állatok

a Zebrahalat 28,5 C-on tartottuk fenn 14 órás be – /10 órás kikapcsolt fénycikluson Danieau oldatban . A kombinatorikus kristály mutáns (albb4 / b4;nacrew2/w2; roya9/A9) három különböző egyedi mutáns törzs egymás utáni keresztezésével jött létre, nevezetesen nacrew2/w2 (ref. 9), roya9 / a9 (ref. 4) és albb4 / b4 (ref. 18) mutánsok. Fontos, hogy mind a lárvák, mind a felnőtt kristály zebrahal életképesek, és a pigmentációs fenotípuson kívül nem mutatnak látható morfológiai, funkcionális vagy viselkedési rendellenességeket. A casper mutánst nacrew2/w2 és roya9/A9 mutánsok keresztezésével nyertük, amint azt korábban leírtuk4. Az AB vonalat vad típusú zebrafish előállítására használták. A vizsgálatban használt transzgenikus vonalak közé tartozik a Tg(elvl3:GCaMP5G)21 és a Tg(elvl3:GCaMP6f)28. Konfokális funkcionális képalkotó kísérleteket végeztünk a nacre mutánsban. Fény-lemez képalkotó kísérleteket végeztek nacre, casper és crystal mutánsok. Kétfoton funkcionális képalkotó kísérleteket végeztünk kristálylárvákban. A zebrahal lárvák PTU-val történő kezelésére a szokásos eljárásokat8 követtük, konkrétan a lárvákat 200-ban neveltük fel 6db PTU (Sigma) Danieau oldatban 24 órával a megtermékenyítés után (hpf). Az optikai tektumban a vizuálisan kiváltott idegi aktivitás konfokális funkcionális képalkotásához használt TG (elvl3:GCaMP5G) lárvákat 200 db 24 HPF-től 3 dpf-ig terjedő PTU-val kezeltük, és 4 dpf-en képeztük. Ezt a munkát a helyi állatjóléti és etikai felülvizsgálati testület (King ‘ s College London) hagyta jóvá, és az állatok (tudományos eljárások) 1986.évi törvényével összhangban, az Egyesült Királyság Belügyminisztériumának engedélyével (PPL70/8057) végezték.

képalkotás

teljes állatú in vivo mikroszkópia

felnőtt zebrafish teljes állatú képeit egy Nikon D7000 digitális tükörreflexes fényképezőgéppel készítették, amely Sigma 150 mm makró objektívvel volt felszerelve. A felnőtt zebrafish-t érzéstelenítettük 0.2% trikain (MS222, Sigma) halfeldolgozó létesítmény vizében, és egy 90 mm-es petri-csészébe helyezve, amely halfeldolgozó létesítmény vizét tartalmazza. A lárvák leképezését ZEISS Axioskop mikroszkóppal végezték, amely EXi Blue CCD kamerákhoz (Retiga) és Volocity akvizíciós szoftverhez (PerkinElmer) volt csatlakoztatva. A lárva zebrahalat 0,02% tricainnal érzéstelenítettük Danieau oldatban, és 1% alacsony olvadáspontú agarózban (Sigma) immobilizáltuk üveglemezeken.

konfokális kalcium képalkotás

a képalkotást Zeiss LSM 710 konfokális mikroszkóppal végeztük, spektrális detektáló leolvasófejjel és 20x / 1-gyel felszerelve.0 NA víz-merítési cél (Carl Zeiss). A retina ganglionsejtekben (RGC-k) a vizuálisan kiváltott kalciumválaszok funkcionális idősorát 4,1 Hz-es sebességgel, 0,415 0,415 MHz-es felbontással (256 656 pixel) és 1 AU lyuknyílással érték el. A gerjesztő fényt egy 488 nm-es többsoros lézer szolgáltatta. A nem érzéstelenített Tg(elvl3:GCaMP5G) lárvákat 2%-os alacsony olvadáspontú Agarózban (Sigma) Immobilizáltuk, Danieau-oldatban készítve, és háti oldalával felfelé egy emelt üvegplatformra szereltük, amelyet egy egyedi gyártású Danieau-val töltött kamrába helyeztünk. Az agaróz elegendő volt a lárvák visszatartásához, így nem volt szükség érzéstelenítésre. A képalkotást délután (1-8 óra) végezték.

