a Candida guilliermondii gomba széles körben elterjedt a természetben, beleértve a bőr és a nyálkahártya felületének emberi mikrobiotáját is.22 bár ez a faj csökkent virulenciát mutat a többi Candida fajhoz képest, 3 jelenleg feltörekvő kórokozónak tekintik, Latin-Amerikában jelentős előfordulással.18C. a guilliermondii-t számos klinikai fertőzés etiológiai ágenseként ismerik el, beleértve a disszemináltakat is,főleg immunhiányos betegeknél, 22 és nozokomiális járványok intravaszkuláris eszközökkel rendelkező műtéti betegeknél.13 Jelenleg a neutropeniás betegek invazív candidiasisának ajánlott kezelése magában foglalja a kaszpofungint (CFG) vagy a mikafungint (MFG) elsővonalbeli terápiaként, alternatívaként a liposzómás amfotericin B-t (LAMB) és az anidulafungint (AFG), míg a flukonazol (FLC) csak akkor ajánlott, ha az erre a gyógyszerre való érzékenység megerősítést nyer.23 azonban számos tanulmány kimutatta,hogy a C. guilliermondii csökkent érzékenységgel rendelkezik az FLC8,15, 19-re, és a magas amfotericin B (AMB) minimális gátló koncentrációjú (Mic) izolátumokhoz kapcsolódó terápiás kudarcokról számoltak be.9,12,24 bár az izolátumok közel 90% – a echinocandins Mic-ket mutat, amelyek megegyeznek vagy alacsonyabbak,mint az érzékenység klinikai határértékei (CBP) (2 ~ g/ml), 17 hasonlóan a Candida más fajaihoz, mint pl. C. parapsilosis, a C. guilliermondii egyes izolátumai jelentősen magas Mic-ket mutatnak.8,15 az invazív candidiasisban az AFG hatékonyságára vonatkozóan rendelkezésre álló adatok korlátozottak, és a gyógyszer lehetséges szerepe a klinikai gyakorlatban kevéssé ismert.23 ebben az összefüggésben az állatkísérletek fontos szerepet játszhatnak az in vitro–in vivo korreláció jobb megértésében.11 ezért fő célkitűzésünk az volt, hogy értékeljük az AFG in vitro és in vivo aktivitását a C. guilliermondii különböző izolátumaival szemben, összehasonlítva az eredményeket az AMB és az FLC eredményeivel.
anyagok és módszerekgombás izolátumok
négy klinikai izolátum C. az in vitro vizsgálatban guilliermondii-t (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 és UTHSC 10-3207) használtak, és ezek közül kettőt (UTHSC 11-685 és UTHSC 11-142) választottak ki az egér modelljéhez a különböző in vitro érzékenységük alapján. Az izolátumokat a belső transzkripciós spacer (ITS) régió és az rRNS D1–D2 doménjeinek szekvenálásával azonosítottuk, összehasonlítva a szekvenciákat e faj típustörzsének szekvenciáival.
In vitro vizsgálatok
a négy törzs AMB-re, FLC-re és AFG-re való In vitro érzékenységét referencia tápközeg mikrodilúciós módszerrel értékelték,a 6Candida parapsilosis ATCC 22019 és a Candida krusei ATCC 6258 minőségellenőrzésként szerepelt.
