vegyületek

ALDH1A1 inhibitorokat írtak le a közelmúltban30. Az LDHA inhibitorokat korábban a Rai et al.29. Az IDH1 inhibitorokat korábban Urban et al. és Davis et al.24,36. A vizsgálatban használt egyéb vegyületek a következők voltak: metotrexát (MedChem Express, HY-14519), Panobinosztát (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Izofagomin (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumakaftor (BioVision #2857) és LY2857785 (Medchem Express, HY12293). A qht-k esetében a mechanizmus kihallgató lemezében (mipe) lévő vegyületeket 11 pontban teszteltük (intraplate, 1:3 hígítási tényező). A 977 kináz inhibitort tartalmazó kináz inhibitor-gyűjteményt 7 pontos dózisokban (interplate, 1:5 hígítási faktor) tesztelték. A DMSO-t minden esetben járműként használták.

klónozás

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Az érdeklődésre számot tartó gének nyitott Olvasókereteit (ORF-eket) klónoztuk az akceptor gerincébe BamHI/EcoRI (N-terminális) vagy NheI/BamHI (C-terminális) helyek segítségével PCR-rel amplifikálva a kódoló régiót infúzióval kompatibilis oligonukleotidokkal, részletesen meghatározva az S1 kiegészítő táblázatban. Az IDH1, LDHA, DHFR, GC és ALDH1A1 konstrukciókat geneart Génszintézissel (ThermoFisher) állítottuk elő pcDNA3.1-ben (+). Az átjáró klónozásához (csak IDH2 konstrukciók esetén) a 86B címkét tartalmazó célvektor jött létre a v5 címke cseréjével a pcDNA3.2-V5/DEST alkalmazásban. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes “LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.

sejttenyészet

HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22rv1, MDA-MB-468 és HT-29 sejteket nyertünk ATCC-ből (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 és HTB-38). A HuCC-T1 és a CC-LP-1 Dr. N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston) kedves ajándékai voltak. A HEK293T sejteket DMEM-ben (4,5 g/L glükóz) tenyésztettük 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS), 6 mM L-glutaminnal, 1 mM-es nátrium-piruváttal, 50 E/mL penicillinnel és 50 GB/mL sztreptomicinnel. Ln18, HT-29, CC-LP-1 és HeLa sejteket tenyésztettünk a fenti táptalajban, nátrium-piruvát nélkül. Az OV-90 sejteket MCDB 105 táptalaj 1:1 arányú keverékében tenyésztettük (Cell Applications Inc.) és M199 táptalaj (HyClone, GE), kiegészítve 15% FBS-sel, 1% Penicillin-sztreptomicinnel (Life Technologies), és végső koncentrációja 1,85 g/L nátrium-hidrogén-karbonát (HyClone, GE). 22rv1, HuCC-T1 és MDA-MB-468 sejteket tenyésztettünk RPMI 1640-ben, kiegészítve 10% FBS-sel, 6 mM L-glutaminnal, 100 egység/mL penicillinnel, 100 ~ g/mL sztreptomicinnel. Az összes sejtet 37 6CC-on tenyésztettük egy 5% CO2-on tartott párásított inkubátorban, és a mycoalert detection kit (Lonza) segítségével a mycoplasma tesztje negatív volt.

