A CPZ a TRPV1-től függetlenül csillapítja a vastagbélgyulladást
annak a mechanizmusnak a megtámadása érdekében, amellyel a CPZ beöntések enyhítik a kísérleti vastagbélgyulladást, dextrán-szulfát-nátrium (DSS) vastagbélgyulladást indukáltunk vad típusú (WT) és TRPV1-ben-hiányos egerek (minden csoport N = 8). Bár ellentmondó jelentések léteznek, a TRPV1-hiányos egerekben DSS vastagbélgyulladás és súlycsökkenés alakult ki ugyanolyan mértékben, mint a laboratóriumunkban lévő kongénikus WT egereknél, ami megfelel a korábban közzétett tnbs colitis modell eredményeinek7,8,9,10,11,12. A CPZ beöntési kezelésekhez ugyanazt a CPZ-koncentrációt használtuk (531 6m), amelyről korábban beszámoltak, hogy gyengíti a DSS (5%) vastagbélgyulladást patkányokban8. A colitis lefolyását naponta monitorozták testtömeg-mérésekkel és endoszkópiával. A CPZ (531 6m) enemák napi kétszeri alkalmazása ugyanolyan mértékben gyengítette a DSS colitist mind a WT, mind a TRPV1−/− egerekben, amit a jobb endoszkópos pontszám és a csökkent testtömeg-csökkenés tükrözött (ábra. 1A-C). H&a disztális vastagbélből származó e foltok a 7 napos DSS kísérlet végén megsemmisítették a nyálkahártya szöveti architektúráját, számos infiltráló immunsejttel a kontroll kettőspontjában. Ez éles ellentétben állt a széles körben ép nyálkahártyával és a szignifikáns immunsejt-infiltráció hiányával a CPZ-vel kezelt egerek kettőspontjában, mindkét genotípusban (ábra. 1D). Ezeknek az eredményeknek megfelelően a szövettani pontszám mindkét genotípus CPZ-vel kezelt egerében erősen csökkent (ábra. 1E).
A CPZ aktiválja a TRPA1-et
az in vivo megfigyelés, miszerint a CPZ beöntések hatékonyan gátolták a vastagbélgyulladást a TRPV1 null mutáns egerekben a kérdést a CPZ TRPV1-től független neuronális hatásaira vetették fel. Mivel kimutatták, hogy a TRPA1 döntő fontosságú a gyulladás különböző modelljeiben, beleértve a colitis6,12,14-et, teszteltük, hogy a CPZ hat-e a TRPA1-re.
CPZ-indukált Ionos áramok htrpa1-en keresztül
Patch bilincs kísérleteket végeztünk feszültségbilincs üzemmódban rekombináns hTRPA1-et expresszáló hek293t sejteken (hTRPA1-HEK293t sejtek). -60 mV-os tartási potenciál mellett a CPZ (10 ~ m) olyan befelé irányuló áramot indukált, amelyet a szelektív TRPA1 antagonista, a HC-030031 (HC, 10 ~ m) szinte teljesen gátolt (93% gátlás, n = 5). 2A). Minden olyan sejtben, amelyben CPZ-indukált befelé irányuló áramot rögzítettek, a carvacrol (100 6m) egy megalapozott TRPA1 agonista szintén nagy befelé irányuló áramokat váltott ki ugyanabban a tartási potenciálban, bemutatva a htrpa1 funkcionális expresszióját. Ezeket a hTRPA1-HEK293 cellákat feszültségrámpáknak is alávetettük -100-tól +100 mV-ig, 400 ms időtartamonként 4 másodpercenként (ábra. 2B). A CPZ-indukált, áram-feszültség kapcsolat kissé kifelé egyenirányítást és 0 mV-hoz közeli megfordítási potenciált mutatott (ábra. 2C). A CPZ által kiváltott áramokat (10 MHz) gátolta a HC (10 km). A hatás kifejezettebb volt a negatív potenciáloknál (89% – os 5% – os gátlás -80 mV-nál, átlagos 6d-nél, n = 7), mint a pozitív potenciáloknál (80% – os 9% – os gátlás +80 mV-nál).
a Kapszazepin (CPZ) aktiválja a heterológ módon expresszált humán TRPA1-et.
