absztrakt
a kloramfenikol (CL-ELISA) kozmetikai termékekben történő monitorozására közvetlen és nagyon specifikus kemilumineszcens enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatot (CL-Elisa) fejlesztettek ki. Az ebben a munkában a közvetlen immunvizsgálathoz alkalmazott anti-kloramfenikol antitest (MAB) specifikusan kötődhet a CAP-hoz, elhanyagolható keresztreaktivitással (CR) (kevesebb, mint 0,01%) a legtöbb CAP-analóg esetében, beleértve a szerkezetileg rokon tiamfenikolt (TAP) és a florfenikolt (FF). Az ic10 által mért kimutatási határ (LOD) 0,0021 ng mL−1 volt. A kimutatási tartomány (IC20-IC80) 0,00979 és 0,12026 ng mL−1 között volt. A tüskés kozmetikai mintákban az átlagos visszanyerés 82,7% és 99,6% között mozgott, a napközbeni és a napközbeni eltérés kevesebb, mint 9,8, illetve 8,2% volt. Ezenkívül a HRP-vel jelölt anti-CAP mAb segítségével a módszer gyors közvetlen immunreakciós módban dolgozható fel. Ez a CL-ELISA módszer alkalmazható a Cap specifikus, gyors, szemikvantitatív és mennyiségi kimutatására a kozmetikumokban, megkönnyítve a CAP-szennyeződés pontos minőségellenőrzését.
1. Bevezetés
a kloramfenikol (CAP) az amfenikol antibakteriális szerek családjának tagja, amelyet Venezuelai streptococcus termelt (szerkezet az 1 .ábrán látható). A kloramfenikolt általában széles spektrumú antibiotikumként hajtják végre, hatékony antimikrobiális aktivitással. Általában a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok elterjedése ellen, beleértve az anaerob organizmusokat is . A magas aktivitás miatt a kloramfenikolt széles körben alkalmazzák az állatállományban, az aquiculture-ben és a kozmetikai iparban a bakteriális fertőzések megelőzésére és kezelésére. A közelmúltban megjelent publikációk szerint a kloramfenikolt epifolliculitis, akne és egyéb bőrbetegségek kezelésére használják. A kloramfenikolt a kozmetikumokban is széles körben alkalmazták antiszeptikumként a mikroorganizmusok növekedésének gátlására .
a CAP, a TAP és az FF kémiai szerkezete.
a legújabb vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy az amfenikol antibiotikumok potenciális káros hatásokat mutattak az emberi egészségre . Ezért a kloramfenikol alkalmazását számos országban tiltják, beleértve az EU-tagokat, az USA-t és Kínát . Bár ezekre az antibiotikumokra hivatalos előírások vonatkoznak, a kloramfenikolt még mindig illegálisan adják a kozmetikumokhoz, alacsony költsége és kiváló antibakteriális hatása miatt. A kozmetikumok biztonságának biztosítása és az emberi egészség megőrzése érdekében fontos, hogy érzékeny, megbízható és rendelkezésre álló módszereket fejlesszenek ki a kloramfenikol kimutatására a kozmetikai minták nyomonkövetési szintjein.
számos analitikai módszert jelentettek a CAP és a kapcsolódó antibiotikumok kimutatására, mint például a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) , a gázkromatográfia (GC) és a folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometria (LC-MS/MS) . Ezek a módszerek azonban elsősorban drága műszereket, bonyolult előkezelési eljárásokat és jól képzett személyzetet igényelnek, és nem voltak alkalmasak nagyszámú minta gyors szűrésére. Elsősorban antitest-antigén specifikus felismerésen alapuló immunvizsgálatokat alkalmaztak a célelemzők nagy áteresztőképességű és gyors szűrésére. Nagy érzékenységű kemilumineszcens szubsztrát alkalmazható közvetlen kemilumineszcens enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (CL-ELISA) platformon. A hagyományos kolorimetriás protokollokhoz képest az immunvizsgálatok érzékenysége legalább 2~3-szor javítható kemilumineszcens szubsztrátként.