rekombináns fehérje-és peptidtermelést és-tisztítást

11S és 86b fehérjéket a GenScript állított elő. A rekombináns 11S fragmentum esetében a kódoló DNS-szekvenciát egy 6x His tag-hez fuzionáltuk, hogy megkönnyítsük a downstream tisztítást, és a szekvenciát E. coli expressziós vektorba szubklónáltuk. A BL21 csillag (DE3) sejteket rekombináns plazmidokkal transzformáltuk, és egyetlen kolóniát oltottunk be IPTG-t tartalmazó LB táptalajba a fehérje expressziójának indukciója céljából. SDS-PAGE és Western blot analízist használtak a kifejezés megfigyelésére és az optimális betakarítási időzítés kiválasztására. A sejteket centrifugálással, a pelleteket pedig szonikációval lizáltuk. A HIS-tag tisztítását követően a frakciókat 0,22 km-es szűrőn keresztül sterilizáltuk. A fehérjéket az SDS-PAGE és a Western blot standard protokollok és egy egér-Anti-His mAb (Genscript, Cat.no.A00186) segítségével elemeztük. a tisztított fehérje koncentrációját Bradford protein assay segítségével határoztuk meg, standardként BSA-val. A fehérjét 1x PBS-ben, 10% glicerinben, pH 7,4-ben tárolták, a tisztaság pedig körülbelül 90% volt, amint azt a coomassie kékkel festett SDS-PAGE gél denzitometriás elemzésével redukáló körülmények között becsülték. A 15 aminosav 86B peptidet ultrapure dH2O-ban tárolták, és a HPLC 99,9% – os tisztaságú volt.

alacsony áteresztőképességű (96-kút PCR lemezek vagy szalagok) cetsa komplementációs vizsgálat

a sejteket 6-kút edényekben transzfektáltuk fordított transzfekciós eljárással, ahol 1,25 ml komplexet (6,25 ~ l Lipofektamin 2000 és 3 ~ G DNS/kút) kombináltunk 1,25 ml HEK293T sejtszuszpenzióval (1 ~ 106 / mL, összesen 1,25 ~ 106 sejt). A CDK9 esetében kútonként 2 GB DNS-t használtunk. 24 óra elteltével (48 óra a CDK9 esetében) a sejteket tripszinizálással gyűjtöttük be, és reszuszpendáltuk 1 db 606 sejt/mL (hacsak másként nem jelezzük) DPB-ket (CaCl2 és MgCl2) plusz 1 g/L glükózt, 1x Halt proteáz inhibitor koktélt (ThermoFisher) és 0,5% DMSO-t tartalmazó cetsa pufferben (DMSO-t nem adtak hozzá olyan kísérletekhez, amelyek későbbi összetett és vivő kezelést kaptak). Hőmérséklet-tartományú kísérletekhez (vegyület vagy egyszeri dózis nélkül) a mintákat alikvotáltuk PCR-csíkokra, csőnként 30 MHz-en. Vegyületet adtunk hozzá, majd a sejteket inkubáltuk 37cccc 1 h. a mintákat ezután melegítjük 3.5 min egy előmelegített termikus cikler, hagyjuk, hogy kiegyenlítődik szobahőmérsékletre, és 6 6% – os 6% – os np40 adunk minden kút. A fagyasztás-olvadás kísérletekhez a csöveket alumínium PCR blokkba helyeztük szárazjég / etanol fürdőn 3 percig, majd 37 perc C hőmérsékleten inkubáltuk 3 percig, örvénylést 3 másodpercig, majd ezeket a lépéseket további három alkalommal megismételtük. 11S-t (GenScript) és furimazin szubsztrátot (Nano-Glo Luciferase Assay System, Promega) adtunk hozzá, 100 nM és 0 végső koncentrációban.5x, illetve a mintákat lumineszcencia intenzitással elemeztük tiszta szűrőkkel felszerelt ViewLux nagy áteresztőképességű CCD képalkotóval (Perkin Elmer).

384-well cetsa assay

a sejteket t75 lombikokban transzfektáltuk reverz transzfekciós eljárással, ahol 9 mL komplexet (45 ~ ~ L Lipofektamin 2000 és 22,5 ~ ~ g DNS) kombináltunk 10 mL hek293t sejtszuszpenzióval (1 ~ ~ 106 sejt/mL, összesen 10 millió sejt). 24 óra elteltével a sejteket tripszinizálással gyűjtöttük be, reszuszpendáltuk 1 606 sejt/ml-en a fent leírtak szerint, majd (15 6 sejt/kút) 384 lyukú PCR-lemezre (Roche) adagoltuk egy Multidrop Combi (ThermoFisher) segítségével. A vegyületeket (63 nL) vagy a DMSO járművezérlést (63 nL) ezt követően TŰSZERSZÁMMAL (GNF) rögzítettük, és 1 órán át inkubáltuk 37 db C-on.a lemezeket a megadott hőmérsékleten 3,5 percig melegítettük, majd AB qPCR géppel (Roche) 25 db C/S-RA hűtöttük, a fűtési fázishoz 1,5 db C / sec rámpasebességgel, a hűtési fázishoz pedig maximális rámpasebességgel. Kútonként három 6% – os np40-es 60 ml-t adtunk hozzá, és 30 percig inkubáltuk, hogy lehetővé tegyük a sejtlízist, amelyet 11S és furimazin szubsztrát hozzáadása követ (sorrendben 100 nM és 0,5 x végső koncentrációban). A mintákat lumineszcencia-intenzitás szempontjából elemeztük ViewLux olvasó segítségével.

