentemente dalla quantità di CSQ2 espressa nella SR (Figs. 2B e 3D). Questi risultati supportano la nozione che CSQ2 controlli di terminazione del processo di rilascio, ma questi risultati non sono ciò che si dovrebbe necessariamente prevedere in base al previsto buffering effetti di questa proteina nella SR. Infatti, il massimo tasso di rilascio dovrebbe essere maggiore nelle cellule con un aumento del lume Ca-buffering punti di forza causata da rallentato il declino del libero intra-SR , perché, in queste cellule, il ritardo nella diminuzione del Ca gradiente tra la SR membrana dovrebbe rendere più grande Ca flusso di intensità. Diverse possibili ragioni spiegano perché questo non è stato osservato. Una possibilità è che l’intra-SR libero iniziale possa essere inferiore in CSQ2-overexpressing rispetto alle celle CSQ2-underexpressing. Sebbene allo stato stazionario il libero in un compartimento chiuso come l’SR non dovrebbe essere influenzato dal numero di siti di legame Ca (questo dovrebbe influenzare solo la cinetica in cui è raggiunto lo steady-state intra-SR), è possibile che un vero stato stazionario non sia stato raggiunto nei nostri esperimenti (cioè, miociti sottoposti a stimolazione a bassa velocità). Un’altra possibilità è che la presenza di livelli elevati di proteina CSQ2 rallenta la diffusione di Ca nello spazio luminale, rallentando così l’esodo di Ca attraverso i canali aperti. Chiaramente più ricerca, sia sperimentale che teorica, è necessaria per risolvere questo problema.

Cessazione del CICR. Il modo in cui il CICR, un processo con un’intrinseca propensione all’autorigenerazione, viene terminato è stato oggetto di intense ricerche, prima utilizzando misure di transienti Ca globali e, più recentemente, esaminando le scintille Ca (3, 27-30). Una possibilità che è stata presa in considerazione è che i canali RyR subiscono inattivazione o adattamento Ca-dipendente a seguito dell’aumento di sul lato citosolico del canale (27-29). Un’altra possibilità è che il declino intra-SR fornisce un segnale attivo per la chiusura di RYRS dopo l’apertura (3, 30-32). Recentemente abbiamo trovato prove sperimentali dirette per un ruolo dei cambiamenti indotti da Ca luminal nell’attività RyR (cioè, disattivazione dipendente da Ca luminal) nella terminazione del rilascio di Ca SR bloccando i livelli di intra-SR con buffer Ca a bassa affinità caricati nelle cisterne SR (3). Utilizzando questi buffer, abbiamo notevolmente prolungato la durata del rilascio di Ca attivo alla base dei transienti Ca focali e globali nei miociti. Coerentemente con questi risultati, i nostri risultati attuali mostrano che l’aumento dei livelli del buffer CA luminal CSQ2 ad alta capacità prolunga la durata del rilascio di Ca, mentre la riduzione della quantità di questo buffer endogeno riduce la durata del rilascio, apparentemente rallentando o accelerando la chiusura luminale Ca-dipendente di RyRs, rispettivamente. Insieme questi risultati forniscono prove convincenti per il ruolo della disattivazione luminale Ca-dipendente di RYRS nella cessazione di CICR. Sebbene dimostrino l’importanza dei cambiamenti nella Ca luminal nella cessazione del rilascio di Ca SR, i nostri risultati non escludono necessariamente la possibilità che meccanismi aggiuntivi, come l’inattivazione di RyR o l’adattamento nei siti regolatori della Ca citosolica, possano influenzare anche la cessazione del rilascio di Ca.

Sebbene esista una chiara evidenza per un ruolo per i cambiamenti nella Ca luminal nella terminazione delle scintille cardiache (ref. 3; studi precedenti hanno indicato che le scintille di Ca nel muscolo scheletrico potrebbero non essere accompagnate da un sostanziale esaurimento della SR . Lacampagne et al. (33) utilizzato l’analisi cinetica delle registrazioni ad alta risoluzione temporale Ca spark per suggerire che il flusso di rilascio Ca alla base della Ca spark è costante nelle fibre muscolari anfibie. Poiché il flusso di Ca SR deve diminuire ogni volta che l’SR cade, questo risultato potrebbe significare che i livelli di Ca luminal rimangono costanti durante le scintille CA. Pertanto, esiste la possibilità che i meccanismi di base responsabili della terminazione della scintilla siano diversi nel muscolo cardiaco e scheletrico. L’esecuzione di studi complementari in questi due tipi di cellule (cioè la modulazione dei livelli di proteine CSQ nelle fibre muscolari scheletriche e le misurazioni rapide della cinetica Ca spark nei miociti cardiaci) dovrebbe aiutare a chiarire questo problema.