a CAP immunoassay kimutatásáról szóló korábbi szakirodalmak nem tudják megkülönböztetni a CAP-ot az amfenikol család analógjaitól (1 .ábra), beleértve a tiamfenikolt (TAP) és a florfenikolt (FF), a magas széles specifikus antitestek miatt. Ezekben a kutatásokban, nehéz meghatározni, hogy a szennyeződés sapka, analógjai, vagy összege őket, ha pozitív eredményt. Ebben a kutatásban egy magas specifikus anti-CAP monoklonális antitestet (mAb) alkalmaztunk, amely a legtöbb vizsgált analóg esetében képes kötődni a CAP specificitáshoz és elhanyagolható CR értékekhez. Ennek a mAb-nak az alapján egy nagyon specifikus és közvetlen CL-ELISA módszert fejlesztettek ki a kozmetikumokban található CAP nyomnyi mennyiségének meghatározására. Ez a kifejlesztett protokoll nem igényel komplex közvetett konjugációs reakciót HRP-vel jelölt másodlagos antitesttel. Kemilumineszcens szubsztráttal az érzékenység jelentősen javítható (a 2.ábrán látható sematikus ábra). HRP-vel jelölt anti-CAP mAb alkalmazásával a vizsgálatot gyors közvetlen immunreakciós módban végeztük komplex immunreakciós eljárások nélkül. Ez a CL-ELISA módszer alkalmazható a CAP specifikus, gyors, szemikvantitatív és mennyiségi kimutatására a kozmetikumokban, és ez a munka hozzájárul a CAP minőségellenőrzéséhez és szabályozásához.
a CL-ELISA módszer vázlata.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Vegyszerek és reagensek
kloramfenikol (CAP), ciprofloxacin (CIP), florfenikol, (FF), penicillin (PEN), ractopamin (RAC), szalbutamol (SAL), szulfadiazin (SUL) és tiamfenikol (tap) szabványokat a Sigma Aldrich-től vásárolták (99% – os tisztaságú, St. Louis, MO, USA). CAP-konjugált antigént és HRP-vel jelölt CAP antitestet a ZeYang Co. (Peking, Kína). A SuperSignal kemilumineszcens szubsztrát oldatot a Thermo Fishertől (USA) vásárolták. Milli-Q szintézis rendszert nyertünk Millipore (Bedford, MA, USA) víztisztításhoz. Más reagenseket (analitikai minőségű) a Beijing Reagent Corp. – tól (Peking, Kína) vásároltak.
2.2. Berendezések és műszerek
Costar fehér átlátszatlan 96 lyukú polisztirol mikrotiter lemezek (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) használták ebben a munkában. A SpectraMax M5 mikrolemez-olvasót molekuláris eszközökből nyertük (CA, USA). A MIKRO 22R centrifugát a Hettich Laborapparate-től (Tuttlingen, Németország) nyerték.
2.3. Pufferek és oldatok
ehhez a kifejlesztett CL-ELISA vizsgálathoz különböző puffereket és oldatokat készítettek az immunvizsgálathoz.
Foszfátpuffer sóoldatot (PBS, 0,01 M, pH 7,4): 8,0 g NaCl-t, 2,9 g Na2HPO4-t, 0,2 g KH2PO4-et és 0,2 g KCl-t oldottunk 1 liter ionmentesített vízben.
blokkoló puffer (pH 7,4): 0,5% kazein 0,01 M PBS-ben.
bevonó puffer (pH 9,6): 1,59 g Na2CO3-t és 2,93 g NaHCO3-t oldottunk 1 liter ionmentesített vízben.
Enzimhígító puffer (pH 7,4): 5% magzati szarvasmarha szérum 0,01 M PBS-ben.
Mosópuffer( PBST): 0,01% Tween-20 0,01 M PBS-ben.
2.4. Kompetitív kemilumineszcens ELISA (CL-ELISA) eljárás
Costar fehér átlátszatlan 96-lyukú polisztirol mikrotiter lemezeket fogadtunk el immunoassay reakció. 100 ml CAP-konjugált antigént oldottunk a bevonó pufferben 0,00042 ng mL−1 végső koncentrációban, amelyet hozzáadtunk, és a bevonáshoz 4-20 órán át inkubáltunk. Mosás után a mosópuffer háromszor, blokkoló puffer (150 Ft / kút) adunk minden kút, és inkubáljuk, hogy elfoglalja a felesleges aktív helyek 37 Ft / 1,5 h. a bevont lemezeket tároltuk 4 ft / óra használat előtt.
a CAP analízishez a bevont mikrotiterlemezeket szobahőmérsékleten 30 percig előkondicionáltuk. Ezután egymás után 30 db feldolgozott mintát vagy CAP standardot, valamint 70 db HRP-vel jelölt anti-CAP antitestet (2,46 ng mL−1) adtunk enzimhígító pufferrel hígítva. A lemezeket 37cc-n inkubáltuk 30 percig a közvetlen versenyképes reakció érdekében. A lemez mosópufferrel történő ötszörös mosása után Szupersignal kemilumineszcens szubsztrátoldatot (100 MHz/kút) adtunk hozzá, és minden kút kemilumineszcencia intenzitását SpectraMax M5 mikrolemez olvasóval mértük.
