laboratóriumi megjegyzések A BIO 1003

60 augusztus 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Holland

enzimek

fehérjék, amelyek hatnak katalizátorként

(kattintson ide: anyagok, témák, webes források)

a sejteknek nincs lehetőségük a hőre és az erőteljes keverésre, hogy felgyorsítsák a kémiai reakciókat azáltal, hogy az atomok és molekulák gyakrabban és nagyobb erővel ütköznek egymásba. Ehelyett enzimeknek nevezett fehérjekatalizátorokat készítenek, amelyek olyan felületeket biztosítanak, amelyeken a reagensek megfelelő irányban találkoznak egymással, és az enzimek akár gyengíthetik a megszakítandó kötéseket is. Az enzimek nagy specificitásúak-csak specifikus reagensek illeszkednek a felületükre, és kiegyensúlyozzák az aktív helynek nevezett hely helyi felületi töltéseit. Az enzim reagenseinek adott halmazát szubsztrátjának(szubsztrátjainak) nevezzük. Az enzimeket, mint minden katalizátort, nem változtatja meg az általuk katalizált reakció; így, amikor az összes reagens termékké alakul, az eredeti enzimmolekulák megmaradnak.

az enzim működése attól a környezettől függ, amelyben a reakció bekövetkezik. Az olyan tényezők, mint a hőmérséklet és a pH, nagymértékben befolyásolhatják az enzim azon képességét, hogy elvégezze a munkáját. A következő kísérletsorozat szemlélteti az enzimatikusan katalizált reakciók alapelveit a biológiai rendszerekben. A növényekben gyakori katecholáz (vagy katechol-oxidáz) enzimet fogjuk használni; jelen van a frissen facsart burgonyalében, amelyet biztosítottak. A katekoláz szubsztrátjai a katekol és az oxigén. A szubsztrátok az enzim aktív helyén reagálnak egymással. A reakció során keletkező termékek a benzokinon és a víz; mivel a benzokinon barna színű, láthatjuk, hogy a reakció megtörtént. Ezt nevezik gyümölcsbarnító reakciónak. A benzokinon gátolja a mikroorganizmusok szaporodását és megakadályozza a sérült gyümölcs rothadását. Sértetlen sejtekben a katekoláz a vezikulákban tárolódik, és nem lép kölcsönhatásba a katekollal.

a katacholáz enzim jelenlétében:

katekol + CAECHO2 benzokinon + H2O

az alábbi kísérletek mindegyikében keverje össze az összetevőket a megadott módon, és keverje össze a keveréket egy örvényszinnel vagy a cső aljának közelében lévő oldalának megérintésével; inkubálja a keverékeket 40 C fokon, hacsak másképp nem rendelkezik.

ha kétségbe vonta az enzim tisztaságát, hogyan tudná megtudni, hogy van-e valami más a burgonya kivonatban a katekoláz mellett?

I. benzokinon képződése és kimutatása

Ez a kísérlet meghatározza a reakció bekövetkeztének vagy elmaradásának megjelenési normáit. Használjon desztillált vizet, ahol H2O van feltüntetve.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (control)

hogyan definiálná a kontroll és a kísérlet fogalmát?

II. enzim specificitás

a hidrokinon szerkezetileg hasonló, de nem azonos a katekollal. Ebben a kísérletben meglátjuk, hogy az enzim képes-e benzokinonná alakítani, vagy ha az enzim egyszerűen túl specifikus a kialakításában ahhoz, hogy kölcsönhatásba lépjen a hasonló, de nem azonos molekulával.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (control)

az enxyme átalakíthatja-e a hidrokinont benzokinonná? Hogyan jutott erre a következtetésre?

megjegyzés: a csoportod vagy III vagy IV—et fog csinálni-nem mindkettőt.
kérdezze meg a labor oktató, hogy a csoport fog tenni III hőmérséklet vagy IV pH.

