közreműködött Paul Barber
DNS Extraction via Chelex
Chelex hírhedt, hogy olyan ingatag, mert olcsó és egyszerű. Íme néhány tipp a jó erősítéshez: 1. Néha mintáka legjobb, ha azonnal felhasználják, néha jobb, ha egy éjszakán át vár, mielőtt felhasználná őket. Kísérletezzen és találja meg, mi működik a fajának. Az eredmények taxonként változhatnak.2. A kezdeti PCR-ek végrehajtásakor végezze el a sablon soros hígítását.A PCR-ben alkalmazott Chelex DNS-extrakció mennyisége akár a PCR térfogatának fele is lehet, vagy akár 1 mikroliter 1:10 000 hígítás esetén. Úgy találom, hogy 1 mikroliter egy 1: 1 jó a legtöbb alkalmazás.3. Ha nem kap amplifikációt a PCR-től először Chelex kivonattal, ismételje meg az örvényt, centrifugálás, inkubálás, örvény, centrifugálás, üljön egy éjszakán át a fent leírt eljárás. Gyakran ez negatív PCR-munkát eredményez.
módszer
- fehérítővel sterilizáljunk egy száraz reagens spatulát és egy kis mágneses keverőrudat.
- készítsünk egy 5-10 tömeg% – os hígtrágya Chelex100 gyanta (Biorad rész 143- 3832,100-200 háló Chelex, nátrium formában) és UV sterilizált HPLC víz. Ennek leghatékonyabb módja az, ha egy 50 ml-es steril falcon csövet helyezünk egy kis főzőpohárba, és nullázzuk a skálát. Ezután adjunk hozzá 5 gramm Chelex-et, és töltsük fel 50 ml-es jelölésre vízzel.
a pontosság nem kritikus. Steril technika.
- helyezze a steril keverőt a csőbe, majd helyezze a mágneses keverőre. A Chelex gyorsan leülepszik, így ha a zagy nem keveredik jól, a koncentráció és az eredmények változóak lesznek. Tartsa a szuszpenziót jól összekeverjük, aliquot 300-500micro liter 0,6 vagy 1,6 ml Eppendorf csövek (ismét steril) és kupakot azonnal. Ha van hozzáférése a lamináris áramlás motorháztető, ez egy jó hely, hogy mindezt. Lehet, hogy használat előtt törölje le a mérleget és a keverőt 10% – os fehérítő oldattal és/vagy UV-sterilizálja.
- kapcsolja be a fűtőblokkot. Állítsa 95 C. C. töltse ki a lyukakat vízzel.
- steril csipesszel (a sterilizáláshoz többször lángoljon az alkoholégőn) távolítson el egy kis darab szövetet a mintából. Ennek a szövetdarabnak elég nagynak kell lennie ahhoz, hogy látható legyen, de nem olyan nagy, hogy könnyen látható legyen. Képzelje el, hogy egy szabványos tűzőkapocs 0,2 mm-es részét vágja le. Ez elég nagy. A túl sok szövet gátolhatja a reakciókat.
sterilizálja a csipeszeket a minták között.
- Ha elkészült, készítsen negatív Chelex-kontrollt úgy, hogy a sterilizált csipeszeket egy chelex-iszapcsőbe meríti.
- Vortex minta és chelex szuszpenzió 10-15 másodpercig.
győződjön meg róla, hogy a fedelek szorosan fel vannak pattintva a kezdés előtt.
- rövid ideig centrifugálja a mintákat nagy sebességgel mikrocentrifugában
- inkubáljuk a mintákat 20 percig 95 db C helyen
*a blokk hőmérséklete kissé csökkenhet e lépés végrehajtásakor. Ez a csökkenés normális. Ellenőrizze a csöveket inkubálás közben, hogy biztosítsahogy a fedelek nem pattan le.*
- Vortex minták ismét 10-15 másodpercig.
legyen óvatos, mivel a centrifugacső fedele leugrik. Tartsa le a fedeleket.
- Spin csövek ismét nagy sebességgel mikrocentrifugában.
- a minták használatra készek.
csak a supernate-et használja PCR-reakciókhoz. A Chlex gyöngy inaktiválja a Taq-t!
Ez a módszer engedélyével egy itt elérhető eredeti protokollon alapul.