1536-kút CETSA vizsgálat

a sejteket transzfektáltuk és a fentiek szerint betakarítottuk (384-kút protokoll). A sejteket 1536 lyukú fehér lemezekre (Aurora, ciklikus olefin polimer, cat# EWB041000A) osztottuk ki (5db sejt/kút) Multidrop kombi alkalmazásával. A vegyületeket (23 nL) ezután tűszúró szerszámmal (Wako automatizálás) rögzítettük, és 1 órán át inkubáltuk 37 oc-n.a lemezeket a megadott hőmérsékleten és időben melegítettük egy fűtőblokk segítségével (lásd alább), majd 25 oC-ra hűtöttük. kútonként egy 6% – os np40-es egy OC-t, és a lemezeket 30 percig inkubáltuk a sejtlízis lehetővé tétele érdekében, majd 3 oc-11S (végső koncentráció 100 nM) és furimazin szubsztrát hozzáadásával. A lemezeket centrifugáltuk és elemeztük a lumineszcencia intenzitását egy ViewLux olvasó segítségével. Az LDHA és CDK9 képernyők esetében a végső koncentráció 0,5 X és 0.25x furimazint használtunk. A normalizálási vezérlők közé tartoznak a DMSO és a GSK2837808A kezelt minták, illetve az LDHA és a CDK9 nem fűtött mintái. A CDK9 ellenképernyőt a fentiek szerint végeztük, a következő különbségekkel: 5 db át nem fertőzött hek293t sejtet (1 db 606/mL cetsa pufferben) adagoltunk 1536 lyukú lemezekbe, majd vegyületet adtunk hozzá, 37 db C inkubációs, hevítési és lízislépést a fentiek szerint. Ezt követően 500 pM (final) 86b-t adtunk a kutakhoz, majd 100 nM 11S-t és 0,25 X furimazin szubsztrátot (final) adtunk hozzá.

az 1536 lyukú lemez fűtésére szolgáló alumínium blokkot egy lemez mérésével tervezték, hogy meghatározzák az X és Y öntött erősítő bordákkal határolt terület méreteit, és az alsó kútfelületet és az alsó peremet Z-ben.ezután egy 6061 T6 alumíniumlemezből megmunkálandó blokkot öntöttek, amely szabadon illeszkedne, körülbelül 0,5 mm hézaggal a lemez számára minden tengelyen. A blokkot kézi függőleges marógéppel, végmarókkal és homlokmaróval dolgozták fel. A kemencefűtési kísérletekhez a lemezeket a konvekciós laboratóriumi sütő (ThermoFisher) középső állványába helyezték, és fém fedéllel borították a párolgás minimalizálása érdekében.

cetsa a sejtlizátumokban

a sejteket cetsa pufferben gyűjtöttük össze 1,0 (106) sejt/mL-nél (a fentiek szerint), és az NP40-et 0,4% – os végső koncentrációhoz adtuk. Miután a mintákat 30 percig (szobahőmérsékleten) forgattuk, a lizátumokat centrifugálással tisztítottuk 20 000 kb g-on 10 percig (4 oC). A tisztított lizátumhoz kofaktort (pl. NAD+) adtunk. A hőmérsékletre adott reakciókísérletekhez 25 ml lizátumot vittünk át PCR csövekbe, majd 3,5 percig hevítettük különböző hőmérsékletekre. Izotermikus dózis-válasz kísérletekhez 5 ml tisztított lizátumot adagoltunk 1536 kútlemezre egy BioRAPTR FRD munkaállomás segítségével, és a mintákat alumínium tömbön hevítettük. A mintákat hagyjuk szobahőmérsékletre egyensúlyozni, és szubsztrátot adunk hozzá (végső koncentráció: 100 nM 11S, 0,5 X furimazin). A lumineszcenciát ViewLux képalkotóval rögzítettük a fent vázoltak szerint.