(a) A CPZ (10 MHz) hTRPA1 által közvetített áramokat idéz elő a transzfektált HEK293t sejtekben. Vegye figyelembe az áramok teljes gátlását a szelektív TRPA1 antagonista HC030031 (HC, 10!) által. (B) reprezentatív rámpa áramok által kiváltott hTRPA1-transzfektált hek293 cella 400 ms feszültség rámpák -100 hogy +100 mV alkalmazott minden 4 s. minden szimbólum képviseli az aktuális amplitúdó -80 MV (négyzetek) és +80 mV (körök). A CPZ által indukált áramot erősen gátolta a HC. (C) példák az egyes rámpaáramokra, amelyek megfelelnek a B. D) CPZ (50 6-10 s) nagy kalcium tranzienseket idéz elő a hTRPA1-HEK293 sejtekben (fekete nyom, n = 128). A HC (20 6db; vörös nyom, n = 209) és az A-967079 (10 m; kék nyom, n = 140) teljesen gátolta a CPZ-re adott választ. Az adatok jelentése jelenti (egyenes vonalak), SEMS (szaggatott vonalak). (E) a HTRPA1 aktiválása CPZ-vel (10 MHz) koncentrációfüggő. Fekete nyom: a hTRPA1-HEK293 sejteket (n = 52) stimuláltuk a CPZ koncentrációjának növelésével 20 másodpercig 3 perc intervallumokban. Szürke nyom: a nem fertőzött HEK293 sejteket (n = 101) ugyanolyan CPZ-koncentrációnak vetettük alá. (F) A HTRPA1 aktiválása CPZ-vel (1 db) három kritikus ciszteint foglal magában a csatorna N-terminálisában. Fekete nyom: a WT hTRPA1-et expresszáló N = 123 HEK293 sejt válasza a CPZ (1 db), a karvakrol (100 db) és az allil-izotiocianát (AITC, 50 db) egymást követő alkalmazására. Szürke nyom: n = 165 HEK293 sejt válasza, amely a mutáns hTRPA1-3C-t expresszálja ugyanazon ingersorozatra. Vegye figyelembe a HTRPA1-3C mutáns CPZ-re és AITC-re adott válaszának jelentős csökkenését, de a karvakrolra nem. G) a genotípusok közötti CPZ-érzékenység különbségét 100 MHz CPZ-nél eltörölték. (H) a HTRPA1 CPZ általi aktiválása megakadályozható a scavenger N-acetil-cisztein (NAC) segítségével. Fekete nyom: a kontroll kísérletekben a HTRPA1-HEK293 sejteket CPZ-vel (50 60 S; n = 74) provokáltuk. Vörös nyom: egy külön kísérletben a sejteket először 30 másodpercen át CPZ (50 MHz) és NAC (15 mM) kombinációnak tették ki, majd közvetlenül a CPZ-t további 30 másodpercig (n = 83) követték.
