Bevezetés

a hepatocellularis carcinoma (Hcc), amely az elsődleges májrák fő szövettani altípusát képviseli, az ötödik leggyakoribb rák világszerte, és a daganatos halálozás harmadik vezető oka (1,2). A májrák legmagasabb aránya a fejlődő országokban fordul elő, különösen Kelet- / Délkelet-Ázsiában és Közép – / Nyugat-Afrikában, míg az arányok alacsonyak Dél-Közép -, Nyugat-Ázsiában, Észak-és Kelet-Európában (3). A HCC (4-6) magas morbiditását genetikai változások és epigenetikai tényezők okozzák,mint például a krónikus HBV vagy HCV fertőzés, májcirrózis, alkoholos májbetegség és aflatoxinok.Azonban a molekuláris mechanizmus kíséria hepatokarcinogenezis és a progresszió még mindig nagyrészt nem tisztázott.Ezért fontos számunkra, hogy tisztázzuk az etiológiát, és megvizsgáljuk a hepatocellularcarcinoma megindításának és progressziójának alapvető molekuláris változását, és végső soron javítsuk a betegség diagnosztizálására, szűrésére és kezelésére vonatkozó jelenlegi koncepcióinkat.

a hepatocarcinogenesis folyamata során a sejtciklus ellenőrző pontjainak ellenőrzése fontos jellemzője, amely elősegítheti a rák kialakulását (2). a sejtciklus ellenőrzőpontjának egyik szabályozójaként a sejtosztódási ciklus 20 (CDC20)úgy tűnik, hogy szabályozó proteinként működik, amely kölcsönhatásba lép az anafázist elősegítő komplex/cikloszómával (APC/C) a sejtciklusban, amely szükséges az anafázis iniciálásához és a mitózis késői kilépéséhez (7,8). Két szabályozó tényező, a CDC20 és a Cdh1 közvetlenül kötődik az APC-hez, és aktiválja a ciklin ubiquitinationaktivitását a mitózis és a G1 fázis alatt (9,10).Beszámoltak arról, hogy a receptor-asszociált 80-as fehérje(RAP80), amely a BRCA1-et a DNS-károsodás által kiváltott ubiquitinsignaling útvonal DNS-károsodási helyeire toborozza, az anafázis-elősegítő komplex (APC/C-Cdc20) vagy (APC/C-Cdh1) keresztül lebontható a mitózis során a G1 fázisba (11). A RAP80 kimerülése a G2-m fázis ellenőrzőpontjának hatékony kontrollját mutatta, és elősegítette a mitotikus sejtciklus progresszióját.

a CDC20 expresszióját figyelemre méltóan elnyomhatja a p53fehérje, amely gátolja a rosszindulatú transzformációt a sejtciklus szabályozásán, a sejtöregedésen és az apoptózissal kapcsolatos géneken keresztül(12). A Cdc20 magas expresszióját jelentették különböző rosszindulatú daganatokban, beleértve a pancreaticductalis adenocarcinomát (13), az oralsquamous cell carcinomát, a gyomorrákot (14), a méhnyakrákot (15) és a különböző rákos sejteket (14,16).Azonban a CDC20 expressziós mintázata és klinikai jelentősége az emberi hepatocelluláris karcinómában nem tisztázott.

ebben a tanulmányban a mikroarray adatkészlet elemzésével (csatlakozási szám. GSE14520) a génexpressziós Omnibusz (GEO)adatbázisból (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) azt találtuk, hogy a Cdc20 volt a fő csomópont a HCC molekuláris interakciós hálózatokban. Megvizsgáltuk a CDC20 expressziós szintjét az elsődleges HCC-ben és a szomszédos, nem tumoros szövetekben, és 132 archivált HCC mintában értékeltük annak klinikai patológiai jelentőségét. A CDC20by siRNS leütésének a májrákos sejtek növekedésére és sejtciklusára gyakorolt hatását is vizsgálták. Eredményeink arra utalnak, hogy a CDC20 jelentős szerepet játszhat a HCC fejlesztésében.