Western blot

a mintákat az alacsony áteresztőképességű komplementációs vizsgálati szakaszban leírtak szerint dolgoztuk fel, fagyasztás-olvadás ciklusok alkalmazásával a lízishez. A lizátumokat 15 200 g-on centrifugáltuk 20 percen át 4 C-on. a mintákat 4-12%-os Bis-Tris NuPAGE gélen (ThermoFisher) futtattuk MOPS puffer segítségével, majd egy PVDF membránra vittük egy IBLOT 2 átviteli rendszer segítségével 25 V-on 7 percig. A membránokat 5%-os tejoldattal blokkoltuk (50 mM-es Tris HCl, pH6; 150 mM-es NaCl; 0,1% Tween-20), és a primer antitesteket egy éjszakán át inkubáltuk 4CC-n blokkoló oldatban. Antitestek voltak: anti-IDH1 (, sejtjelzés # 8137, 1:500), anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, sejtjelzés #3582, 1: 1000). Anti-nyúl / egér-HRP (nyúl = sejtjelzés 7074; egér = sejtjelzés # 7076) 1:2500-on adtuk hozzá, és szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. Kemilumineszcens jelet generáltunk a Supersignal west dura oldattal (ThermoFisher), és biorad Chemidoc rendszerrel rögzítettük. A denzitometriás elemzést Photoshop szoftver (Adobe) segítségével végeztük.

2-HG vizsgálat

HEK293T sejtek fordított transzfektált 24 jól edények hozzáadásával 2.5 db 105 dB sejt transzfekciós komplexre (0,75 ml plazmid DNS, 1,5 ml Lipofektamin 2000). A sejttenyésztő táptalajt 72 óra elteltével gyűjtöttük össze,majd 15 684 lyukú átlátszatlan lemezre helyeztük át. Mindegyik kúthoz 1,5 660 mm-es HCL-t adtunk, majd a mintákat szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. Minden kúthoz 1,5 db 720 mM-es tris-HCl bázist adtunk. Ezután 52 db 2-HG detektáló oldat (100 mm HEPES (pH 8,0), 100 db nad + , 1 ~ g/mL aktív rekombináns D-2-hidroxi-Glutarát-dehidrogenáz (D2HGDH; Biovision, Cat: P1001), 5 db resazurin, 0,03 mg / mL diaphoráz (Sigma, Cat: D5540), majd a lemezt szobahőmérsékleten inkubáltuk. 2 HG-os standard görbét készítettünk 100 mM-es HEPESBEN (pH 8,0). A fluoreszcenciát ViewLux olvasón mértük Ex: 525, Em: 598/25 szűrőkkel.

biokémiai vizsgálatok

az LDHA biokémiai vizsgálatot a korábban leírtak szerint végeztük29. Röviden, 3 db humán laktát-dehidrogenáz 5 (2 nM végleges) (no. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) LDH vizsgálat során puffert (200 mM-es Tris HCl, pH 7,4, 100 Ft EDTA és 0,01% Tween-20) adtunk egy fekete szilárd alsó 1536-kút vizsgálati lemezhez (Greiner Bio-One). A vegyület pin-transzferjét (23 nL) követően 1 db 0,06 mM final (NADH) és 0,2 mM final (Sigma-Aldrich) nátrium-piruvát (Sigma-Aldrich) tartalmú szubsztrátoldatot adagoltunk a reakció elindításához. 5 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után minden egyes lyukba 1 ml detektáló reagenst adtunk. A lemezeket azonnal átvittük egy ViewLux leolvasóba, és az ebből eredő rezorufin fluoreszcenciát (ex 540 nm, em 590 nm) 0 és 10 perc alatt mértük. A fluoreszcenciát enzimmentes és DMSO-val kezelt kontroll kutakkal normalizáltuk minden lemezen.

