esettanulmány: a feszültségtől függő nátriumcsatornák inhibitorainak felfedezése

a fent vázolt ioncsatorna-gyógyszerfelfedezéssel kapcsolatos kérdések szemléltetésének módjaként a cikk további része egy esettanulmányt ír le, amely a feszültségtől függő nátriumcsatorna-gátlók azonosítására összpontosít krónikus neuropátiás fájdalom kezelésére. A fájdalom kezelése komoly orvosi kérdés, és a gyógyszeriparban nagy erőfeszítéseket tesznek ennek az állapotnak az új terápiáinak kifejlesztésére. Különösen a neuropátiás fájdalom kezelése, amelyet “a perifériás idegrendszer elsődleges elváltozásából vagy diszfunkciójából eredő krónikus fájdalomként” határoz meg a nemzetközi Fájdalomvizsgálati Szövetség (IASP) továbbra is jelentős kielégítetlen orvosi igény.

egyértelmű, hogy a feszültségfüggő nátrium (Nav1) csatornák kulcsszerepet játszanak a fájdalom jelzéséhez szükséges szenzoros idegi akciós potenciálok keletkezésében és terjedésében. A nem szubtípus-szelektív nátriumcsatorna-blokkolók, például a novokain helyi alkalmazása teljes fájdalomcsillapítást biztosít vezetési blokk. A fájdalomcsillapításnak ez a megközelítése azonban csak nagyon kevés alkalmazásra korlátozódik, például fogászati eljárásokra, mivel a nátriumcsatornák szintén létfontosságúak a szív, a központi idegrendszer, a vázizom és a nonnociceptív szenzoros neuronok vezetésében. A Nav1 super család 10 tagból áll (Yu and Catterall, 2004). Ezen altípusok közül hét (Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 és Nav1.9) van jelen a perifériás idegrendszerben (PNS). Ezek közül a Nav1.7, Nav1.8 és Nav1.9 elsősorban a nociceptív neuronokban és a Nav1-ben expresszálódik.3 túlnyomórészt embrionális, de a felnőtt PNS-ben a sérülés után fel van szabályozva. Ez a korlátozott expressziós minta teszi ezeket az altípusokat vonzó célpontok az új fájdalomcsillapító szerek kifejlesztéséhez. Azonban a fájdalom jelzéséhez, és különösen a neuropátiás fájdalom jelzéséhez való viszonylagos hozzájárulásuk nem egyértelmű, és a fájdalom különböző etiológiájától és érzékszervi tulajdonságaitól függően változhat.

egy Nav1 altípus molekuláris szelektivitásának hiányában lehetőség van a Nav1 csatornák specifikus megcélzására egy adott konformációs állapotban, miközben megőrzik a nátriumcsatorna-függő impulzusvezetést. Ez a fajta állapotfüggő gátlás az alapja a nátriumcsatorna-blokkoló antikonvulzív szerek és antiaritmiás szerek, például a lamotrigin és a lidokain terápiás ablakának. Ezek a gyógyszerek nagyobb affinitással rendelkeznek a nyitott és/vagy inaktivált állapotú csatornákhoz, mint a nyugalmi, zárt csatornákhoz. Ez a gátlási mechanizmus kedvez a gyors tüzelésű vagy részben depolarizált szövetekben való kötődésnek. A neuropátiás fájdalomnak érzékenynek kell lennie erre a gátló mechanizmusra, mivel úgy gondolják, hogy a depolarizáció sérülések által kiváltott területeiből származik, ezt a hipotézist alátámasztja a szubanesztetikus dózisokban szisztémásan beadott lidokain klinikai hatékonysága. Ezenkívül a nem szubtípus-szelektív, állapotfüggő blokk engedheti meg magának a legnagyobb hatékonyságot, mivel a Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 vagy Nav1.9 nem szolgáltatott meggyőző bizonyítékot ezen csatornák bármelyikének domináns szerepére a neuropátiás fájdalom jelátvitelében.

Ezen indoklás alapján döntés született arról, hogy kezdetben nem szubtípusú szelektív, állapotfüggő Nav1 inhibitorokat alkalmaznak, miközben a molekuláris szelektivitást a Nav1.7, Nav1.5 (az elsődleges szív nátriumcsatorna) és Nav1.8 párhuzamos vizsgálatával vizsgálják.