Időölési görbéket fejlesztettek ki az összes törzsre a korábbi vizsgálatok szerint.5,20 röviden, mindegyik gombaellenes törzsoldatot készítettünk, AMB (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) és AFG (Pfizer Inc., Madrid, Spanyolország) dimetil-szulfoxidban és FLC-ben (Pfizer Inc., Madrid, Spanyolország) desztillált vízben. Továbbá a gyógyszer hígításait 9 ml standard rpmi 1640 táptalajban állítottuk elő, hogy a 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 és 32 db/ml minden gyógyszerből. Az izolátumokat szubkultúráltuk 35cc-n 24 órán keresztül burgonya-dextróz-agar (PDA) lemezeken. A C. guilliermondii tenyészeteit steril sóoldatban szuszpendáltuk, és az így kapott szuszpenziókat hemocitométerszámmal és PDA-ra történő sorozatos bevonással korrigáltuk az életképesség megerősítése érdekében 5 ~ 106 kolóniaképző egység (CFU)/ml értéken. A (gyógyszermentes) hígításokat és kontrollokat 1 ml gombaszuszpenzióval oltottuk be, aminek eredményeként a kiindulási inokulum 5 kb 105cfu/ml volt, és 35 Kb C-on inkubáltuk. minden tubusból 100 ml alikvot-ot gyűjtöttünk 0, 2, 4, 6, 8, 24, és 48 órával a beoltás után és desztillált vízzel hígítva; ezek közül 30-at PDA-lemezekre tenyésztettünk, és 35-et inkubáltunk 48 órán keresztül CFU/ml meghatározásra. A CFU 99,9% – os vagy 3 log10 egységnyi csökkenését a kiindulási inokulumhoz képest fungicid hatásúnak, míg a
log10 egységnyi csökkenést fungisztatikusnak tekintették. A kimutatási határ 50CFU / ml volt. Az összes időölési görbe vizsgálatot a duplicate.In vivo vizsgálatok
hím-1 egerek (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Spanyolország), átlagos súlya 30g használtunk a kísérletben. Az egereket szabványos dobozokban helyezték el, ahol szabadon hozzáférhettek az élelmiszerhez és a vízhez. Minden állat eljárásokat felügyelte és jóváhagyta a Universitat Rovira i Virgili állatjóléti és Etikai Bizottság.
az egereket a fertőzés előtt egy nappal neutropeniássá tették intraperitoneális (i.p.) injekció 200 mg/kg ciklofoszfamidot (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Spanyolország), valamint intravénás (IV.) 5-fluorouracil (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, Spanyolország) injekciója 150 mg/kg-ban.10,14 a fertőzés napján az egereket i.v. A C. guilliermondii, az UTHSC 11-685 és az UTHSC 11-142 két törzsének mindegyikéből 1 6,2 ml steril sóoldatban az oldalsó farokvénába vittük.3,4
nyolc állatból álló csoportot véletlenszerűen határoztak meg minden törzsre és gyógyszerre vonatkozóan. A csoportokat a következőképpen kezeltük: amfotericin B dezoxikolát (AMBd) (Xalabarder Gyógyszertár, Barcelona, Spanyolország) napi egyszeri 0,8 mg/kg dózisban (QD); liposzómás amfotericin B (LAMB) (Gilead Sciences S. A., Madrid, Spanyolország) 10 mg/kg intravénás, Mennyiségi egység; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spanyolország) 25 mg/kg szájon át (p.o.) szondával, naponta kétszer (BID); és AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Egyesült Királyság) 10 mg/ttkg/adag i.p., QD. Minden kezelés a kihívás után 24 órával kezdődött, és 7 napig tartott. A kontrollok nem kaptak kezelést. A bakteriális fertőzések megelőzése érdekében minden egér 5 mg/kg ceftazidimet kapott szubkután a fertőzés utáni 1-7. Az egereket naponta ellenőrizték, és a fertőzés utáni 8.napon eutanizálták CO2 anoxia. Az egyes gyógyszerek hatásosságát szöveti terhek csökkentésével és kórszövettani vizsgálatokkal értékelték. A veséket aszeptikusan eltávolítottuk, az egyiket lemértük és 2 ml steril sóoldatban homogenizáltuk. A homogenizátumok soros 10-szeres hígításait PDA-ra vontuk, és 48 órán át inkubáltuk 35 oc-on a CFU / g számításhoz. A kórszövettani vizsgálathoz a fennmaradó vesét 10% – os pufferolt formalinnal rögzítették, dehidratálták, paraffinba ágyazták, és 2 6 mm-es szakaszra szeletelték, amelyeket hematoxilin–eozinnal (H-E) és periodikus acid-Schiff (PAS) folttal festettek fénymikroszkópos vizsgálat céljából.
statisztikák
a szövetekből származó kolóniák számát A Mann–Whitney U-teszt segítségével elemeztük Graph Pad Prism 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Amikor a P értékek 0,05 alatt voltak, a különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintették.