2, 5. Standard görbe
tíz különböző koncentrációs szintet teszteltünk a kalibrációs görbék értékeléséhez. A legmagasabb koncentráció 1000 ng mL-1 volt, és a következő koncentrációkat sorozatosan hígítottuk az előző egyharmadával. Minden koncentrációt háromszor futtattunk a CL-ELISA protokoll szerint.
B/B0 az eredmények kemilumineszcencia arányára van meghatározva. Itt, a B a különböző CAP standard koncentráció kemilumineszcencia intenzitását jelenti, a B0 pedig a Cap standard nélküli kemilumineszcencia intenzitását jelenti minden tesztben.
a Standard görbéket úgy értékeltük, hogy a B/B0-t különböző CAP standard koncentrációban ábrázoltuk, és az adatokat a következő Négyparaméteres logisztikai egyenlethez illesztettük az Origin használatával (7.5 verzió, OriginLab, Northampton, MA, USA):ebben az egyenletben az a a felső aszimptotát jelenti (B/B0 kemilumineszcencia Arány CAP standard nélkül). B a görbe lejtése az inflexiós ponton. C, amely a maximális abszorbancia 50% – át képviseli, az inflexiós pont X értéke. D pedig az alsó aszimptota (háttérjel).
2.6. A minta előkészítése CL-ELISA analízishez
a kozmetikai mintákat (2,00 g 0,02 g) pontosan lemértük, és 50 mL-es polipropilén centrifugacsőbe helyeztük. Ezután 20 mL PBS-t adtunk hozzá és örvényesítettünk 30 másodpercig, majd ultra-szonikációt 3 percig a CAP kivonásához. Mindegyik mintát 12000 g-on 10 percen át centrifugáltuk 4 6CC-n, majd a felülúszót összegyűjtöttük és egy 0,22 mm-es membránon átszűrtük. Mindegyik minta felülúszójának harminc mikroliter alikvotját adtuk egy bevont 96 lyukú lemezhez elemzés céljából a kifejlesztett CL-ELISA eljárás szerint.
2.7. Pontosság és pontosság
a negatív alapozó krém kozmetikai mintákat korábban UPLC-MS / MS elemzésekkel igazolták. Ezután minden mintát három különböző koncentrációban (5, 20 és 100 ng L−1) cap standarddal töltöttünk. Az elemzést a kifejlesztett CL-ELISA protokoll szerint dolgoztuk fel, mindegyik öt ismétléssel (n = 5). A minták koncentrációját a kalibrációs görbe alapján számítottuk ki, a pontosságot és a pontosságot pedig az összes minta visszanyerése alapján értékeltük.
3. Eredmények és vita
3.1. Vizsgálati specificitás
a módszer specificitását a keresztreaktivitás (CR) mértékének értékelésével értékelték a CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL és TAP szerkezetileg rokon vegyületekkel. A CR értékeket a következő egyenlettel értékeltük:Ebben az egyenletben az IC50 az anyag fél maximális gátló koncentrációja. Az anti-CAP MAB specificitási eredményeit az 1.táblázat mutatja. Az eredményekből elhanyagolható CR-értékeket (kevesebb, mint 0,01%) kaptunk az összes vizsgált analógra vonatkozóan, beleértve a leginkább struktúrához kapcsolódó TAP-ot és FF-et. Megállapítható, hogy ez a kifejlesztett CL-ELISA vizsgálat alkalmazható a CAP specifikus kimutatására.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. A CL-ELISA eljárás optimalizálása
az antigén / antitest Arány versenyképes reakciórendszerben jelentősen befolyásolja az immunreakciót. Ebben a CL-ELISA protokollban az antigén / antitest arányt értékelték és optimalizálták. Antigén / antitest arány 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, és 30: 70-et vizsgáltak. Az eredményeket az IC50 és az RLUmax (maximális relatív fényegységek) szerint optimalizáltuk, és a 2.táblázatban mutattuk be. Az IC50 érték jelentősen nőtt az antitest arány növekedésével. Amikor az antigén / antitest arány 70:30 volt, a legérzékenyebb eredményt a legalacsonyabb IC50 értékkel kaptuk. Ezenkívül az antitest magas aránya magas RLUmax értéket eredményezett. A vizsgált antigén / antitest Arány esetében azonban az összes RLU érték alkalmas volt a CAP kimutatására. A kemilumineszcens szubsztrát nagy érzékenysége miatt nem volt nyilvánvaló különbség a RLUmax értékében. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.
