ATP analógok felhasználása mesterséges CDK-kkel
aminosavcseréket tartalmazó mutáns ‘Shokat’ CDK-ket hoztunk létre az ATP-kötő zsebükben konzervált terjedelmes maradékon. A CDK2 és CDK3 esetében ez egy fenilalanin-alanin csere volt a 80-as pozícióban, amelyet CDK2-nek (F80A) neveztek el. 12 ATP-analógot is szintetizáltunk annak meghatározására, hogy a mesterséges CDK-k képesek-e ezeket az analógokat in vitro rekombináns retinoblasztóma (Rb) fehérje foszforilálására használni, és megállapították, hogy az N6-(2-feniletil) – ATP (PE-ATP) a leghatékonyabban (1a Ábra és az adatok nem láthatók). Bár mind a vad típusú, mind a ciklin E-CDK2 (F80A) normál ATP-t használt a glutation-S-transzferáz (GST)-Rb fehérje foszforilálására, csak az F80A kináz használhatta a PE-ATP-t. Hasonló eredményeket kaptunk a cyclin E-CDK3-mal, de ebben az esetben az F80A mutáns már nem tudott normál ATP-t használni, bár ennek a megfigyelésnek a szerkezeti alapja nem világos (1a ábra). Ezek a vizsgálatok megerősítették, hogy a vad típusú és a módosított kinázok a kívánt ATP-specifitást mutatják.
a tervezett CDK-K jellemzése. (a) a ciklin E-CDK2/3 komplexeket vagy azok f80a-val módosított (csillagokkal jelzett) megfelelőit a transzfektált U2OS-sejt lizátumokból IMMUNPRECIPITÁLTÁK a CDK alegységen található HA-tag-en keresztül, és in vitro kinázvizsgálatoknak vetették alá 10 MHz normál ATP vagy PE-ATP analóg alkalmazásával. A GST-Rb foszforilációját foszfospecifikus anti-pS780-RB antitesttel (New England Biolabs) végzett immunoblotálással monitoroztuk. A vad típusú kinázok nem használhatják a PE-ATP-t. (B) vékonyréteg-kromatográfia – analízis feltárja az ATP hidrolízisét a sejtlizátumban, és átviszi az akceptor nukleotidokba (balra). A szabad foszfát és az ATP helyzete látható. Ezzel szemben az ATP-6-S nem hidrolizálódik a sejtlizátumokban (jobbra). (c) A Kinázvizsgálatokat vad típusú és ciklin a-CDK2 (F80A) komplexek alkalmazásával végeztük, amelyeket E. coli és GST-Rb-ből tisztítottunk 200 db ATP, ATP-6-S és PE-ATP-6-S jelenlétében szobahőmérsékleten 2 órán át. a Kinázreakciókat SDS gélelektroforézissel elemeztük, és coomassie festéssel vizualizáltuk. A GST-Rb foszforiláció mértékét a GST-Rb elektromobilitási eltolódása.
míg a mutáns CDK-k hatékonyan használták a PE-ATP-t az Rb foszforilálására in vitro, a sejtlizátumokban radioaktívan jelölt PE-ATP-t használó hasonló kísérletek kudarcot vallottak, mert a jelzett foszfátot a PE-ATP-ből egy ATPáz aktivitás hasította le a lizátumokban (az adatok nem láthatók). Ezért áttértünk az ATP-analóg tiofoszfát formájára (PE-ATP-6-S), amelyet nem hidrolizáltak lizátumok (1b ábra). Bár a kinázok gyakran kevésbé hatékonyan használják az ATP-KB-kat, mint a normál ATP, a tiofoszforilezésnek számos előnye van ebben az összefüggésben. Először is, a tiofoszfátok stabilabbak és ellenállóbbak a foszfatázokkal szemben . Másodszor, mivel a sejtekben nincsenek már létező tiofoszforilezési események, a tiofoszfát címkézése egyedülálló markereket biztosít a mutáns kináz által foszforilezett fehérjék számára. Végül a tiofoszfátcsoport hasonló kémiai tulajdonságokkal rendelkezik, mint a szulfhidrilcsoport, és kémiai módosításokra alkalmas. Baktériumokból kinyertük és megtisztítottuk az oldható vad típusú és ciklin a-CDK2 (F80A) komplexeket, és egy hasonló RB kináz vizsgálatot végeztünk, hogy teszteljük a PE-ATP-6-S alkalmazásának képességét. Amint azt az 1C ábra mutatja, bár mindkét kináz használhatja az ATP – t vagy az ATP-kb-s-t a GST-Rb fehérje foszforilálására (amint azt az elektromobilitás eltolódása jelzi), csak az f80a mutáns használhatja a PE-ATP-kb-s-t.