eredmények in vitro vizsgálatok
az AMB Mic–je 0, 25–1 ~ g/ml, 0, 06–0, 25 ~ g/ml volt az AFG és 0, 5-1 ~ g / ml az FLC esetében. A C. guilliermondii elleni amb -, FLC-és AFG-érzékenység határértékeit követően 16 minden izolátum érzékeny volt a három gyógyszerre. A minőségellenőrzési törzsek érzékenysége az elfogadott tartományokon belül volt.6
az AMB gyilkos kinetikája gyors fungicid aktivitást mutatott, amely a gyógyszer koncentrációjával nőtt. A MIC-vel egyenértékű koncentrációban ez a gyógyszer fungicid hatást mutatott a vizsgált négy izolátum közül három ellen (ábra. 1). Ez az aktivitás közvetlenül a beoltás után kezdődött 1 ~ g/ml feletti koncentrációban, a fungicid végpontot 4 óra után, 32 ~ g/ml-nél érték el. Az AFG 0,5 USD/ml feletti koncentrációban fungicid aktivitást mutatott 4 óra inkubálás után. A fungicid végpontot 12-24 órás inkubáció után érték el 32 6G/ml–nél (ábra. 2). Az FLC fungisztatikus aktivitást mutatott mind a négy izolátum ellen (ábra. 3).
az AMB időölő kinetikai vizsgálata a C. guilliermondii négy törzse ellen. (■) A 0,03 µg/ml, (▴) 0.12 µg/ml, (□) a 0,5 µg/ml, (○) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿) 8µg/ml, (♦) 32µg/ml, (●) ellenőrzés. A szaggatott vonalak a CFU növekedésének 3LOG10 egységnyi csökkenését jelentik a kezdeti inokulumhoz képest (fungicid aktivitás), a szaggatott vonalak a vizsgálat mennyiségi határát jelzik.
az AFG időölő kinetikai vizsgálata a C. guilliermondii négy törzse ellen. (■) A 0,03 µg/ml, (▴) 0.12 µg/ml, (□) a 0,5 µg/ml, (○) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿) 8µg/ml, (♦) 32µg/ml, (●) ellenőrzés. A szaggatott vonalak a CFU növekedésének 3 log10 egységnyi csökkenését jelentik a kezdeti inokulumhoz képest (fungicid aktivitás), a szaggatott vonalak a vizsgálat mennyiségi határát jelzik.
az FLC időölő kinetikai vizsgálata a C. guilliermondii négy törzse ellen. (■) A 0,03 µg/mL, (▴) 0.12 µg/ml, (□) a 0,5 µg/ml, (●) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿)8µg/ml, (♦) 32µg/ml, (●) ellenőrzés. A szaggatott vonalak a CFU növekedésének 3LOG10 egységnyi csökkenését jelentik a kezdeti inokulumhoz képest (fungicid aktivitás), a szaggatott vonalak a vizsgálat mennyiségi határát jelzik.
In vivo vizsgálatok
a 10 mg / kg-os LAMB volt az egyetlen gyógyszer, amely képes csökkenteni a két törzs mindegyikével fertőzött egerek veséjének gombás terhelését, mivel a csökkenés szignifikánsan magasabb, mint a többi terápiáé (p 0,04). Az AMBd és az FLC csak azoknál az egereknél volt képes csökkenteni a szövetterhelést, amelyek a két gyógyszer esetében a legalacsonyabb Mic-t mutatták, azaz 0,25 ~ g/ml az AMB és 0,5 ~ g/ml az FLC esetében (p 0,008). Az AFG esetében a gombaterhelés csökkenése szerény és alacsonyabb volt, mint az AMBd esetében, és csak az UTHSC 11-685 (P=0,002) törzs kontrollcsoportjához képest jelentősen csökkentette a vese szöveti terhelését (ábra. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 és FLC 50; cP0. 05 versus AFG 10 és FLC 50.
a szövettani vizsgálat a gombasejtek fokális infiltrációját mutatta kezeletlen állatok veséiben és AMBd-vel, FLC-vel vagy AFG-vel kezelt egerekben. A báránygal kezelt egerek veséi csak enyhe gombás inváziót mutattak. Necrosis, gyulladásos válasz vagy parenchyma változások jeleit sem figyelték meg a kontrollokban, sem a kezelt állatokban (ábra. 5).