|
|||||||||||||||||||||||||||
3.3. Érzékenység
IC50, LOD (ic10 méréssel), valamint a detektálási tartományt (IC20−IC80) a szigmoidális kalibrációs görbéből kaptuk a javasolt CL-ELISA protokoll érzékenységének értékelésére (3.ábra). Ebben a kutatásban a LOD 0,0021 ng mL−1 volt, míg az IC50 érték 0,016 ng mL−1 volt a CAP esetében. Ennek a módszernek a kimutatási tartománya 0,00979−0,12026 ng mL-1 volt. A bevett immunvizsgálatokkal összehasonlítva ez a módszer nagyobb érzékenységet és alacsonyabb LOD-t mutatott a CAP esetében .
a CL-ELISA-ból az optimalizált körülmények között létrehozott CAP Standard görbéje.
3.4. Pontosság és pontosság
a pontosság és precizitás vizsgálatához először a dúsított mintákban a CAP visszanyerését számítottuk ki. A pontosságot és a pontosságot öt ismétléssel értékelték három validációs napon. Három dúsított 5, 20 és 100 ng L−1-es szintnél a Cap átlagos visszanyerése a tüskés alapozó krém kozmetikai mintákban 82,7% és 99,6% között mozgott. A napközbeni és a napközbeni variáció kisebb volt, mint 9,8%, illetve 8,2% (az eredményeket a 3.táblázat mutatja).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Következtetések
ebben a kutatásban egy új és rendkívül érzékeny CL-ELISA módszert fejlesztettek ki a kozmetikai sapkák kimutatására. A vizsgálatban alkalmazott mAb nagy specificitást mutatott a CAP-ra, analógjaihoz képest elhanyagolható CR-értékekkel, különösen a legtöbb szerkezettel kapcsolatos TAP és FF esetében. Ezen mAb alapján a javasolt CL-ELISA módszer kifejezetten a CAP és más analógok keverékei helyett alkalmazható lenne a CAP kimutatására. Ez az első jelentés a CL-ELISA-ról a kozmetikumok sapkájának meghatározására. A LOD módszer 0,0021 ng mL−1, IC50 0,016 ng mL−1, a kimutatási tartomány pedig 0,00979−0,12026 ng mL−1 volt. A tüskés kozmetikai mintákban az átlagos visszanyerés 82,7% és 99,6% között mozgott, a napközbeni és a napközbeni eltérés kevesebb, mint 9,8%, illetve 8,2% volt. A vizsgálat a magas specificitás, az egyszerűség, a gyors elemzési idő és a költséghatékonyság előnyeit kínálja. Érzékenységét és specifitását tekintve a kifejlesztett CL-ELISA módszer jobb, mint a legtöbb jelentett immunvizsgálat a CAP kimutatására. Megállapítható, hogy ez a kifejlesztett CL-ELISA módszer alkalmazható a CAP specifikus, gyors, szemikvantitatív és mennyiségi kimutatására a kozmetikumokban.
az adatok rendelkezésre állása
a tanulmány megállapításainak alátámasztására használt adatok kérésre rendelkezésre állnak a megfelelő szerzőtől.
összeférhetetlenség
a szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenség a cikk közzétételével kapcsolatban.
Köszönetnyilvánítás
szeretnénk megköszönni LetPub (www.letpub.com) nyelvi segítséget nyújt a kézirat elkészítése során. Ezt a munkát támogatta a Nemzeti R&D Key Program Kína (no. 2017yfe0110800), a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (no. 31871718), és az EU Horizon 2020 kutatási és Innovációs akció (no. 727864-EU-China-Safe).