A tiofoszforilezett peptidek egylépéses tisztítása
a mesterséges CDK-k és ATP analógok használata megkönnyíti a nagyon specifikus szubsztrát foszforilációt: a következő kihívás az, hogyan lehet azonosítani őket egy komplex lizátumon belül. Arra törekedtünk, hogy a tiofoszfát címkéket kovalens módon rögzítsük és dúsítsuk a tiofoszforilezett peptideket a foszforilezés és a lizátumok emésztése után. A legfontosabb probléma azonban a tiofoszfopeptidek és a ciszteint tartalmazó peptidek kémiai megkülönböztetése volt. Bár a tiofoszfopeptidek dúsítására kemoszelektív módszert írtak le, a ciszteinmaradványok túlnyomó bősége egy komplex fehérje keverékben megnehezíti ezt a megközelítést . Egyszerű capture-and-release módszert alkalmaztunk a tiofoszforilezett peptidek szelektív izolálására a tripszinizált sejtlizátumokban (2a ábra). A lizátumban lévő fehérjéket in vitro foszforiláltuk ciklin a-CDK2 (F80A) és PE-ATP-6-S-vel.a fehérjeelegyet ezt követően megemésztettük , és a kapott peptideket tiopropil-Szefaróz-6B-vel, egy aktivált diszulfidgyantával kevertük, amely diszulfidcsere-reakció útján befogja mind a ciszteint tartalmazó peptideket, mind a tiofoszfopeptideket. Mivel a hagyományos ditiotreitol (DTT) elúció mindkét típusú kötött peptidet felszabadítja, a gyantához kötött tiofoszfát peptidek és a cisztein tartalmú peptidek közötti minőségi különbségeket használtuk fel a foszforotiolátszulfid-kötésnél, illetve az alkil-diszulfid-kötésnél. Magas pH-értékek esetén a foszforotiolát-szulfid kapcsolat hidrolizálódik, az alkil-diszulfid pedig sértetlen marad . A gyanta erős bázissal (például nátrium-hidroxiddal) történő kezelése specifikusan tiofoszfopeptideket szabadít fel (és azokat normál foszfopeptidekké alakítja), de a ciszteint tartalmazó peptideket nem, a foszforotiolátszulfid-kötődés hidrolizálásával (2b ábra). Mivel a ciszteinen keresztül kötött peptidek az utolsó lépésben nem eluálódnak, nem tudjuk visszanyerni a ciszteint tartalmazó tiofoszfopeptideket. Ezenkívül az elúció a tiofoszfát-aláírás elvesztését eredményezi a tiofoszfopeptid foszfopeptiddé történő átalakításával. Tiofoszfopeptid izolációs módszerünk szerényen különbözik Blethrow et al. a tiofoszfopeptideket alkilezés (jódacetamid gyanta) helyett diszulfidcserélő kémiával (diszulfidgyanta) rögzítjük, és oxidáció helyett bázishidrolízissel szelektíven eluáljuk őket.
tiofoszfopeptidek egylépéses tisztítása. a) A tiofoszfospeptid izolálásának Általános sémája. A fehérjéket ciklin a-CDK2-vel (F80A) és PE-ATP-6-S-vel jelöltük, és triptikus emésztésnek vetettük alá. A kapott peptideket diszulfidgyöngyökkel kevertük, amelyek mind a tiofoszfopeptideket, mind a ciszteint tartalmazó peptideket befogják. A gyöngyöket ezután bázikus oldattal kezeltük, hogy csak a foszfopeptideket szelektíven szabadítsuk fel. (b) a tiofoszfopeptid szelektivitás alapjául szolgáló kémia. Mind a tiofoszfát, mind a cisztein részek reaktív tiolcsoportokat tartalmaznak, amelyeket diszulfid gyöngyök kovalensen elfoghatnak. Magas pH-értékeknél a foszforotiolát-szulfid kötések (a felső nyíl közelében) hidrolizálódnak, hogy lehetővé tegyék a gyöngyhöz kötött peptidek felszabadulását, míg az alkil-diszulfid kötések (az alsó nyíl közelében) stabilak, így a peptidek megmaradnak a gyöngyökön. Megjegyezzük, hogy a foszforotiolátszulfid kötés hidrolízise során a tiofoszfát normál foszfáttá alakul.