az ALDH1A1 biokémiai vizsgálatot címkézetlen fehérje felhasználásával a korábban leírtak szerint végeztük el31,37. Röviden, 3 db 20 nM-es tisztított humán ALDH1A1-et vizsgálati pufferben (100 mM HEPES pH 7,5, 0,01% Tween 20) adagoltunk egy 1536-kút szilárd fenekű fekete lemezbe (Greiner Bio One). Huszonhárom NL vegyület vagy 11-7085 vezérlőrekesz került át pin tool (Wako Automation) segítségével. A mintákat 15 percen át inkubáltuk (szobahőmérsékleten, fénytől védve), majd nad + – t és Propionaldehidet (1 mm-es, illetve 80 km-es végkoncentráció) adtunk a szubsztrátumhoz. A lemezeket centrifugáltuk és kinetikus üzemmódban olvastuk egy 340 nm-es gerjesztésű, 450 nm-es emissziós szűrővel ellátott ViewLux képalkotón 5 percig. A fluoreszcencia intenzitásának változása az 5 perc alatt enzimmentes és DMSO-val kezelt kontroll kutak segítségével normalizálódott minden lemezen.

a CDK9/cyclin K TR-FRET Lanthascreen Eu kináz kötési vizsgálatát a Thermofishertől vásárolták meg, és a gyártó utasításai szerint végezték el. Röviden, 4 nm cdk9/Cyclin K (Invitrogén #PV4335), 2 nM biotin Anti-His Ab, 2 nM Eu-sztreptavidin és 10 nM kináz Tracer 236 oldat 1x kináz pufferben egy BioRAPTR FRD munkaállomás segítségével Greiner 1,536-kút fehér közegkötő lemezekbe adagoltuk. Huszonhárom nL vegyületet és kontrollt (DMSO és LY2857785 végkoncentráció 6 MHz-en) azonnal a vizsgálati lemezekre szállítottak pin szerszámátvitel útján. A lemezeket szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk, majd ezt követően a TR-FRET fluoreszcenciát PerkinElmer EnVision Multilabel lemezolvasóval mértük (pl.: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; késleltetési idő 100 db; integrációs idő 200 db).

Laktáttermelési vizsgálat

HEK293T sejteket tenyésztettünk a fent leírtak szerint. A sejteket PBS-sel öblítettük, tripszinizáltuk és fenolvörös mentes DMEM-ben (Life Technologies) reszuszpendáltuk kiegészítők nélkül. A cellákat azonnal 1536 lyukú fekete, tiszta fenéklemezekre (Corning) vontuk be, 250 cellánként kútonként, 4 hektoliter térfogatban. Vegyületet vagy vivőanyagot vezettünk a kutakhoz tűszerszám-transzferrel, és a sejteket 37cc-n inkubáltuk 1 órán át. két ca-ll Laktát reakcióelegyet (Biovision K607-100) adtunk minden kúthoz, és a lemezeket lefedtük és szobahőmérsékleten inkubáltuk 30 percig. A fluoreszcenciát Ex / Em 528/598 nm szűrőkkel felszerelt viewlux mikrolemezes képalkotóval mértük.