Rilevanza per CPVT. Uno degli aspetti più importanti dei nostri risultati è che mostrano come i livelli ridotti di CSQ2 possono causare aritmie cardiache a livello cellulare. CPVT è una malattia aritmogena caratterizzata da sincope e morte improvvisa inducibile da esercizio fisico e infusione di catecolamina (34). Finora, quattro mutazioni sono state collegate a CPVT. Tre di queste mutazioni sembrano portare a una ridotta espressione di CSQ2 (17) e una mutazione è stata proposta per portare a un legame interrotto di Ca (16). I nostri risultati suggeriscono che la causa sottostante di CPVT potrebbe essere correlata alla restituzione anormale del meccanismo di rilascio Ca causato da livelli ridotti di CSQ2 (Fig. 5). A causa della minore concentrazione di siti di legame Ca nella SR delle cellule che sottoesprimono CSQ2, il riempimento del deposito Ca tramite la pompa SERCA avviene più velocemente che nelle cellule normali. La ricarica del negozio diventa ancora più veloce quando l’attività di SERCA viene stimolata dalla protein chinasi A, potenzialmente rappresentando la dipendenza degli episodi clinici di CPVT dalle catecolamine. Nei miociti con livelli ridotti di CSQ2, il recupero prematuro dei canali di rilascio di Ca da uno stato refrattario luminal Ca-dipendente ha portato a scariche spontanee extrasistoliche di depositi di Ca SR. È noto che il rilascio spontaneo di Ca può indurre correnti interne e oscillazioni nel potenziale di membrana, con conseguente aritmia innescata (4-7). Pertanto, i disturbi osservati nella manipolazione della Ca potrebbero spiegare, almeno in parte, la patogenesi della CPVT associata a difetti genetici che determinano una ridotta attività di legame della Ca (16) o una riduzione dei livelli di espressione di CSQ2 (17).

Confronto con precedenti studi su topi transgenici. I nostri risultati differiscono dai precedenti risultati ottenuti in topi transgenici che sovraesprimono CSQ2 (14, 15). In questi studi, una sovraespressione da 10 a 20 volte di CSQ2 ha aumentato la capacità di stoccaggio di Ca SR di miociti cardiaci isolati; tuttavia, la Ca luminal non era disponibile per il rilascio, portando a segnali di rilascio di Ca globali e locali depressi. Questi cambiamenti nella gestione della Ca sono stati accompagnati da diverse alterazioni strutturali, funzionali e biochimiche a livello cellulare e subcellulare e sviluppo di ipertrofia e insufficienza cardiaca. D’altra parte, il presente studio mantiene i livelli di proteina CSQ2 più vicini ai livelli fisiologici in condizioni acute piuttosto che croniche; pertanto, è probabile che questi dati riflettano più accuratamente le conseguenze fisiologiche dirette dei cambiamenti nei livelli di proteina CSQ2 sulla manipolazione intracellulare di Ca. Questi risultati evidenziano i potenziali problemi nell’interpretazione degli effetti dell’espressione costitutiva ad alto livello delle proteine nei modelli animali transgenici e il valore di studi complementari in contesti più acuti.

Conclusione. In conclusione, abbiamo scoperto che CSQ2 è un determinante essenziale della capacità della SR di immagazzinare e rilasciare Ca nel muscolo cardiaco. CSQ2 sembra servire come serbatoio per Ca che è facilmente accessibile per CICR e anche come un buffer Ca attivo che modula la chiusura locale luminale Ca-dipendente di RyRs. Allo stesso tempo, CSQ2 stabilizza il meccanismo CICR rallentando la ricarica funzionale dei negozi SR Ca. Il comportamento anomalo di repriming dei canali di rilascio di Ca potrebbe spiegare o contribuire alle aritmie ventricolari associate a mutazioni nel gene CSQ2.