anyagok és módszerek

bioinformatikai elemzés

A Gse14520 (17) mikroarray adatkészletet letöltöttük a GEO-ból. Ebben a vizsgálatban összesen 183 HCC-t és 179 megfelelő para-carcinoma szövetet alkalmaztak, amelyeket Affymetrix U133A Genechipekkel vizsgáltak 2 Kínai beteg kohorszából. A génexpressziós profilalkotási adatokat újra összefoglaltuk az RMA módszerrel (18) és az Entrez génközpontú CDF fájlokkal(19) (az eredetiaffymetrix CDF fájlok helyett), amelyek nem specifikus próbákat szűrtek a géncsipeken, és több, ugyanazt az centrez gént képviselő szondakészletet egyesítettek egy szondakészletbe. A mikroarray(SAM) (20) szignifikancia analízisét a HCC és a megfelelőpara-carcinoma szövetek eltérő expresszált génjeinek azonosítására végeztük. A Delta értéket 2,25-re, az ofFDR küszöböt pedig 0,001-re állították. A HCC-ben túlexpresszált géneket több mint 50 HCC szövetben, de kevesebb mint 10 megfelelő para-carcinoma szövetben vizsgálták. A géneket a GenCLiP szoftverrel (21) (http://ci.smu.edu.cn) tovább elemezték, hogy a génfunkciókat feljegyezzék és molekuláris interakciós hálózatokat hozzanak létre.

etikai nyilatkozat

a klinikai mintákat csak kutatási célokra használták. A jóváhagyást a ChinesePLA általános kórház etikai bizottságától szerezték be (LREC 2012/40). Az összes mintát a betegek előzetes írásbeli, tájékozott beleegyezésével gyűjtöttük össze.

betegek és szövetminták

tizenhat pár friss HCC-t és szomszédos, nem tumortissues-t használtak a valós idejű PCR és western blot elemzésekhez, amelyeket a kínai Pla Általános kórházból(Peking, Kína) gyűjtöttek be 2012 novemberétől 2013 februárjáig. A szöveteket felhasználásig folyékony nitrogénben fagyasztották. Paraffinba ágyazott, archivált HCC-t és az immunhisztokémiához (IHC) használt szomszédos nem tumoros szöveteket 132 HCC-s betegtől nyerték, akik 2006 januárja és 2007 decembere között ugyanabban a kórházban részleges májreszekción mentek keresztül. A betegek medián életkora52 év volt (24-80 év).

sejttenyészet

egy normál májsejtvonalat (LO2) és három HCC sejtvonalat (HepG2, SMMC7721, Huh7) vásároltak az American TypeCulture Collection (ATCC, Manassas, VA) vagy a Chinese Academy ofScience Cell Bank-tól, és azokat a biotechnológiai Intézetben tartották fenn, katonai Orvostudományi Akadémia. Valamennyi sejtet a Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM, Invitrogen,CA) tartottuk fenn, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS, Gibco,Carlsbad, CA) és 2 mM L-glutaminnal, 100 E/ml penicillinnel, 100 Ft/ml sztreptomicinnel 37 ft-on, 5% CO2-val.

RNS extrakció, cDNS szintézis ésralális idejű PCR analízis

A teljes RNS-t sejtvonalakból és szövetmintákból extraháltuk TRIzol reagenssel (Invitrogen) a gyártó utasításai szerint. A Transsgen Biotech (Peking, Kína) Transzszkript és cDNS szintézis készletével összesen 2 fő reverzibilis RNS-t írtak le. Real-time PCR was performed toexamine CDC20 mRNA level in cell lines and tissue samples by usinga Bio-Rad iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,Hercules, CA). β-actin was used as an internal control fornormalization. PCR primers were designed using the Primer Premier 5software and the sequences were: CDC20 forward,5′-TCGCATCTGGAATGTGTGCT-3′; and reverse,5′-CCCGGGATGTGTGACCTTTG-3′; β-actin forward,5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′; and reverse, 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′. Az expressziós adatokat normalizáltuk a housekeeping géngeometriai átlagára, a (22)−vel számoltuk, és az eredményeket 2 – (2) – cel fejeztük ki.

Western blot analízis

A Western blot analízist a standard protokoll szerint végeztük. SDS-poliakrilamid gélelektroforézist (10%) használtak a fehérje elválasztására, amelyet ezután elektrotranszferáltak a gélből egy polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra. Az 5% – os szárított sovány tej 1 órán át történő blokkolása után a membránt nyúl anti-humán CDC20 poliklonális antitesttel (1:1000, Bioworld Technology, St. Louis Park, MN) 1 órán át a szobábanhőmérséklet. Az egér anti-humán anti-humán-tubulin monoklonális antitestet (1: 5000; Santa Cruz Biotechnológia, Santa Cruz, CA) használták belső kontrollként. A 20 (TBST) közötti háromszoros trisz-pufferelt sóoldattal történő mosás után a membránt másodlagos torma-peroxidáz-konjugált antitesttel inkubáltuk nyúl egér ellen (hígítás 1:5000). A kemilumineszcens detektálás az Immobilon Western kemilumineszcens HRP szubsztrátokkal (Millipore Corporation, Billerica, MA) történt.