membránpotenciál alapú vizsgálatot alkalmaztak a rekombináns sejtvonalban stabilan expresszált Nav1.8 vegyületeken lévő 200 000 vegyület vizsgálatára. Ez a HTS-vizsgálat fluoreszcencia rezonancia energiaátvitelen (FRET) alapult az Aurora Biosciences által kifejlesztett membránpotenciál–érzékeny festékpár két tagja között (Priest et al., 2004). A Nav1.8 csatornákat extracelluláris nátrium hiányában előinkubáltuk a vizsgált vegyülettel és a kémiai agonista deltametrinnel. A nátrium későbbi hozzáadása membrán depolarizációt eredményezett, és a Nav1 blokkot a celluláris depolarizációs folyamat interferenciájaként határozták meg.

bár a kezdeti képernyőn Nav1.8 sokféle találatot eredményezett, csak egyetlen vegyületet tekintettek életképes ólomnak a Gyógyszerkémiai erőfeszítések során. Mielőtt erőforrásokat kötne ehhez az ólomhoz, a vegyületet, egy diszubsztituált szukcinimidot, amelyet BPBTS-nek (N- {metil}-N’-(2,2′-bithien-5-il metil)szukcinimidnek neveznek, részletesen megvizsgáltuk kézi teljes cellás feszültség bilincs. Megállapították, hogy a BPBTS minden Nav1 altípust hasonló hatékonysággal gátol, és a gátlás a membránpotenciáltól és a stimuláció gyakoriságától függ. Ez a gátló mechanizmus összhangban volt a vegyületnek a nyitott és inaktivált állapotú csatornákhoz való nagyobb affinitásával, összehasonlítva a nyugalmi állapotú csatornákkal. Ezenkívül a bpbts két nagyságrenddel hatásosabb volt, mint a klinikailag alkalmazott antikonvulzív és antiaritmiás Nav1 blokkolók, gátolva a Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 és Nav1.2 inaktivált állapotát, a Ki-értékek 0,09, 0,15, 0,08 és 0,14 GmbH, valamint a nyugalmi állapot Kr-értékei 1,5, 1,3, 0,3 és 1,2 6m (Priest et al., 2004).

mint ilyen, a BPBTS vonzó vezető szerepet játszott a gyógyszerkémia számára; fő felelőssége a gyenge farmakokinetikai profil. A bpbt–k analógjainak, valamint a közzétett Nav1-inhibitorok profilozása során a membránpotenciál-alapú fluoreszcens szűrővizsgálat alkalmazásával néhány vegyület esetében a fluoreszcens vizsgálatban és az elektrofiziológiában meghatározott potenciálok közötti szerkezet-alapú eltéréseket figyeltek meg. Ezek az eltérések a vegyületek és a Nav1.7 csatornák megnyitásához használt veratridin agonista közötti kölcsönhatásra vezethetők vissza. Ezt követően a fluoreszcens vizsgálatot úgy módosítottuk, hogy a Nav1 csatornákat fiziológiás extracelluláris nátriumkoncentrációban előzetesen inkubáltuk a tesztvegyülettel, és a Nav1-függő depolarizációt agonista addícióval indítottuk el (ábra. 1). Az ebben a módosított vizsgálatban mért csatornagátló potencia nagyon jól korrelált az elektrofiziológia által meghatározott inaktivált állapotgátlással a Nav1 inhibitorok számos szerkezeti osztályában (Felix et al., 2004; Liu et al., 2006).

bár a BPBT-k analógjai hatásosságukban nem haladták meg a kezdeti ólmot, a gyógyszerkémia sikeresen javította a farmakokinetikai profilt, végül transz-N-{metil }-N-metil-n’-ciklopentán-1,2-dikarboxamid (CDA54) 44% – os orális biohasznosulással, egy órás felezési idővel és 14 ml/perc/kg clearance-szel, amelyet in vivo alaposan profiloztak (Brochu et al., 2006). A neuropátiás fájdalom két patkánymodelljében a CDA54 (10 mg/kg, szájon át adva) jelentősen csökkentette az idegkárosodás által kiváltott viselkedési túlérzékenységet 44-67%–kal. A CDA54 azonos dózisa / plazmakoncentrációja nem befolyásolta az akut nocicepciót (patkány főzőlap-vizsgálat), a motoros koordinációt (patkány rotorod-vizsgálat) vagy a szívvezetést (kardiovaszkuláris kutyában mért elektrofiziológiai paraméterek). Ezek a tulajdonságok ellentétben állnak a klinikán alkalmazott jelenlegi nátriumcsatorna-blokkolókkal, amelyek patkányokban csökkent motoros koordinációt, emberben pedig központi idegrendszeri mellékhatásokat okoznak minden hatékony adagban. Érdekes, hogy orális adagolás esetén a CDA54 agy / plazma aránya 0,03 volt. Ezzel szemben a klinikailag alkalmazott Nav1 blokkolók felhalmozódnak a központi idegrendszerben, az agy / plazma arány nagyobb, mint 10 a mexiletinnél. Ezek a CDA54-gyel kapott adatok határozottan arra utalnak, hogy a PNS nátriumcsatornák gátlása önmagában hatékony a neuropátiás fájdalom állatmodelljeiben, és hogy a Nav1 inhibitorok központi idegrendszeri expozíciójának korlátozása életképes megközelítés a Nav1 inhibitorok kifejlesztéséhez, jobb terápiás index mellett.