CPZ-indukált kalcium-beáramlás a hTRPA1-en keresztül
a CPZ szelektív hatását a TRPA1-re a kalcium-mikrofluorimetriai technika alkalmazásával igazolták. a HTRPA1-HEK293 sejteket két CPZ-alkalmazás stimulálta (50 kb) 10 másodpercig 5 perces időközönként (ábra. 2D). A szelektív antagonistákat HC-vel (20 MHz) és A-967079-vel (10 km) alkalmazták 1 percig az első CPZ-kihívás előtt és alatt. A CPZ-választ mindkét antagonista teljesen eltörölte. Érdemes megjegyezni, hogy a HC eltávolítása kalcium beáramláshoz vezetett, valószínűleg a maradék CPZ hatás miatt, míg ez az off hatás hiányzott az a-967079 esetében, amely lassabban leválhat (ábra. 2D). Ezután elemeztük a CPZ-hatások koncentráció-függőségét. Növekvő CPZ-koncentrációkat (100 nM, 500 nM, 5! és 50!!!!) alkalmaztunk a hTRPA1-HEK293 sejtekre 20 másodpercen keresztül, 3 perces időközönként. 100 nM-től kezdődően a CPZ összes koncentrációja egyre nagyobb amplitúdóval rendelkező kalcium-tranzienseket váltott ki (ábra. 2E). A kísérlet végén Carvacrol-t (100 Ft) alkalmaztunk a funkcionális TRPA1 expresszió szabályozására, de a carvacrol válasz 50 ft CPZ után szembetűnően kicsi volt, ami kereszt-deszenzitizációra utal. A nem fertőzött HEK293 sejteket ugyanazoknak a CPZ-alkalmazásoknak vetettük alá, és csak a legmagasabb vizsgált koncentráció (50 6m) indukálta a kalcium minimális növekedését. Arra számítottunk, hogy a CPZ bekapcsolja a három kritikus cisztein maradékot a csatorna N-terminális doménjében, mert ez egy elektrofil vegyület. A WT hTRPA1-et expresszáló hek293 sejteket és a hármas cisztein mutáns hTRPA1-3C-t (C621S, C641S, C665S) expresszáló sejteket CPZ-nek vetettük alá (1 60 m, 20 m), ezt követte a nem elektrofil agonista karvakrol (100 m, 20 m) és az erősen elektrofil AITC (50 m, 30 m). Az ionomicint a kísérlet végén pozitív kontrollként alkalmazták. A kalcium-tranziens amplitúdója, amelyet az 1 db-os CPZ idézett elő, jelentősen csökkent (>80%) a hTRPA1-3C-t expresszáló sejtekben, összehasonlítva a WT hTRPA1-et expresszáló sejtekkel (ábra. 2F), míg a genotípusok közötti CPZ-érzékenység különbségét 100 6DC CPZ koncentrációnál eltörölték (ábra. 2 g). Az AITC válasz csökkent a mutáns sejtekben, míg a karvakrol nagy kalciumion tranzienseket váltott ki mind a WT, mind a 3C mutánsokban. Ezek a sejtválaszok együttesen azt jelzik, hogy a CPZ viszonylag magas hatékonysága a három kritikus ciszteintől függ. Ha azonban a CPZ koncentrációja 100-szor magasabb, akkor más kötőhelyek veszik át a hTRPA1 aktiválását. A lipofil CPZ ezen magas koncentrációja kölcsönhatásba léphet a sejtes lipidmembránnal is, közvetetten aktiválva a TRPA1-et, amint azt korábban a lipopoliszacharidok lipid a komponense16. Sőt, az elektrofil scavenger jelenlétében N-acetil-cisztein (NAC) telítő koncentrációban (15 mM) 50 a CPZ nem tudott választ kiváltani. A NAC eltávolítása után a CPZ nagy kalcium tranzienseket váltott ki a hTRPA1-transzfektált HEK293t sejtekben (ábra. 2H), amely megerősíti, hogy a CPZ elektrofil agonistaként működik a hTRPA1 számára.