immunhisztokémia (IHC) andscoring

immunhisztokémia a CDC20 expressziójához HCC-ben ésszomszédos, nem tumormintákban standard módszerekkel végeztük.Röviden, szöveti szakaszok inkubáltuk nyúl anti-CDC20diluted 1: 200 (Bioworld technológia) egy éjszakán át, 4-kor C. szarvasmarha serumalbumin (1%; BSA) primer antitest nélkül használtuk, mint a negatív kontroll. A másodlagos poli-torma peroxidáz (HRP) nyúl elleni IgG antitestet (ZSGB-Bio, Peking, Kína) inkubáltuk szobahőmérsékleten 20 percig.

az összes immunszinkronizált szakaszt két patológus egymástól függetlenül vizsgálta felül, vak módon, a klinikai patológiai információk ismerete nélkül, a H-score módszer alapján, amely figyelembe veszi a festési intenzitást a sejtek pozitív festésének százalékával együtt (23,24).A H-score módszerhez 10 mezőt véletlenszerűen választottunk ki a 400magnification-on. A sejtekben a festési intenzitás 0,1, 2 és 3 volt, ami megfelel a negatív, gyenge, közepes és erős festésnek. Minden területen a teljes számaz egyes intenzitásoknál festett sejteket megszámoltuk. A H-pontszámot a következő képlet szerint számították ki: (az 1.intenzitási kategóriában festett sejtek % – a, 1. számú) + (a 2. intenzitási kategóriában festett sejtek % – a, 2. számú) + (a 3. intenzitási kategóriában festett sejtek % – a, 3. számú). A H-pontszámok 0-tól 300-ig változtak, ahol 300 a sejtek 100% – át képviselte erősenfoltos (3+) (24). A magas Cdc20 expressziót úgy határoztuk meg, hogy a sejtek h-pontszáma 200 volt.

a CDC20 elnyomása kis interferingrns (siRNS) által

a kétszálú, kis interferáló RNS (siRNS) szintetizálódott és tisztult a GenePharma (Shanghai, Kína) által. Az emberi Cdc20 kódoló régiójának megfelelő szekvenciák a következők voltak: érzék, 5′-GGAGCUCUCUCAGGCCA UUU-3′; antiszensz,5′-AUGGCCUGAGAUGAGCUCCUU-3′. Egy kódolt, nem célzott siRNS-t használtunk a negatív kontrollhoz. Ezeket az siRNS-eket feloldottuk indietil-pirokarbonát (DEPC) víz 20 km-es koncentráció eléréséhez. Májrák a HepG2 sejteket CDC20 siRNS-sel kezeltüknegatív kontroll siRNS 20 nM-en az INTERFERin invitro siRNS transzfekciós reagens alkalmazásával (Polyplus Transfection, NewYork, NY).

Kvantitatív valós idejű PCR és western blot analízist használtak a sicdc20 interferencia hatásának kimutatására. Sejtekamelyeket nem kezeltek vagy negatív kontroll sirnaoligonukleotidokkal kezeltek, a kontrollcsoportok voltak.

celluláris proliferációs vizsgálat

két 25 cm2-es műanyag lombikot egyenként 2 db 105 db májrákos sejtet (HepG2) oltottak be, amelyeket ezután 20 nM-es negatív kontroll siRNS-sel, illetve Cdc20sirns-sel transzfektáltak 48 órás inkubáció céljából. Ezután a sejteket megemésztettükés 6 lyukú lemezekbe vetjük, amelyek 2 ml közeget tartalmaznak.Ezt követően a kútból származó sejteket megemésztették és az automatikus sejtszámláló (Invitrogén) 24 óránként megszámolta az ötödik napig.