III. hatása hőmérséklet enzimaktivitás

enzimek úgy tervezték, hogy működik egy adott hőmérsékleti tartományban. Lehet, hogy néhány találgatások, hogy az eredmény a következő hőmérsékletek alatt. Ne feledje, hogy az enzimet termelő struktúrák gyümölcsök és burgonya; a Celsius hőmérsékleti skálán 0 fok fagyás, 22 fok szobahőmérséklet és 100 fok forralás. Minél melegebb, annál gyorsabban vibrálnak és mozognak a molekulák. A vízmolekulák ütközése az enzimmel visszavonhatja hajtogatott szerkezetét, amelyet hidrogénkötések tartanak a helyzetben; amikor ez megtörténik, a molekulát állítólag denaturálták. Mi történne az aktív oldallal ebben az esetben? Alacsony hőmérsékleten a molekulák nagyon lassan mozognak, és nagyon kicsi az esélye annak, hogy összeütköznek és reagálnak egymással. Vegye figyelembe, hogy a burgonya kivonatot jégen tartották. Miért?

írja le hipotézisét a hőmérséklet enzimaktivitásra gyakorolt hatásáról:

állítson be 6 pár kémcsövet 10 csepp burgonyakivonattal az egyik készletben, a másikban pedig 10 csepp 1% katekolt. Inkubáljuk őket 5 percig, egy párral az alábbiakban jelzett 5 hőmérsékleti környezetben. Ezután keverjük össze a burgonyakivonatot és a katekolt; jegyezze fel a kezdeti színt, és tegye vissza a csövet az ellenőrzött hőmérsékleti környezetbe. 5 perc elteltével rögzítse újra a színt.

hőmérséklet	kezdeti szín	színváltozás (5 perc. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 fok C
100 fok C

Az eredmények alátámasztják a kezdeti hipotézist?

mely hőmérsékletek denaturálják az enzimet, hogy az ne tudjon helyreállni.

mi az a fehér csapadék, amely 100 C fokon képződik?

IV. a pH hatása az Enzimaktivitásra

a pH-skála az oldatban jelen lévő hidrogénionok számát méri (mindegyik +1 töltéssel). A skála a biológiai rendszerekben 0-tól (erősen savas) 14-ig (erősen bázikus) terjed. 7, a semleges pont, a tiszta víz pH-ja. Emlékezzünk arra, hogy a fehérjemolekulák hajtogatott szerkezete nagyrészt a polipeptidlánc ellentétes töltésű részei közötti hidrogénkötésnek köszönhető. Az oldatban lévő egyéb ionok helyettesíthetik a lánc megfelelő részeit, és visszavonhatják. Amikor ez megtörténik, mi lesz az aktív webhely?

írja le hipotézisét a pH-tartomány enzimaktivitásra gyakorolt hatásáról:

állítson be 7 kémcsövet, mindegyikben 40 csepp különböző pufferolt pH-oldattal. Adjunk hozzá 10 csepp burgonyakivonatot mindegyikhez, majd keverjük össze. Ezután adjunk hozzá 10 csepp 1% katekolt mindegyikhez, majd keverjük össze.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

milyen pH-értéken vagy pH-értéktartományban működik az enzim a legjobban?

miért késlelteti a citromlevet a frissen szeletelt gyümölcsre?

V. A kofaktorok szükségessége az Enzimaktivitáshoz

sok enzim csak akkor működik, ha van hozzájuk társított kofaktor. A katekoláz rézt igényel kofaktorként. A PTU egy olyan vegyi anyag, amely nagyobb affinitással rendelkezik a rézhez, mint a katekoláz, és eltávolítja a rézt az enzimtől. Megfigyelheti, hogy mi történik az enzim működésével, amikor a kofaktort eltávolítják. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract. 5 perc elteltével adjunk hozzá 10 csepp 1% katekolt.

melyik cső, A vagy B, a kontroll ebben a kísérletben?