A CPZ aktiválja az AITC-érzékeny dorzális gyökér ganglion (DRG) neuronok szubpopulációját
a DRG neuronokat primer tenyészetben tartották fenn, és kalcium-mikrofluorimetriával vizsgálták. A sejteket CPZ-vel stimuláltuk (50 km, 20 s), majd AITC-vel (100 km, 30 s), kapszaicin-nel (1 km, 10 s) és KCl-lel (60 mM, 30 s). A 3a. ábra példákat mutat be arra, hogy a DRG neuronok reagálnak mind a négy ingerre. A DRG neuronok tipikus frakcióját az aitc aktiválta (301 906 neuronból, 33%, n = 8 egér), jelezve a TRPA1 funkcionális expresszióját. Ezen AITC-érzékeny neuronok szubpopulációját a CPZ is aktiválta (185 301 neuronból, 61%). A CPZ iránti érzékenység szinte teljesen az AITC-re reagáló neuronokra korlátozódott. Összesen 200 CPZ-érzékeny Neuron közül 185-öt (93%) aktivált az AITC, ami a CPZ és az AITC érzékenységének erős egyezését jelzi (ábra. 3). Mint a hTRPA1-expresszáló HEK293 sejtek esetében, a CPZ által kiváltott kalcium-tranziensek a DRG neuronokban koncentrációfüggőek voltak, az EC50 értéket 30 6db CPZ-re becsülték, és a kis AITC válasz 100 m CPZ után ismét kereszt-deszenzibilizációt javasolt (ábra. 3B,C). A 3D ábra a CPZ, a CAP és az AITC-válaszkészség átfedését mutatja a WT DRG neuronokban adott koncentrációban: a DRG neuronok 14% – A reagált az AITC-re, de nem a CAP-ra (125/906), 16% – a reagált a CAP-ra, de nem az AITC-re, míg a CPZ kalcium-tranzienseket indukált az aitc-re és a CAP-ra reagáló neuronok 78% – ában (137/176). A megfigyelt hatások specifikusságának bizonyítására a TRPV1−/− és TRPA1 – / – DRG neuronokat a fenti protokollnak tették ki. A TRPV1-hiányos DRG neuronok körülbelül 90%-a, amelyek aitc-érzékenyek voltak, szintén reagáltak a CPZ-re (509/572 sejt), míg a vizsgált 448 TRPA1-hiányos DRG Neuron közül egyik sem mutatott kalcium beáramlást a CPZ-re adott válaszként (100 Ft), amint azt az ábrán látható reprezentatív példák szemléltetik. 3E, F.
a Kapszazepin (CPZ) aktiválja az egér TRPA1-et a hátsó gyökér ganglion neuronokban.
(a) A CPZ (50!) aktiválja az AITC (100!!!!) érzékeny egér dorzális gyökér ganglion (DRG) neuronjainak alcsoportját. A CPZ által aktivált három különböző aitc – és kapszaicin-érzékeny DRG Neuron egyedi válaszai. A CPZ-T 20 másodpercig, az AITC-t 30 másodpercig, a CAP-ot pedig 10 másodpercig alkalmazták 4 perces időközönként, lehetővé téve a helyreállítást. A kísérlet végén KCl-t (60 mM) alkalmaztunk a tenyésztett idegsejtek életképességének biztosítása érdekében. (B) átlagolt válasz N = 135 aitc-érzékeny neuronok három különböző koncentrációjú CPZ (25, 50, 100 6m, 20 s minden). Vegye figyelembe a Ca amplitúdójának koncentráció-függőségét2+ tranziensek. Az egyenes nyomok jelentik az átlagot,a pontozott nyomok pedig a szemeket. (C) A CPZ-indukált I koncentrációfüggő növekedése az AITC-érzékeny DRG neuronokban, amelyek depolarizáló ingerre normalizálódtak KCl-vel (60 mM). Az EC50-et (30) a dózis-válasz függvényhez igazítva számítottuk ki. Az adatok két kísérletsorozatra reprezentatívak, és azt mutatják, hogy a (z) 6., 10., 25. CPZ esetében (669), A (Z) 25., 50., 100. CPZ esetében (138). D) A CPZ-, AITC – és CAP-érzékeny DRG neuronok populációinak bemutatása és átfedésük. Összesen 906 leképezett idegsejtben (a KCl-re adott válaszuk alapján választva) 200 (22%) aktivált CPZ-t (50 fő), 301 fő (33 fő) AITC-t (100 fő) és 323 fő (36 fő) CAP-t (1 fő) (a frakciók részletes elemzése, lásd SI ábra 3.Jelmagyarázat). (E) a CPZ (100 kb, 20 s) aktiválja a TRPV1-hiányos egerek AITC (100 kb, 20 s)-érzékeny DRG neuronjait. Különböző AITC-érzékeny neuronok egyedi válaszai, amelyeket a CPZ aktivált. A TRPV1-hiányos DRG neuronok körülbelül 90%-a (509/572 sejt), amelyek aitc-érzékenyek voltak, reagáltak a CPZ-re. A CAP (1 6m, 10 s) nem indukált Ca2+ tranzienseket a TRPV1−/− neuronokban. (F) A CPZ (100) által kiváltott Ca2+ beáramlás hiánya a TRPA1-hiányos DRG neuronokban. Egyéni válaszok különböző CAP-érzékeny DRG neuronoktól (a 448 vizsgált neuronból), amelyeket sem a CPZ, sem az AITC nem aktivált (10!).