a sejtciklus fluoreszcenciával aktivált sejtválogatási(FACS) tesztje

siRNS CDC20 és negatív kontroll sirnaoligonukleotidokat Transzfektáltunk HepG2 sejtekbe azinterferin in vitro siRNS transzfekciós reagenssel 48 órán keresztül.a 2-es kezelés után 6G/ml timidin (Sigma-Aldrich, St. Louis,MO) 24 órán át, a sejteket a 0, 3, 6, 9, 12-h miután eltávolítottuk a timidint a táptalajról, és 70% alkohollal rögzítettük.Az elemzések előtt a sejteket PBS-sel mostuk, 1 mg/mlrnáz A-val kezeltük 37 kb 30 percig, majd propidium-jodiddal(PI) festettük. Az elemzéseket a BD FACSCalibur (Becton-Dickinson,Franklin Lakes, NJ) végezte, az eredményeket pedig a WinMDI Version 2.9 szoftver elemezte.

statisztikai elemzések

minden statisztikai elemzés az IBMSPSS 20.0 statisztikai szoftvercsomag használatával készült. A variancia egyirányú analízisét (ANOVA) használtuk a cdc20 mrnanormalizált expressziójának összehasonlítására a sejtvonalakban lévő CAC-aktinnal. Ugyanez a módszer isa normál májmintákra normalizált tumorszövetek szövettani differenciálódásának összehasonlításakor. Az adatok összehasonlítását két csoportban hallgatói t-teszttel végeztük. A dcc22 tesztet a CDC20 expresszió és a klinikai patológiai jellemzők közötti kapcsolat elemzésére használták. Kétváltozós korrelációk közötta változókat Spearman korrelációs együtthatói alapján számítottuk ki.A statisztikai szignifikancia szintjét p<0,05 értékre állítottuk be az összes teszt esetében.

eredmények

a CDC20 a HCC molekulainterakciós hálózatainak fő csomópontja

A SAM analízis 4358 gént azonosított túlexpresszált inHCC-ben, amelyekben 137 gént expresszáltak több mint 50 HCC szövetben,de kevesebb mint 10 para-carcinoma szövetben. A GenCLiP analízis azt mutatta, hogy a 137 gén közül 72 gén kapcsolódott a sejtciklushoz (p=1,238 e-15, 62 próba alapján), 19 gén kapcsolódott a gerincösszeállításhoz (p=2,172 e-55, 22 próba alapján), és 26 gén kapcsolódott a kromoszóma szegregációhoz (P=5,472 e-55, byx2 teszt). A 137 génnel felépített molekuláris hálózatok közül a CDC20 volt a fő csomópont, amelyről korábban nem számoltak be, hogy kapcsolatban állna a HCC-vel. Kilenc gén (NEK2, E2F1,BUB1, BUB1B, AURKB, CCNB1, CCNB2, UBE2C és CDKN2A) ismert, hogy kölcsönhatásba lépnek a CDC20-val, amelyben 7 gén kapcsolódik a spindleassembly checkpoint (Sac) (ábra.1). A SAC célja A CDC20 (25). Így arra a következtetésre jutottunk, hogy a HCC-ben a CDC20 túlzott expressziója a SAC hiányához vezet, és a sejtek gyorsan aneuploidokká válnak.

a CDC20 túlexpresszálódik a HCC-ben

Kvantitatív valós idejű PCR-t használtunk a CDC20 transzkripciós szintjének vizsgálatára három HCC sejtvonalban (HepG2, SMMC-7721és Huh7), valamint egy normál májsejtvonalban (LO2). CDC20 mRNS szint mind a három HCC sejtvonalban magasabb volt, mint a normalcell vonalban (ábra. 2).

annak meghatározása érdekében, hogy a cdc20 upregulációja a HCC sejtvonalakban hasonló-e a HCC betegeknél, Kvantitatív valós idejű PCR-t végeztünk 16 pár illesztett HCC-n és a szomszédos normál májszöveteken. Amint az ábrán látható.3A, a CDC20-at differenciálisan túlexpresszálták 14 az összes vizsgált humán primer HCC mintában, összehasonlítva ugyanazon betegek nem rákos mintáival. Ezenkívül a CDC20 mRNS expresszió tumor/nem tumor (T/NT) aránya legalább >2-szeres volt mind a 14 felszabályozott mintában, és a legmagasabb arány akár körülbelül 40-szeres volt. A CDC20 fehérje szintjét mindenben megerősítettéka 16 párosított szövetmintát western blot elemzéssel. Image J1.47V szoftvert használtunk az egyes sávok szürke szintjének kvantálására éskiszámítja az egyes betegek CDC20 T/NT arányát normalizálja a-tubulinnal. Az eredmények azt mutatták, hogy az összes vizsgált HCC minta magasabb cdc20 fehérje expressziós szintet mutatott, kivéve az 1. mintát és a sample4-et, amely összhangban volt az mRNS-szinttel (ábra. 3B). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a cdc20-at általában a HCC szöveteiben vagy a sejtvonalakban szabályozták.