Fénylapos képalkotás

az egész agy fénylapos képalkotását ZEISS Lightsheet Z. 1 mikroszkóppal végeztük, amely két 10x/0,2 NA megvilágítási céllal és egy 20x/1,0 NA vízimmerziós detektálási objektívvel (Carl Zeiss) volt felszerelve. 488 nm-es lézergerjesztő fényt használtunk a gcamp6f fluoreszcencia kiváltására, és egy 505-545 BP szűrőt használtunk a kibocsátott fény detektálására. A pivot scanner (Carl Zeiss) a homogén megvilágítás biztosítására szolgál, ezért elkerüli az árnyékokat a megvilágítási tengely mentén. A fénylemez vastagsága középen 5,39, a látómező szélén pedig 10,8 km volt. Expozíciós idő volt, 29.97 ms. A méret térfogati képek az volt, 623 x 798 x 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pixel) felbontású, 0.415 × 0.415 × 0.631 µm. 4 dpf nacre, casper és crystal TG(elvl3:GCaMP6f) lárvákat először 10-15 percig bénították Le Danieau oldatban elkészített, 1 mg/ml-es (biotium) bungarotoxinban. Ezt követően a lárvákat 2% – os alacsony olvadáspontú Agarózban (Sigma) immobilizáltuk, és üvegkapillárisba helyeztük (20 ml térfogat, 701904; márka). Ezt követően a lárvafejet tartalmazó agarózhenger részét a kapillárisból extrudáltuk, és úgy orientáltuk a lárvákat, hogy a fej hátsó oldala a detektálási cél felé, a szemek pedig a két megvilágítási cél felé nézzen. A casper mutáns lárvák teljes agyi fénylapos képalkotását Dr. Martin Meyer (King ‘ s College London) által épített, 20x/1.0 NA vízimmerziós xlumplanfln detection objective (Olympus) által készített egyedi fénylapos mikroszkóppal végezték.

két fotonos kalcium képalkotás

két fotonos funkcionális képalkotást végeztek a retinában egy Nikon A1R MP mikroszkóppal, amely 4 csatornás GaAsP NDD-vel és Apochromat 25x/1,1 NA vízimmerziós objektívvel (Nikon) volt felszerelve. A gerjesztést egy Chameleon Ultra II móddal lezárt titán-zafír lézer (koherens) biztosította, 930 nm-re hangolva. A vizuálisan kiváltott kalciumválaszok idősorát 4 Hz-es sebességgel és 0,248 6,248 MHz-es felbontással (512 256 pixel) vettük fel. A lézerszkennelés aktiválása után 60 másodpercet vártunk a vizuális stimuláció megkezdése előtt, hogy biztosítsuk a retina alkalmazkodását a multi-foton lézer által okozott háttérfényszinthez. 4 db DPF kristály Tg (elavl3:GCaMP6f) lárvát először 10-15 percig bénítottunk meg a Danieau oldatban előállított (1 mg/ml; Biotium) DG-bungarotoxinban. Ezt követően a lárvákat 2%-os alacsony olvadáspontú Agarózban (Sigma) immobilizálták, és egy emelt, egyedi gyártású üvegplatformra szerelték fel, a háti oldalával felfelé (45 db-os dőlésszög), az egyik szem pedig egy LCD-képernyő felé (lásd vizuális stimuláció), amelyet egy egyedi gyártású Danieau-val töltött kamra alá helyeztek. A képalkotást délután (1-8 óra) végezték.

vizuális stimuláció

mozgó rudak konfokális készítményben

mozgó rudak ingereket generáltunk a korábban leírtak szerint22,33. Diffúziós szűrőt (3026, Rosco) kötöttünk a kamra egyik oldalához, hogy vetítővászonként szolgáljon. A vetítővászon felé néző szem előtti agarózt eltávolítottuk, lehetővé téve a vetített kép akadálytalan megtekintését a kamra oldalán. A lárvákat 3 cm-re helyezték el a képernyőtől, és a kivetített kép ~97 63 63 látómezőt töltött be. A vizuális ingerek világos (56 cd/m2) vagy sötét sávokból (8 cd/m2) (Az átlagos fénysűrűség 175% – A, illetve 25% – a) álltak átlagos szürke háttéren (32 cd/m2). Mivel nem figyeltek meg minőségi különbséget a világos és a sötét sávok között, a két inger felhasználásával nyert adatokat kombináltuk. Mindegyik sáv szélessége 10 Szélesség volt, 20 fő / másodperc sebességgel mozogva, és az előző sávtól 30 fővel elválasztva, lehetővé téve, hogy egyszerre egynél több sáv jelenjen meg a képernyőn. A rudak hosszú tengelyei merőlegesek voltak a mozgás irányával. A 12 mozgási irány mindegyikét egyszer (3 másodperc) mutatták be pszeudo-véletlenszerű sorrendben, amely minden egyes képen látható állat minden szeletére jellemző. Minden korszakközi intervallum 10 másodperc volt, hogy a GCaMP5G jelek visszatérjenek az alapvonalra. A 2 másodperces üres képernyő nullfeltételét szintén átlapolták. A vizuális kísérleteket egyedi írású Labview és Matlab kód (MathWorks) segítségével hozták létre és irányították, ViSaGe stimulus presenter (Cambridge Research Systems) és DLP Pico projektor (Optoma) segítségével.