Aldefluor assay

a 86B-vel jelölt ALDH1A1 aktivitás kezdeti meghatározásához a sejteket reverz transzfekciós eljárással transzfekcionáltuk, ahol 1 mL komplexet (6 ~ ~ l Lipofektamin 2000 és 3 ~ ~ G DNS) kombináltunk 1 mL LN18 sejt szuszpenzióval (5 ~ ~ 105/mL) és 100 ~ ~ l/kút keveréket fekete, átlátszó alsó 96 lyukú lemezekbe (Corning) adagoltunk. 24 óra elteltével a tápközeget eltávolítottuk, és 100 MHz/kút Aldefluor pufferrel (STEMCELL Technologies) helyettesítettük, amely BAAA szubsztrátot és Hoechst 33342-t tartalmazott (ThermoFisher, végső koncentrációja 500 nM, illetve 0,5 nM). Ezt követően hozzáadtuk a jármű DMSO – ját vagy DEAB-ját (1 6m végleges), majd a lemezeket 30 percig inkubáltuk 37 Kb-on, hogy lehetővé tegyük a BAAA átalakítását BAA-vá. A sejteket megmossuk, és 100 ml/kút Aldefluor puffert adagolunk a képalkotás előtt a 2200-as cellában (GE Healthcare). Nagy áteresztőképességű vizsgálatokhoz az LN18 sejteket t75 lombikokban transzfektáltuk fordított transzfekciós eljárással, amint azt a nagy áteresztőképességű HEK293T CETSA vizsgálatokhoz fentebb leírtuk. 16 óra elteltével a sejteket begyűjtöttük, és bevonjuk (1000 sejt/kút/5 ~ l) fekete, optikai minőségű, tiszta aljú, TC-vel kezelt 1536 lyukú lemezekre (Aurora mikrolemezek) egy Multidrop kombi adagolóval, majd egy éjszakán át inkubáljuk 37 ~ C-on.a nagy mennyiségű Aldefluor-vizsgálatot ezt követően transzfektált LN18 sejteken vagy nem transzfektált OV-90-en végeztük, amint azt korábban leírtuk31. A képeket az In Cell Investigator v1.6.2 elemző szoftver konzerv többcélú elemzési algoritmusa (GE Healthcare) segítségével elemeztük a leírtak szerint.

membrán hőintegritási vizsgálat

30 000 HEK293T sejtet állítottunk elő 30 6x proteáz inhibitor koktélt tartalmazó cetsa pufferben (ThermoFisher) kiegészítve 0,5% DMSO-val (összesen 1,5% DMSO). A DMSO tolerancia kísérlethez a DMSO-t 0, 1, 2 vagy 3% – ban adták a DPBS-hez. A sejtszuszpenziókat 3,5 percig melegítettük 42-74-en kb, 4 fokos intervallumok alkalmazásával, majd nedves jégen alumínium tömbre távolítottuk el. A sejtszuszpenziókat egyenlő rész Trippankékkel (LONZA) ( = 0,2% trippankékkel) keverték össze, és azonnal megszámolták egy C-chip hemocitométerrel (iNCyto, Korea). A tripán pozitív (permeabilizált) és negatív (intakt) volt, n = 2 minden hőmérsékleten. További sejtvonalakhoz egymillió sejtet állítottunk elő 100 6% DMSO-t tartalmazó fenolvörös szabad DMEM-ben. A cellákat 3 percig melegítettük 42 nak nek 90 kb 4 fokos időközönként, majd nedves jégen alumínium tömbre távolítottuk el. A membrán integritását a fent leírtak szerint értékeltük.

PAMPA

a keverés kettős mosogató PAMPA módszer szabadalmaztatott pION Inc. (Billerica, MA)a vegyület permeabilitásának mérésére a korábban leírtak szerint38. A vegyületeket donor – és akceptoroldatokkal hígítottuk PH7, 4-re, és a DMSO-koncentráció 0, 5% volt. A permeabilitási számításokat a Pion Inc. szoftver.

qHTS analízis

Az egyes vizsgálatok adatait lemezenként normalizáltuk a megfelelő kontrollokhoz az előzőek szerint39. Ugyanezeket a kontrollokat használták a Z’ tényező kiszámításához is minden egyes vizsgálat esetében. A százalékos aktivitást házon belüli szoftver segítségével származtattuk (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Az összes koncentráció–válasz görbét illesztettük, az AC50-et pedig a GraphPad Prism szoftverrel számítottuk ki; a görbéket a korábban leírtak szerint osztályoztuk27. A görbe alatti területet (AUC) a trapéz alakú szabály segítségével számítottuk ki a válaszgörbe és az x tengely közötti terület közelítésére a koncentrációtartományban. Ekvivalens koncentrációtartományokat használtunk egy kísérletben az összes vegyületre. Az aktív vegyületek osztályozásához a (vivőanyag-kontroll átlagától számított) hatásossági határértéket (3!) alkalmazták.