a Cdc20 fehérje immunhisztokémiai festését

immunhisztokémiai vizsgálatot (IHC) végeztünk a CDC20 fehérje expressziójának és lokalizációjának elemzésére 132paraffinba ágyazott archivált HCC szövetmintában, beleértve 14 jól differenciált, 78 közepesen differenciált és 40 rosszul differenciált daganatos esetet. A CDC20 fehérjét felülszabályozták (h-pontszám 200) 90-ben (68,18%) a 132 HCC szövetből. Amint inFig. 4A, a CDC20 magas szintje jelen volt az elsődleges HCC léziókban, és a pozitív festés elsősorban a citoplazmában és a magokban lokalizálódott. Ezzel szemben a CDC20 voltnegatívan vagy gyengén festett a megfelelő nem tumoros szövetekben. A CDC20 festés pontszámainak mennyiségi összehasonlításával a 132archivált HCC és a szomszédos nem tumoros szövetek között (főleg a hepatocirrhosis és a hepatitis), A CDC20 festés pontszámai jelentősen növekedtek a HCC mintákban a peritumorális mintákhoz képest (ábra. 4B). Ezenkívül a CDC20 festés pontszámai jelentősen megnőtteka tumor szövettani differenciálódásának progressziója a jól topoorly differenciált szövetektől (ábra.5).

korreláció a megnövekedett Cdc20 expresszió és a HCC klinikai patológiai paraméterei között

a CDC20 fehérje expresszió és a 132 HCC beteg klinikai patológiai jellemzői közötti összefüggést tovább elemezték. Amint azt az I. táblázat összefoglalja, a CDC20 expresszió szignifikánsan összefügg a nemmel (P=0,013), a tumordifferenciálódással (P=0,000), a TNM stádiummal (P=0,012), a P53 és a Ki-67 expresszióval (p=0,023 és P=0,007). Ugyanakkor nostatisztikailag szignifikáns összefüggést találtak a magas Cdc20 expresszió és más klinikai patológiai jellemzők között, beleértve az életkorot, a tumor méretét, a HBV fertőzést, a szérum AFP szintet,a májcirrhosisot, a vaszkuláris inváziót és az intra/extra májmetasztázist. A Spearmancorrelation analízis kimutatta, hogy a CDC20 magas expressziója szorosan összefügg a nemekkel (R=0,215, P=0,013), rosszabb tumordifferenciálódás (R=0,421, P<0,001), fejlett TNM stádium(R=0,218, P=0,012), a p53 magasabb expressziós szintje (R=0,212, p=0,014) és Ki-67 (R=0,235, p=0,007) (II.táblázat). Ezek az eredmények együttesen azt mutatták, hogy a CDC20 erősen expresszálódott a HCC szövetekben, és expressziója szorosan korrelált a HCC differenciálódásával és progressziójával.

a CDC20 expresszió elnyomása aysirna által

a Kvantitatív valós idejű PCR a CDC20 transzkripciós szintjének 90%-os szuppresszióját tárta fel 48 órával a siCDC20-mal történő transzfúzió után, összehasonlítva a kezeletlen sejtekkel vagy sejtekkel sejtek negatív kontroll siRNS-sel fertőzöttek (ábra. 6A) (P<0,0001). A western blotanalízis a CDC20 fehérje szintjének nyilvánvaló szuppresszióját is kimutatta 48 h transzfekció után siCDC20-mal (ábra. 6B). A ciklin-függő kináz inhibitor 1A (p21) fehérje megváltozott expresszióját western blot analízissel is megvizsgálták, és az eredmények azt mutatták, hogy a P21FEHÉRJE szintje jelentősen megemelkedett a CDC20 elnyomása miatt (ábra. 6B).

a CDC20 szuppresszió hatása a sejtproliferációra és a sejtciklusra

A Sejtproliferációs vizsgálat kimutatta, hogy a CDC20 siRNS transzfektált sejtek sejtnövekedése figyelemre méltóan gátolt volt a negatív kontroll siRNS-sel transzfektált sejtekhez képest(ábra. 6C). A sejtproliferáció sicdc20 általi gátlását várhatóan a sejtciklus metafázisában a letartóztatás kísérte. Áramlási citometriás teszttel a G2/M fázisban a sejtek számának növekedését figyelték meg a sicdc20transzfektált sejtekben a negatív kontroll siRNS-sel transzfektált sejtekhez képest (ábra. 6D). Ezek az adatok azt mutatták, hogy a CDC20 elnyomása gátolta a sejtnövekedést a G2/M fázismegállás indukálásával.