gombás infiltráció (fekete nyíl) jelenléte a C. guilliermondii-vel fertőzött kontroll egér veseszakaszában, a fertőzés utáni 8.napon (periodikus savas Schiff festés, nagyítás 1000~). Bar=10 db.
megbeszélés
az in vitro vizsgálatok nem igazolták a C. guilliermondii izolátumok FLC vagy AFG iránti csökkent érzékenységét. A korábbi vizsgálatokkal összhangban az AMB időölési görbéi koncentrációfüggő fungicid aktivitást mutattak az összes izolátummal szemben,a 4,5,7 és az FLC fungisztatikus hatást mutatott a vizsgált koncentrációtól függetlenül.7 ismert, hogy az AMBd nagyobb hatékonyságot mutat, mint lipidkészítménye, különösen a vesében, ha mindkettőt azonos dózisban adják be.1 A farmakokinetikai vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy 0,75 mg/ttkg AMBd beadását követően az AMB Cmax értéke egerekben a szérumban 0,30 ~ g/ml volt.25 a vizsgált két izolátum egyikének AMB MIC-je azonban ennél az értéknél magasabb; ezért a magasabb koncentrációk elérése érdekében nagy adag LAMB-ot használtunk.1 valójában a bárány 10 mg/kg-os adagolása hatékonyan csökkentette mindkét törzs gombás terhelését. Ez a tény korrelált a leölési görbékkel, ahol az AMB elérte fungicid aktivitását a két in vivo vizsgált izolátummal szemben, 1 6 g/ml koncentrációban. Tudomásunk szerint ez az első olyan vizsgálat, amely kapcsolatot próbált megállapítani az ölési kinetika és az AFG és az FLC in vivo kísérleti hatékonysága között a C. guilliermondii klinikai izolátumaival szemben. Csak egy korábbi tanulmány az echinocandinokról létezik, különösen a kaszpofunginról (CFG) a C. guilliermondii disszeminált fertőzésében. Az 1 mg/kg-os CFG hatékonyan csökkentette a vese gombaterhelését a C. guilliermondii egyik törzsével fertőzött egerekben, MIC-vel 8 ~ g/ml, míg az időölésből kiderült, hogy 64 ~ g/ml koncentrációban nem sikerült fungicid aktivitást elérni.4 ezzel szemben Vizsgálatunk az AFG koncentráció-függő aktivitását mutatta, amely 32 ~ g / ml-nél fungicid aktivitást fejtett ki, amint azt korábban jelentették,17-et 24 órakor és 8 ~ g/ml-nél. Korábbi vizsgálatok arról számoltak be, hogy az AFG koncentrációja a szérumban és a vesében kb. 13 ~ g / ml volt 7 napos kezelés után, 10 mg/kg dózisban.21 itt az AFG csak szerényen tudta csökkenteni a két vizsgált törzs egyikével fertőzött neutropeniás egerek veséjének gombás terhelését, ami úgy tűnik, hogy nincs összefüggésben a két vizsgált törzs közötti alacsony AFG Mic különbséggel (1 hígítás), ami arra utal, hogy az AFG kezelésre adott válasz törzsfüggő. Hasonlóképpen, az FLC is csak kismértékben tudta csökkenteni a két törzs egyikével megtámadott egerek veséjének gombás terhelését, annak ellenére,hogy az adagolt dózis elérte a szérumkoncentrációt a Mic felett, 2 ami szintén nem volt meglepő fungisztatikus aktivitása miatt.végezetül, tanulmányunk kimutatta a bárány nagyobb aktivitását és hatékonyságát a C. guilliermondii két törzse ellen, szemben az FLC és az AFG gyenge hatásával. Mindazonáltal további vizsgálatokat kell végezni a C. guilliermondii több izolátumával, amelyek az AFG Mic-k szélesebb körét képviselik, annak értékelésére, hogy fennáll-e kapcsolat a MIC-értékek és az AFG hatékonysága között.
összeférhetetlenség
nincs nyilatkozni.