ennek a megközelítésnek a megvalósíthatóságát tesztelve foszforileztük a GST-Rb-t ciklin a-CDK2 (F80A) és PE-ATP-6-S-sel, és tisztítási eljárásunkat a reakcióelegy tripszin emésztésére alkalmaztuk. Az izolált peptideket elektrospray tandem tömegspektrometriával (ESI-MS/MS) elemeztük ioncsapda tömegspektrométerrel. A peptideket úgy azonosítottuk, hogy a tandem tömegspektrumokat egy humán fehérje szekvencia adatbázishoz illesztettük (GST-Rb szekvenciával hozzáadva) a SEQUEST szoftver segítségével . A GST-Rb szubsztrát öt ciszteint, valamint hét SP/TP helyet tartalmaz, amelyek a CDK foszforilezésének kedvelt helyei . Több foszfopeptidet használtunk, amelyek csak és az összes várható foszforilációs helyet tartalmazzák (1.táblázat). Ezenkívül nem találtunk ciszteint tartalmazó peptideket és nagyon kevés nem specifikus peptidet. Ez biztosította az elv bizonyítékát nagyszabású vizsgálatainkhoz.
humán ciklin a-CDK2 szubsztrátok azonosítása sejtlizátumokban
célunk az volt, hogy azonosítsuk a lehetséges a ciklin a-cdk2 szubsztrátok proteom széles skálán. A minta komplexitásának csökkentése érdekében a HEK293 sejtek teljes sejtlizátumát 11 frakcióra frakcionáltuk ioncserélő kromatográfiával és ammónium-szulfát kicsapással (1.kiegészítő adatfájl). Ezután in vitro kináz vizsgálatokat végeztünk minden frakción. Pozitív kontrollként kis mennyiségű GST-Rb-t is hozzáadtunk minden reakcióhoz. Miután a reakcióelegyet tripszinnel megemésztettük, tisztítási protokollunkat alkalmaztuk a tiofoszfopeptidek izolálására a peptidkeverékekből. A kinyert peptideket folyadékkromatográfiás MS/MS elemzésnek és adatbázis-keresésnek vetettük alá. A lizátumfrakciók mindegyikéből különböző számú peptidet és legalább egy RB foszfopeptidet nyertünk ki (további adatfájl 2).
a CDK-k prolin-irányított módon foszforilálják a fehérjéket szerinre vagy treoninra, és számos tanulmány alátámasztja azt az elképzelést, hogy az S/T-P-X-R/K motívum képviseli a CDK konszenzus motívumát. A foszfopeptidekből összesen 203 fehérjét azonosítottunk: 180 jelöltet foszforiláltunk SP vagy TP motívumokban (prolin-irányított; kiegészítő adatfájl 3). Ezek a jelölt szubsztrátok a biológiai folyamatok széles skáláját képviselik, beleértve a sejtciklus-szabályozást, a DNS-és RNS-anyagcserét, a transzlációt és a sejtszerkezeteket (3.ábra). Összesen 96 a prolin által irányított helyek 222-ből (43%) megfelelt az ismert CDK konszenzusnak (pozitív töltésű maradékkal a +3 helyzetben). Érdekes módon a prolin által irányított helyek körülbelül 24%-a (53/222) pozitív töltésű maradékot tartalmazott a +4 vagy +5 helyzetben, ami arra utal, hogy ezt a motívumot a CDK2 is előnyben részesítheti. Valóban, Blethrow et al. azt is megjegyezte, hogy jelentős számú ciklin B-CDK1 szubsztrátok nem konszenzusos helyeket tartalmaznak. A nem konszenzusos helyeket tartalmazó peptidek esetében azt tapasztaltuk, hogy a megfelelő fehérjék körülbelül 50% – a hordozott legalább egy K/RXL-t vagy K/Rxlx-t (ahol a 6X egy nagy hidrofób maradék és X bármely aminosav) a foszforilációs helyektől távol eső motívumot, és szinte mindegyik legalább egy minimális RXL-motívumot hordozott (további 3.adatfájl). Ez összhangban van azzal a jól megalapozott elképzeléssel, hogy ezek a motívumok elősegítik a ciklin a-CDK2 szubsztrátokhoz való kötődését . A CDK konszenzusos motívumokkal történő foszforilációk kiválasztása mellett 28 olyan fehérjét azonosítottunk, amelyek korábban CDK szubsztrátként szerepeltek (vastag betűvel jelölve a 3 .további adatfájlban). Így jelöltjeink közel 15% – át korábban CDK-célpontként találták meg, ami tovább erősíti azt az elképzelést, hogy módszereink elfogták és gazdagították a CDK2 szubsztrátokat. Végül az általunk talált foszforilációk 43%-át korábban azonosították nagyszabású, in vivo foszfoproteom elemzések, jelezve, hogy ezek a foszforilációk nem korlátozódnak a lizátum körülmények között .