Vita

a GEO adatbázisból származó mikroarraydataset bioinformatikai elemzésével azonosítottuk a CDC20-at, amely a HCC molekuláris interakciós hálózatainak fő csomópontja volt, kapcsolatban állt a spindle assembly checkpoint (SAC) – val a sejtciklusban. A tumorigenezis során úgy gondolták, hogy az orsószerelvény ellenőrzőpontjának hibái vagy zavarai felelősek az aneuploidizáció megnövekedett sebességéért (26). A Mondalet al arról számolt be, hogy a CDC20 túlzottan expresszálódik elsődleges fej-és nyaki daganatokban, valamint számos orális laphámsejtes karcinóma(OSCC) sejtvonalban. A CDC20 magas expressziós szintje az OSCC sejtekben korai anafázis-promócióhoz kapcsolódik, ami mitotikus abnormalitásokhoz vezet (27). A vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a magas CDC20 expresszió kimutatható oralsquamous cell carcinoma és colorectalis Cancer szövetekben, és a túlexpresszió rossz prognózist jósolhat a betegek számára (28,29).

CDC20 szükséges a késői anafázisos sejtekheza mitózisból való kilépés (30). A célcdc20 a mitózis kilépésének blokkolását eredményezi, ami jobb rákterápiás stratégia lehet a rákos sejtek hatékonyabb elpusztítására, mint az orsót zavaró gyógyszerek (31). Wang és munkatársai arról számoltak be, hogy a cdc20, amely onkoproteinként működhet az emberi rákok előrehaladásának és fejlődésének elősegítésében, ígéretes terápiás célt jelent (32). Bár a CDC20 szerepét a tumorigenezisben és számos emberbeteg prognózisában mélyen kutatták és megerősítették, korlátozott tanulmányok vizsgálták a CDC20 lehetséges működését a hepatocelluláris karcinóma kezdeményezésében és progressziójában.

ebben a tanulmányban a cdc20 expressziós szintjét értékeltük 16 párosított friss fagyasztott HCC szövetben és a megfelelő nem tumormintákban. Az eredmények azt mutatták, hogy az átlagos mRNS ésa CDC20 fehérje szintje a HCC szövetekben sokkal magasabb volt, mint a nem tumoros szövetekben. Immunhisztokémiát használtunka CDC20 szubcelluláris helyének vizsgálata és kapcsolata a HCC klinikai patológiai paramétereivel patients.By a Ca2 teszt segítségével azt találtuk, hogy a magasabb CDC20 proteinexpressziós szint összefüggésbe hozható a nemekkel, a tumor differenciálódásával, a TNM stádiummal, a P53-mal és a Ki-67 expresszióval. A CDC20 potenciálbiológiai funkciójának és molekuláris mechanizmusának vizsgálatára a HCC-ben egy kettős szálú, kis interferáló RNS-t (siRNS) terveztünk, amely a cdc20-at célozta, hogy zavarja a HepG2 sejtvonal expressziós szintjét. Sejtproliferációs vizsgálattal és FACS teszttel megállapítottuk, hogy a sicdc20 oligonukleotidokkal transzfektált sejtek csökkent növekedési sebességet és megnövekedett sejtarányt mutattak a G2/M stádiumban.

a CDC20 siRNS általi specifikus leütése elnyomott hatást mutatott a májrák sejtproliferációjával szemben invitro, ami azt jelezte, hogy a CDC20 túlzott expressziója várhatóan felgyorsítja a sejtproliferációt és elősegíti a HCC tumoriniciációját és progresszióját. Az elnyomott CDC20 expresszióval rendelkező májrákos sejteket inG2/M-fázis felhalmozódására indukáltuk, amely felelős lehet a sejtnövekedés gátlásáért. Ciklinfüggő kináz inhibitor 1A (p21), amelyről ismert, hogy részt vesz a G2/M ellenőrzőpontban (33), akkor bizonyult szabályozottnak, amikor a CDC20 expressziót kifejezetten elnyomták májráksejtekben. A P21 gátolhatja a nem foszforilált RB tumorszuppresszor fehérje felhalmozódásához vezető CDK-k aktivitását, amely gátolja az E2F transzkripciós aktiválódását, majd ezt követően megakadályozza a sejtek belépését a sejtciklus S fázisába(34).