a TRPA1-en keresztüli szisztémás deszenzitizáció csökkenti a fájdalmat
miután felfedeztük, hogy a CPZ egy erős TRPA1 agonista, megértettük, hogy az első CPZ beöntés (naponta kétszer) nyilvánvalóan fájdalmas volt a WT egerekben. Ezután számszerűsítettük a CPZ-t (531 6m) beöntés által kiváltott nocifenzív viselkedés egészséges állatokban (mindegyik n = 6) a vonagló reakciók megszámlálásával és a visceromotoros reflex válaszok (vmrs) rögzítésével a hasi izomfal integrált elektromiográfiáján (EMG) keresztül (ábra. 4A, B). A napi kétszeri CPZ kezelések megismétlése során megjegyeztük, hogy a TRPA1 kiütések soha nem mutattak fájdalommal kapcsolatos viselkedést. Ezenkívül a WT egerek a kezdetben erős fájdalomválaszok fokozatos csökkenését mutatták be, meredek csökkenéssel a 3. NAP körül, ami végül teljes deszenzitizációhoz vezetett mindkét nocifenzív paraméterben. A vastagbél fájdalomérzékelésének ez a vesztesége egyébként normális egerekben felvetette azt a várakozást, hogy a beöntések a CPZ-t Farmakodinámiás mennyiség elegendő a szisztémás hypoalgesia kiváltásához. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez a szemtörlési tesztet alkalmaztuk AITC (100 6m) és CAP (1 mM) használatával (ábra. 4C,D) (n = 6). Mindkét teszt a szemtörlés számának egyértelmű csillapítását mutatta azokban a WT egerekben, amelyeket CPZ beöntéssel kezeltek (a vizsgálat előtt 12-16 óráig). Ezeket a hatásokat valószínűleg a TRPA1 deszenzitizáció közvetítette, nem pedig a TRPV1 blokk, mivel a TRPV1-hiányos egerek ugyanolyan mértékben érzéketlenek voltak a mustárolajra (aitc, 100 kB) a szembe történő csepegtetés, mint a WT egerek (ábra. 4C). Ezzel szemben a CPZ beöntések hatástalanok voltak a TRPA1 – / – egerekben, amikor ezeket az egereket a szembe történő csepegtetéssel megtámadták (ábra. 4D).
a Capsazepin beöntések érzéketlenné teszik a helyi és távoli fájdalomreakciókat.