a fehérjék funkcionális kategóriák szerinti osztályozása. A számok az egyes kategóriákban azonosított fehérjéket jelzik.
mind a tanulmányaink, mind a Blethrow et al. hasonló foszfopeptid izolációs sémákat és kapcsolódó ciklin-CDK-ket használtunk, és arra számítottunk, hogy mindkét vizsgálat során jelentős átfedés lehet A szubsztrátokban. Valójában a ciklin B-CDK1 szubsztrátok közel 50%-át (30/68) találtuk a ciklin a-CDK2 jelöltek listáján; így ezek a módszerek robusztusak és reprodukálhatók (további adatfájl 4). A két lista között azonban jelentős különbségek is vannak, és ezek valószínűleg számos tényezőből adódtak, beleértve az eljárási különbségeket, a különböző sejttípusokat, a hiányos peptid-azonosítást MS-vel, valamint a ciklin és/vagy kináz alegységek által biztosított szubsztrát-specifitást. Ezen különbségek némelyike a ciklin a-CDK2 és a ciklin B-CDK1 eltérő biológiai funkcióit is tükrözi. Például kilenc fehérjét találtunk, amelyek részt vesznek a fehérje transzlációban és / vagy a riboszóma működésében, de ezek közül a fehérjék közül egyiket sem találták meg a ciklin B-CDK1-vel, annak ellenére, hogy viszonylag nagy mennyiségben vannak jelen.
bár számos ismert CDK2 szubsztrátot azonosítottunk, nem azonosítottunk néhány korábban leírt CDK2 szubsztrátot. A fent felsorolt tényezők némelyike szintén figyelembe veheti az ismert CDK2 szubsztrátok megtalálásának elmulasztását elemzéseinkben. Ezenkívül az endogén CDK-k által már foszforilált szubsztrátok in vitro nem lettek volna tiofoszforilezve. Az is lehetséges, hogy egyes fehérjék nem oldódtak a lizátum előkészítése és/vagy az ultrahangos lépés során, és kizárták elemzéseinkből. Végül, lehetséges, hogy a kináz reakciót megelőző frakcionálási eljárások nagy fehérjekomplexeket zavartak meg, és hogy a CDK2 által csak ezen komplexek összefüggésében foszforilált fehérjéket nem fedezzük fel módszereinkkel.
a ciklin A-nak és a CDK2-nek megfelelő négy foszfopeptidet, valamint 27 további foszfopeptidet találtunk nem prolin irányított helyekkel (további 5.adatfájl). Gyanítottuk, hogy ezek a foszfopeptidek a ciklin a-CDK2 auto-foszforilációjából és más kinázok háttér-foszforilációjából származnak, és mások hasonló háttér-foszforilációról számoltak be . Ezeknek a lehetőségeknek a tesztelésére kontroll kináz reakciót hajtottunk végre ciklin a-CDK2 (F80A) és PE-ATP-kb-s alkalmazásával, sejtlizátum hozzáadása nélkül, és a négy ciklin a-CDK2 peptidből hármat kinyertünk (további adatfájl 5). Továbbá, amikor hasonló ‘csak kináz’ reakciót hajtottunk végre a 62P-ATP jelenlétében, megfigyeltük a 32P beépülését mindkét fehérjébe dózisfüggő módon (további adatfájl 6). Ezek a kísérletek megerősítették, hogy az eredeti vizsgálatokban a ciklin a-CDK2 háttér-auto-foszforilációja volt.
kontroll kináz reakciókat is végrehajtottunk a lizátumfrakciók, a GST-Rb ‘spike-in’ és a PE-ATP-ons alkalmazásával ciklin a-CDK2 hozzáadása nélkül. Ezek a No-kináz kontrollreakciók a listánkon szereplő 27 nem prolin irányított foszfopeptid közül 7-et foszforiláltak (5. Kiegészítő adatfájl), ami arra utal, hogy ezeknek a foszfopeptideknek a többsége, ha nem az összes, kinázok háttérfoszforilációjából származott, amelyek korlátozott mértékben képesek használni az ATP analógot. Például ezeknek a peptideknek a többsége savas maradék-irányított foszforilációs helyeket tartalmaz, amelyek kazein-kináz 2 motívumok. Kazein kináz 2 egyedülálló, hogy tudja használni a GTP, valamint ATP; így az aktív hely elhelyezésére terjedelmes ATP analógok, mint például a PE-ATP . Fontos, hogy ezekből a kontroll kísérletekből nem nyertünk Rb foszfopeptideket, jelezve, hogy a vizsgálatainkban nem volt nem specifikus CDK aktivitás. 44 nem módosított peptidet is kinyertünk, amelyek közül 12 tartalmazott cisztein maradványokat. Ezeknek a peptideknek a többsége több lizátumfrakcióból származott (2.Kiegészítő adatfájl). Gyanítjuk, hogy ezek a peptidek alacsony szintű, nem specifikus kötődéséből adódtak a gyantához a szigorú mosási körülmények ellenére, valamint a ciszteint tartalmazó peptidek esetében az alkil-diszulfid kötődés kis mennyiségű hidrolíziséből az eluálási lépés során. Összefoglalva, módszereink rendkívül szelektívek voltak, és tanulmányaink meglepően nagy csoportot azonosítottak ciklin a-CDK2 szubsztrátok jelöltjeként, amelyek többségét korábban nem azonosították CDK célpontként.