összefoglalva, ez az első tanulmány, amelynek célja A CDC20 expressziójának vizsgálata a HCC szövetekben és sejtvonalakban, új hangsúlyt fektetve arra, hogy a CDC20 klinikailag releváns indikátor lehet, és a HCC terápiás célpontja. Mindazonáltal további tanulmányokra van szükség, amelyek a CDC20 molekuláris mechanizmusaira összpontosítanak a HCC megindításában és előrehaladásában, valamint a cdc20 prognosztikai jelentőségének kutatására.

Köszönetnyilvánítás

a szerzők köszönetet mondanak a katonai Orvostudományi Akadémia biotechnológiai Intézetének munkatársainak technikai támogatásukért.

	Parkin DM: Global cancer statistics in theyear 2000. Lancet Oncol. 2:533–543. 2001.PubMed/NCBI
	El-Serag HB and Rudolph KL: Hepatocellularcarcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis.Gastroenterology. 132:2557–2576. 2007. View Article : Google Scholar : PubMed / NCBI
	Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, WardE és Forman D: globális rákstatisztika. CA rák J Clin.61:69–90. 2011. Cikk megtekintése: Google Scholar
	Severi T, van Malenstein H, Verslype C andvan Pelt JF: Tumor kezdete és progressziója hepatocellularcarcinomában: kockázati tényezők, osztályozás és terápiás célok.Acta Pharmacol Sin. 31:1409–1420. 2010. Cikk Megtekintése: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Michielsen P and Ho E: vírusos hepatitis sáv hepatocelluláris carcinoma. Acta Gastroenterol Belg. 74:4–8.2011.
	McGivern DR and Lemon SM: A hepatitis C vírussal összefüggő májrák Karcinogenezisének Vírusspecifikus mechanizmusai. Onkogén. 30:1969–1983. 2011. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Fung TK and Poon RY: Egy hullámvasút a mitotikus ciklinokkal. Semin Sejt Dev Biol. 16:335–342. 2005.Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Weinstein J, Jacobsen FW, Hsu-Chen J, Wu Tand Baum LG: egy új emlős fehérje, a p55cdc, amely az osztó sejtekben jelen van, összefügg a protein kináz aktivitással, és homológ a protein-kináz aktivitással Saccharomyces cerevisiae sejtosztódási ciklus fehérjék cdc20és cdc4. Mol Sejt Biol. 14:3350–3363. 1994.
	Peters JM: Sejtbiológia: a checkpointbrake megkönnyebbült. Természet. 446:868–869. 2007. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Fang G, Yu H és Kirschner MW: a CDC20 fehérje családtagok közvetlen kötése aktiválja azanafázis-elősegítő komplexet a mitózisban és a G1-ben. Mol Cella. 2:163–171.1998. Cikk megtekintése: Google Tudós : PubMed/NCBI
	Cho HJ, Lee Eh, Han SH, et al: A humán RAP80 lebomlása a Cdc20 és Cdh1 ubiquitinligázok által szabályozott sejtciklus. Mol Rák Res. 10: 615-625. 2012. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kidokoro T, Tanikawa C, Furukawa Y,Katagiri T, Nakamura Y és Matsuda K: a CDC20-at, a potenciális rákterápiás célpontot negatívan szabályozza a p53. Onkogén.27:1562–1571. 2008. Cikk megtekintése: Google Tudós : PubMed/NCBI
	Chang DZ, Ma Y, Ji B, et al: A fokozott cdc20 expresszió a pancreas ductaladenocarcinoma differenciálódásával és progressziójával jár. J Hematol Oncol.5:152012. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kim JM, Sohn HY, Yoon SY, et al:a gyomorrákkal kapcsolatos gének azonosítása új expresszált szekvenciacímkéket tartalmazó cDNAmicroarray segítségével, amelyek kifejezik a gyomorrák sejtjeit. Clin Rák Res. 11: 473-482. 2005.PubMed / NCBI
	Espinosa AM, Alfaro a, Roman-Basaure E, etal: a mitózis potenciális markerek forrása a méhnyakrák szűrésére és túlélési és terápiás célpontjaira. PloS Egy.8:.PubMed / NCBI
	Ouellet V, Guyot MC, Le Page C, et al:tissue array analysis of expression microarray candidatesazonosítja a tumor fokozatával és kimenetelével kapcsolatos markereket a súlyos epitheliális petefészekrákban. Int J Rák. 119:599–607. 2006.Cikk megtekintése: Google Scholar