(A) akut vonagló reakciók a CPZ-re adott válaszként (531 6m) beöntések az alkalmazás utáni első 5 percben. Az ismételt CPZ beöntések (naponta kétszer) a vonagló válaszok fokozatos csökkenéséhez vezettek. A WT egerekben 5 beöntés után drámai lépéscsökkenést figyeltek meg. Ezzel szemben a CPZ− vel kezelt TRPA1 – / – egerek (531 6m) vagy WT egerek vivőanyaggal (PBS) kezelt beöntések csak kevés vonaglást mutattak, amelyek az első 30 másodpercen belül bekövetkeztek (mindegyik n = 6). (B) VISCEROMOTOROS válaszok (VMR) a CPZ beöntésekre. A CPZ beöntések naponta kétszer a VMRS folyamatos csökkenéséhez vezettek a WT egerekben, hasonlóan a vonagló reakciók lefolyásához. A VMR-ek a vivőanyagra adott válaszként nem különböztek szignifikánsan a CPZ beöntéseitől a TRPA1−/− – ben (mindkettő n = 6). (A,B) WT CPZ csoport a járműcsoporttal összehasonlítva. (C) az ismételt CPZ beöntések gyengítik a szemtörlő viselkedését AITC-re(100 6m). Mind a WT, mind a TRPV1−/− egerek CPZ beöntéssel kezelve a szemtörlések számának mély csökkenését mutatták a vivőanyaghoz képest (mindkettő n = 6). A kontrollok WT egerek voltak beöntés nélkül, amelyek vivőanyagot (PBS)kaptak a szembe. (D) A CPZ beöntések csillapítják a szemtörlő viselkedését a kupakig (1 mM). A vivőanyaggal kezelt WT egerek és a TRPA1 – / – egerek, amelyeket CPZ beöntéssel kezeltek naponta kétszer 7 d-n keresztül, számos szemtörlő reakciót mutattak a CAP szemcseppentésére, 12 órával az utolsó CPZ beöntés után tesztelték (mindkettő n = 6). A CPZ beöntéssel kezelt WT egerek a szem törlők számának mély csökkenését mutatták. (E) termikus és (F) mechanikus kivonási küszöbértékek mindkét hátsó mancs esetében az orális CPZ (531 6m) vagy aitc (500 m) gyógyszeres kezelés során ivóvízen keresztül. (E) a CPZ és az AITC 10 d felett a vivőanyaggal kezelt csoporthoz képest 3-5 d alatt progresszív növekedést indukált a sugárzó hő stimulációjának elvonási késleltetésében, amely a kimosást követő 2 héten belül normalizálódott (mindegyik n = 6). (F) az elektrodinamikus von Frey filamentummal történő stimuláció mechanikai küszöbértékei nem mutattak szisztematikus tendenciát mindkét vegyület esetében (mindegyik n = 6). Minden ismételt mérések ANOVA és Dunnett utáni teszt, kivéve a (C,D) Mann Whitney U-teszt.
mivel az ismételt beöntések kellemetlen beadási módot jelentenek, teszteltük a perorális CPZ (531) lehetséges anti-nociceptív hatását az ivóvízben. A 10 napos ivási rendet jól tolerálták, nyilvánvaló káros hatások nem jelentkeztek. A folyamatos orális CPZ adagolás során a mancs-megvonási késleltetés a sugárzó hő stimulációig (Hargreaves módszer) fokozatosan nőtt mindkét hátsó mancsnál (ábra. 4E). A toleranciaidő a 7. napon körülbelül megkétszereződött, és a 2.naptól a 10. napig jelentősen emelkedett maradt. Tiszta ivóvízzel végzett 2 hetes gyógyulás után a megvonási késleltetés visszatért a kiindulási szintre. Az elektrodinamikus von Frey izzószál lineárisan növekvő erejével történő stimulációra adott mechanikai válaszkészséget nem befolyásolta szignifikánsan a CPZ ivás tíz napja alatt (ábra. 4F). Felmerült a kérdés, hogy a hő és a kémiai hypoalgesia a TRPA1 agonisták deszenzibilizáló hatásának osztályhatását képviseli-e, vagy a CPZ-re specifikus. Így az aitc-t hasonló és jól tolerálható koncentrációban (500 Ft) adtuk be az ivóvízen keresztül. Ugyanaz az aitc adagolási rend, mint a CPZ esetében, a Paw-megvonási késleltetés fokozatos növekedését eredményezte sugárzó hő stimuláció, amely szignifikánsan kisebb volt, mint a CPZ által indukált (ábra. 4E). A mechanikai reakciókészség nem változott az aitc ivási rend szerint (ábra. 4F).