egy UHTS kampány, amely a Nav1.7 inhibitorainak szűrésére leírt membránpotenciál–alapú vizsgálatot alkalmazta, felfedezte az új 1-benzazepin-2-egy csatorna inhibitorokat (Hoyt et al., 2007; Williams et al., 2007). Az inhibitorok ezen csoportja meghatározott szerkezet-aktivitás összefüggést mutatott, és in vivo értékelve E sorozat tagjai orálisan hatásosak voltak rágcsáló neuropátiás fájdalom és epilepszia modellekben. Fontos, hogy ennek az osztálynak néhány tagja molekuláris szelektivitást mutatott a Nav1.7 csatornák iránt (Williams et al., 2007). Például, vegyület 2 ábra. A 2 nagymértékben államfüggő volt, és 10-szeres szelektív volt a Nav1.7, mint a Nav1.8 és a Nav1.5 esetében. A Nav1.7 inhibitorok ezen osztályának legerősebb, bár nem altípusszelektív tagja (1.vegyület, BNZA; ábra. 2) tritifikálták. A BNZA nagy affinitással (Kd 1,6 nM) kötődik a rekombináns Nav1, 7 csatornákhoz. Ez az első demonstráció a nagy affinitású ligandum kötődéséről a Nav1.7-hez, és értékes szűrőeszközt nyújt a Nav1.7-szelektív vegyületek kereséséhez. Az 1-benzazepin-2-on szerkezeti sorozattal kapott adatok arra utalnak, hogy Nav1.7-szelektív analógok azonosíthatók, és a megfelelő farmakokinetikai és gyógyszermetabolizmus-tulajdonságokkal rendelkező ilyen vegyületek analgetikumként kifejleszthetők, potenciálisan jobb tolerálhatóságot mutatnak a neuropátiás fájdalom kezelésére használt meglévő gyógyszerekhez képest. Az altípus-szelektív nátriumcsatorna-inhibitorok új fájdalomcsillapítóként történő kifejlesztésének megvalósíthatóságának támogatása a nagy affinitású Nav1.8 szelektív szer közelmúltbeli jelentéséből származik, amelyet intraperitoneálisan adtak, rágcsáló fájdalommodellek széles körében hatékony volt (Jarvis et al., 2007).

az altípus-szelektív nátriumcsatorna-gátlók keresésének lehetséges alternatív megközelítése a csatornák kapuját célzó vegyületek szűrése lenne mechanizmusok. Korábban számos peptidről kimutatták, hogy módosítja a nátriumcsatornák kapuját, de kevés kis molekulát, különösen inhibitorokat írtak le ilyen módon. Az egyik ilyen szer a ProTx-II, egy tarantula méregből tisztított 30 aminosavas peptid; ez a peptid blokkolja a nátriumcsatornákat, és szelektivitást mutat a Nav1.7 iránt (Smith et al., 2007). A ProTx-II a nátriumcsatornák nyugalmi állapotához kötődik, és a csatorna aktiválásának feszültségfüggését több depolarizált potenciálra tolja át. Az erős depolarizációk leküzdik a csatorna gátlását, ami az ilyen típusú kapu módosító peptid jellemzője. A kapuzó módosító peptid kis molekulájú mimetikumainak azonosításának egyik lehetséges stratégiája a protx-II radioizotópos megjelölése biológiailag aktív formában, valamint kötési vizsgálat kifejlesztése Nav1.7 csatornákkal, amelyek heterológ módon expresszálódnak egy sejtvonalban. A ProTx-II kötést moduláló kis molekulák szűrése új csatornagátló-osztályokat tárhat fel, amelyek a membránba válaszfalazódnak, és zavarják a kapu lapát mozgását, ezáltal megakadályozva a csatorna nyitását. Az ilyen típusú UHT-k további előnye, hogy a tesztvegyületek nagy koncentrációja alkalmazható, ez a helyzet kizárt a festékalapú szűrésben a fluoreszcencia interferencia miatt, amely általában sok kis szerves molekula magas koncentrációjánál fordul elő. Tekintettel arra, hogy egyes kapuzó módosító peptidek olyan régiókhoz kötődnek, amelyek egy szupercsaládon belül egyedi csatornákra jellemzőek, altípusszelektív inhibitorok azonosíthatók egy ilyen stratégia alkalmazásával.