	Roessler S, Jia HL, Budhu a, et al: az Aunique metasztázis gén aláírása lehetővé teszi a tumorrelapse előrejelzését a korai stádiumú hepatocelluláris karcinómás betegeknél. CancerRes. 70:10202–10212. 2010. Cikk megtekintése: Google Scholar
	Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, et al:a nagy sűrűségű oligonukleotid tömb szonda szintű adatainak feltárása, normalizálása és összefoglalása. Biostatisztika. 4:249–264.2003. Cikk megtekintése: Google Scholar
	Dai M, Wang P, Boyd AD, et al: az Evolvinggene/transcript definíciók jelentősen megváltoztatják a GeneChip adatok értelmezését. Nukleinsavak res. 33: e1752005. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Tusher VG, Tibshirani R and Chu G:az ionizáló sugárzási válaszra alkalmazott mikroarray-K szignifikancia elemzése. Proc Natl Acad Sci USA. 98:5116–5121. 2001.Cikk Megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Huang ZX, Tian HY, Hu ZF, Zhou YB, Zhao Jand Yao KT: GenCLiP: a génlisták csoportosítására szolgáló szoftverirodalmi profilalkotás és a gén együttes előfordulásának felépítéseaz egyéni kulcsszavakhoz kapcsolódó hálózatok. BMC bioinformatika. 9:3082008.Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Adhikary S és Eilers M: Transcriptionalregulation and transformation by MYC proteins. Nat Rev Mol CellBiol. 6:635–645. 2005. Megtekintéscikk : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Detre S, Saclani Jotti G and Dowsett M: A’quickscore’ method for immunohistochemical semiquantitation:validation for oestrogen receptor in breast carcinomas. J ClinPathol. 48:876–878. 1995.
	Früh MPM: EGFR IHC score for selection ofcetuximab treatment: Ready for clinical practice? Transl LungCancer Res. 1:145–146. 2012.
	Hwang LH, Lau LF, Smith dl, et al: Buddingyeast Cdc20: az orsó ellenőrzőpontjának célpontja. Tudomány.279:1041–1044. 1998. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kops GJ, Weaver BA és Cleveland DW: a rákhoz vezető út: aneuploidia és a mitotikus ellenőrző pont. Nat RevCancer. 5:773–785. 2005. ViewArticle: Google Tudós : PubMed/NCBI
	Mondal G, Sengupta S, Panda CK, Gollin SM,Saunders WS és Roychoudhury s: a Cdc20 túlzott expressziója az orsószerelvény ellenőrzőpontjának károsodásához és a szájüregi rák aneuploidizációjához vezet. Karcinogenezis. 28:81–92. 2007. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Moura IM, Delgado ML, Silva PM, et al:a magas CDC20 expresszió az oralsquamous cell carcinoma rossz prognózisával jár. J Oral Pathol Med. 43:225–231. 2013.Cikk megtekintése: Google Tudós: PubMed / NCBI
	Wu WJ, Hu KS, Wang DS, et al: a CDC20overexpression rossz prognózist jósol a kolorektális rákos betegek számára. J Transl Med. 11:1422013. Cikk megtekintése : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yeong FM, Lim HH, Padmashree CG és SuranaU: Kilépés a mitózisból A kezdő élesztőben: a theCdc28-Clb2 mitotikus kináz kétfázisú inaktiválása és a mitotikus kináz szerepe cdc20. Mol Cella.5:501–511. 2000. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Huang HC, Shi J, Orth JD és Mitchison TJ:bizonyíték arra, hogy a mitotikus kilépés jobb rákterápiás cél, mint az orsószerelvény. Rákos Sejt. 16:347–358. 2009. Cikk megtekintése: Google Tudós: PubMed/NCBI
	Wang Z, Wan L, Zhong J, et al: Cdc20: potenciális új terápiás cél a rák kezelésében. Curr PharmDes. 19:3210–3214. 2013. Cikk Megtekintése: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Bunz F, Dutriaux a, Lengauer C, et al:a p53 és p21 követelménye a G2 letartóztatás fenntartásához DNS károsodás után.Tudomány. 282:1497–1501. 1998. Cikk megtekintése: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wells J, Boyd KE, Fry CJ, Bartley SM andFarnham PJ: az E2F és a pocket proteincsalád tagjainak célzott génspecificitása az élő sejtekben. Mol Sejt Biol. 20:5797–5807. 2000.Cikk Megtekintése : Google Scholar