A CPZ a peptiderg szenzoros neuronokat expresszáló TRPA1/TRPV1 tartós deszenzitizációját okozza
ezután feltettük a kérdést, hogy az egész állatok CPZ általi deszenzitizációja reprodukálható-e sejtszinten. Ebből a célból kalcium-képalkotó kísérleteket végeztünk izolált DRG neuronokkal, amelyeket kontroll egerekből és naponta kétszer 7 napig CPZ beöntéssel kezelt állatokból nyertünk. Ezeket az idegsejteket szükségszerűen 16-24 órán át tenyésztésben tartották NGF jelenlétében. A kontroll egerekből összesen 399 neuront, a beöntéssel kezelt egerekből pedig 584 neuront töltöttek be Fura-2-vel, és az AITC, a carvacrol, a CAP és a KCl-ben gazdag oldat által kiváltott kalcium-tranzienseket regisztráltak. Az ezekre a TRPA1 (aitc és karvakrol) és TRPV1 (CAP) agonistákra adott válaszok nem különböztek szignifikánsan a DRG neuronokban a kontrollállatoktól és a beöntéssel kezelt állatoktól (ábra). S1). A TRPA1 mRNS expresszió (qPCR) azonban körülbelül kétszeresére volt szabályozva a lumbosacralis DRG-ben, amelyet közvetlenül a végső CPZ beöntés után készítettek (ábra. S2), míg a TRPA1 expressziójában nem észleltek változást, amikor 24 óra telt el in vivo a végső beöntés után. A TRPV1 mRNS mindkét körülmények között nem változott. Így a TRPA1 gén expressziójának transzkripciós felszabályozása megtörtént, a többszörös CPZ beöntések miatt, de gyorsan megfordult, amikor a CPZ-ellátás megszűnt. DRG tenyésztési körülmények között valószínűleg ugyanaz az epigenetikus megfordulás történt, és az összes maradék CPZ valószínűleg kimosódott, így valójában nem várható maradék deszenzitizáció. Mivel a sejtmodellek nem tükrözték a teljes állatok tartós CPZ-indukálta deszenzitizációját in vivo, a meglepő szisztémás hatás másik erős mutatóját kerestük. A nociceptív neuronok többsége peptidergikus, főleg kalcitonin génhez kapcsolódó peptidet (CGRP) és p (SP)15,17 anyagot expresszál. A depolarizáció során, mint a KCl és a kalcium beáramlása, a feszültségtől függő kalciumcsatornák aktiválása miatt ezek a neuropeptidek kvázi efferens funkcióban (neurogén gyulladás) szabadulnak fel az idegrostokból. Másrészt az aktivált TRP csatornák önmagukban nagyon jó kalciumvezetők, és nem igényelnek semmilyen feszültségfüggő nátrium-vagy kalciumcsatornát a cgrp18 vezikuláris exocitózisának kiváltásához. Így a CGRP stimulált felszabadulása a (peptidergikus) nociceptor aktiváció indexeként szolgálhat. Ugyanezen az alapon a vazoaktív neuropeptidek különféle hatással vannak a gyulladásos folyamatra önmagában a peptiderg szenzoros neuron populáció kimerülése vagy deszenzibilizációja kimutatták,hogy enyhíti a colitis19,20, 21. Annak megállapítására, hogy a CPZ (531 6m) beöntések deszenzitizálódnak-e a TRPA1-en keresztül, lokálisan és szisztémásan, izolált egér vastagbél-és bőrkészítményeket alkalmaztunk. Az egészséges c57bl/6 egerek kettőspontjait (n = 8) CPZ-nek (100 MHz) tették ki, ami masszív CGRP felszabadulást váltott ki (ábra. 5); későbbi alkalmazások AITC (100 db) 5 perc vagy 15 