mozgó rácsok kétfoton készítményben

a mozgó rácsok ingereit a Kétfoton készítményben a PsychoPy39 segítségével hoztuk létre és szabályoztuk, majd egy LCD képernyőn (SKD5VA-3, GoodWell technológia) keresztül szállítottuk egy egyedi gyártású Perspex kamra alá. Az LCD képernyő és a kamra között egy hosszú áteresztő vörös üvegszűrőt (FGL610, Thorlabs) helyeztek el, hogy lehetővé tegyék az egyidejű képalkotást és a vizuális stimulációt. A lárvákat a képernyőtől 2 cm-re helyezték el, és az LCD képernyőn megjelenő kép ~140 600 (átlagos háttérfénysűrűség 30,4 cd/m2) látómezőt töltött be. A vizuális ingerek négyzethullámú rácsokból álltak (100% kontraszt, térbeli frekvencia 1,66 ciklus/cm, időbeli frekvencia 1 ciklus/s). Mindegyik rácsrúd szélessége 8,5 db volt, a rudak hosszú tengelyei merőlegesek voltak a mozgás irányára. A 12 mozgási irány mindegyikét egyszer (6 másodperc) mutatták be 10 másodperces korszakközi intervallummal, hogy a GCaMP6f jelek visszatérhessenek az alapvonalra. A 6 másodperces üres képernyő nullfeltételét szintén átlapolták. A TTL kiváltja (0-5-0 volt) az epoch time események rögzítését, ahol egy LabJack USB DAQ eszközön keresztül generálódik (U3-LV, LabJack Corporation). A lézerszkennelés aktiválása után 60 másodpercet vártunk a vizuális stimuláció megkezdése előtt, hogy biztosítsuk a retina alkalmazkodását a multi-foton lézer által okozott háttérfényszinthez.

Optomotoros válaszvizsgálat

Az egyes 5 dpf lárvát egy Danieau oldatot tartalmazó 35 mm-es petri-csészébe helyeztük. Az iPhone 5 (Apple) LCD képernyőjét, amelyet a MacBook Pro (Apple) Duet Display (Kairos Technologies) segítségével vezéreltek, fekete-fehér négyzethullámú rácsok (85% – os kontraszt, térbeli frekvencia 0,33 ciklus/mm, időbeli frekvencia 3,5 ciklus/s) megjelenítésére használták, 4 irányban mozogva (90 db-os szögtávolság) a petri-csésze alján. Vizuális ingereket generáltak a Keynote-ban (Apple). Minden lárvát összesen 5 alkalommal Teszteltünk (minden kísérlet 6 másodpercig tartott, majd 10 másodpercig statikus rácsok), és a vizsgálatok szerint reagáltak (azaz a halak a mozgó rácsok irányába fordulnak és úsznak). A lárvák viselkedését M165 FC sztereomikroszkóppal (Leica) vizuálisan monitorozták.

analízis

funkcionális analízis

Az In vivo kalcium képalkotó adatokat a korábban leírtak szerint elemeztük22,33. Összefoglalva, a funkcionális idősorokat az elemzés előtt az alábbiak szerint dolgoztuk fel: az egyes kísérletekből származó idősoros képeket merev testű algoritmussal korrigáltuk a mozgásra (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), A medián szűrést 1 voxel kernellel végeztük a sötét és a lövés zajának eltávolítása érdekében, és térben simítottuk egy 2D Gauss kernel = 2 voxellel a jel-zaj javítása érdekében. Az alacsony frekvenciájú sodródásokat korrigáló alapvonalat (B) egy köbös spline algoritmus segítségével határoztuk meg, amely a korszakok közötti intervallumadatok 5 másodpercéből átlagolt csomók között extrapolálódik. Mindkét relatív jelintenzitás változik (6F = F-B; ahol F = nyers fluoreszcencia) és normalizált jelintenzitás-változásokat számítottak ki minden voxelnél. A populációs funkcionális adatokhoz (voxel-wise analízis), míg a manuálisan definiált érdeklődési területekhez (Roi-k) az ~ F/F0 % – ot használták. Minden egyes voxel vagy ROI esetében az EPOCH-intervallum integrált válaszát úgy számítottuk ki, hogy az inger mozgásának minden bemutatott irányának egyetlen válaszmérőjét kapjuk. Az egyes korszakablakokon belüli integrál egy összefoglaló mutató, amely jobban ellenáll a kalciumszonda telítettségi hatásainak, mint a maximális jelváltozás. Az akvizíciós képsorozaton belüli minden egyes voxel küszöbértékét a korszakok közötti intervallumok során bekövetkező változások varianciája és a null állapot alapján határoztuk meg, küszöb = 5 ++ SDs. Minden olyan voxelt, amely legalább két vizuális megjelenítési korszakon belül küszöb feletti volt, vizuálisan érzékenynek tekintettek, és további jellemzésnek vetették alá.