perc után CPZ (ábra. 5A, B) Már nem tudta indukálni a CGRP felszabadulását, ami mély akut funkcionális kereszt-deszenzibilizációra utal a TRPA1 agonistával szemben. Ez a hatás nem lehet a kimerülés következménye, mivel az ezt követő KCl (60 mM) válasz normális volt. Az egerekből származó vastagbéleket, amelyeket ismételten CPZ (531 6m) beöntéssel kezeltek in vivo, naponta kétszer 7 d-re izoláltuk és teszteltük 12-16 órával az utolsó beöntés után. Ebben az állapotban sem a CPZ (100 ~ m), sem az AITC (100 ~ m) nem okozott CGRP felszabadulást (ábra. 5c,D); nevezetesen a CAP (30 nM) által kiváltott CGRP felszabadulást erősen csökkentették, de nem szüntették meg (ábra. 5E). Ezzel szemben a KCl (60 mM) által kiváltott CGRP felszabadulás nem specifikus depolarizációval nemcsak csökkent, hanem a CPZ beöntések után is fokozódott. Ez azt jelezte, hogy a vastagbél idegrostjai nem kimerültek a CGRP-ből, hanem túltelítettek, mégis lényegében tartósan érzéketlenné váltak a TRPA1, valamint a TRPV1 (n = 6) révén történő kémiai aktiválásra. Végül a bőrkészítmény, amelyet az utolsó CPZ-beöntés után 12-16 órával izoláltak, azt mutatta, hogy az AITC (100!) és a CAP (1!) által kiváltott CGRP felszabadulás erősen csökkent a viselkedési tesztekben megfigyelt testszintű deszenzitizációnak megfelelően (ábra. 5F, G, lásd ábra. 4A-F) (n = 6).
a peptiderg szenzoros idegek lokális és szisztémás deszenzitizációja a kapszazepin (CPZ) által, amelyet a kalcitonin génhez kapcsolódó peptid megváltozott felszabadulása jelez (CGR).
(A) akut CGRP felszabadulás a WT egerek izolált vastagbélkészítményeiből, amelyet CPZ indukált (100 ~ m); az ezt követő mustárolaj (aitc, 100 ~ m) expozíció nem indukálja a CGRP felszabadulását, míg a KCL (60 mM) nem specifikus depolarizációja a szokásos módon hatékony. Az adatok eszközök + SEMs (n = 8). (B–D) CPZ (100 6d)- és aitc (100 m)-indukált vastagbél CGRP felszabadulást eltörölték a napi kétszeri CPZ beöntéssel előkezelt egerekben 7 d-ig a felszabadulási kísérlet előtti napig, míg a CAP (1 m) indukált vastagbél CGRP felszabadulást erősen csökkentették, de nem szüntették meg ezekben az egerekben a kontrollokhoz képest. (**P < 0,01, ***P < 0,001, Mann Whitney U-teszt, mindegyik n = 6). (E) hasonlóképpen megszüntették az AITC (100 Ft) által kiváltott CGRP felszabadulást a CPZ beöntéssel előkezelt egerek hátsó lábaiból származó izolált bőrkészítményekben. (F) ezzel szemben a CAP (1!) által indukált CGRP felszabadulás erősen csökkent ezen egerek bőréből a kontrollokhoz képest. (**P < 0,01, ***P < 0,001, Mann Whitney U-teszt, mindegyik n = 6). Megjegyezzük,hogy a DESZENZITIZÁLT CPZ és AITC válaszokat követő összes KCl (60 mM) válasz normális volt (B,C, E), míg a nem teljesen deszenzitizált CAP-stimulált neuron populáció (D,F) KCl válaszai ugyanolyan mértékben csökkentek, mint az összes kontroll kísérletben, ami arra utal, hogy a CGRP raktár kimerülése megakadályozható a CPZ/AITC érzékeny neuron szubpopuláció hatékony deszenzitizációjával.