a vizuálisan érzékeny voxelek irány – és orientációszelektív indexeinek (DSI és OSI)40 irány-és orientációszelektivitásának elemzéséhez illesztett von-Mises vagy Gauss-profilok41 alapján kiszámítottuk az illesztés jóságára vonatkozó becsléssel együtt, R2. A DSI-t a következőképpen határoztuk meg: (Rpref-Rnull)/(Rpref + Rnull), ahol az rpref, az előnyben részesített irányra adott válasz az integrált válasz volt az előnyben részesített irány korszak-intervallum. Az Rnull-t hasonlóan számítottuk ki, mint az előnyben részesített iránymal ellentétes irányú integrált választ. Az OSI-t a következőképpen határoztuk meg: (Rpref-Rorth)/(Rpref + Rorth), ahol az rpref, az előnyben részesített orientációra adott válasz az integrált válasz volt az előnyben részesített orientációs korszakintervallum felett. A Rorth-ot hasonlóan számítottuk ki, mint az ortogonális orientáció által kiváltott integrált választ. A DSi és az OSI mutatókkal kapcsolatos keresztbeszélgetések és túlzott illesztések minimalizálása érdekében szigorú megközelítést alkalmaztak. Ahhoz, hogy egy voxel irányszelektívnek (DS) vagy orientációszelektívnek (OS) lehessen tekinteni, egymást kizáró kritériumokat alkalmaztak: DS, ha DSi > 0.5 és OSI < 0.5; és OS if OSI > 0,5 és DSI < 0,5. Mindkét esetben az illesztés jóságának (R2) a DSI, illetve az OSI esetében >0,8 kellett lennie; így az illesztett görbék az integrált válaszok legalább 80% – át magyarázták. Egyetlen von-Mises eloszlást alkalmaztak a DS voxelek válaszainak illesztésére és a mozgás szögének előnyben részesített irányának becslésére az illesztett görbe közepétől. Két von-Mises összegét (180 db-os szögtávolság egymástól) használtuk az OS voxelek válaszainak illesztésére és a mozgásszögek előnyben részesített orientációjának becslésére az illesztett görbék középpontjaitól. A körkörös varianciát összehasonlításra is kiszámítottuk az orientációs szelektivitás alternatív metrikájaként (körkörös variancia < 0,4)41.

morfológiai elemzések

az agy térfogatának meghatározásához 4 dpf nacre, casper és crystal TG (elavl3:Gcamp6f) lárvák, kiszámítottuk a gcamp6f+ voxelek számát az egyes térfogati képekben az adjust>küszöbérték függvény alkalmazásával, amelyet az analize>hisztogram>lista parancs követett az ImageJ42-ben. Ezt követően a kapott értékeket megszoroztuk egyetlen voxel térfogatával (0, 415 0, 415 0, 631, 0, 631, 3 = 1, 086, 10-1, 3, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX).

statisztikai elemzések

a statisztikai vizsgálati eredményeket ábrák és ábrák legendái jelentik. Statisztikai elemzéseket és teszteket végeztek a Prism 6 (GraphPad) vagy a Matlab R2014b (MathWorks) használatával. A statisztikai tesztek elvégzése előtt leíró statisztikákat (pl. normalitási tesztek annak megállapítására, hogy az értékek Gauss-eloszlásból származnak-e, vagy F-teszt a varianciák összehasonlítására) használtuk a megfelelő statisztikai teszt kiválasztásához (az ábra legendáiban a teszt eredményeivel együtt). A statisztikai szignifikancia kritériumát p < 0,05 értékre állítottuk be.