A jelölt szubsztrátok érvényesítése ciklin a-CDK2 célpontként
számos stratégiát alkalmaztunk a listánkban szereplő új jelöltek ciklin a-CDK2 szubsztrátként történő érvényesítésére. Mivel a fehérje azonosítás peptidszekvenciákon alapult, azzal kezdtük, hogy megerősítettük, hogy a ciklin a-CDK2 három teljes hosszúságú és natív jelöltet foszforilált, amelyeket 293 sejt (EF2, TRF2 és RAP1) epitóp címkéin keresztül immunprecipitáltak. Mivel ezek a fehérjék nem voltak jelen a ciklin B-CDK1 listán, meghatároztuk, hogy a ciklin B-CDK1 is foszforilálja-e őket. Mindegyik CDK2 jelöltet mind a ciklin a-CDK2, mind a ciklin B-CDK1 foszforilálta, bár az EF2 kisebb mértékben foszforilált, mint a TRF2 vagy a RAP1 (4a ábra). A TRF2-t, a RAP1-et és az rl12 riboszomális fehérjét GST-fúzióként is kifejeztük, és Escherichia coli-ból megtisztítottuk őket. Amikor ciklin a-CDK2-t használtunk a TRF2 és RAP1 foszforilálására in vitro, a fehérjék erősen foszforiláltak voltak, és az MS elemzések azt mutatták, hogy ezek a foszforilációk ugyanazon a helyen fordultak elő, amelyet eredetileg azonosítottunk (4b ábra). Ciklin a-CDK2-t és ciklin B-CDK1-et is használtunk a GST-RL12 foszforilálásához, és azt találtuk, hogy mindkét CDK in vitro foszforilálta az RL12-t is (4c ábra). Ezek a vizsgálatok tehát megerősítik, hogy a képernyőn azonosított peptidek olyan fehérjéket képviselnek, amelyeket a ciklin a-CDK2 foszforilezhet, legalábbis in vitro. Bár minőségi különbségeket találtunk a ciklin a-CDK2 és a ciklin B-CDK1 specifikus fehérjék foszforilálására való képességében, mindkét esetben a jelölteket mindkét CDK foszforilálta. Mivel az enzimkészítmény, amelyet ezekben a vizsgálatokban használtunk, felesleget tartalmazott szabad CDK2 (F80A), figyelembe vettük annak lehetőségét, hogy egyes szubsztrát foszforilációk az endogén ciklinek CDK2 (F80A) asszociációjából származhatnak, amelyek vagy monomerek voltak, vagy amelyek disszociálhattak a ciklin A-tól a vizsgálati körülmények között. Megállapítottuk, hogy ezekben a kivonatokban a cyclin B-CDK2 (F80A) aktivitás mennyisége elhanyagolható volt a cyclin a-CDK2 (F80A)-hoz képest, és nem találtunk cyclin E-CDK2 (F80A) aktivitást (további adatfájl 7). Mindazonáltal nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy egyes peptideket a CDK2 (F80A) foszforilált egy endogén ciklinnel komplexben, és az a ciklin bármely jelölt szubsztrátjának specifitását a CDK2-t aktiváló más ciklinekkel szemben validálni kell az alábbiakban leírtak szerint.
szelektív jelölt CDK2 szubsztrátok In vitro validálása. (a) A HEK293 sejteket átmenetileg transzfektáltuk a FLAG-tagged EF2, TRF2 és RAP1-et expresszáló vektorokkal. Anti-FLAG antitest immunprecipitátumokat in vitro ciklin a-CDK2-vel vagy ciklin B-CDK1-vel foszforiláltunk a-32P-ATP jelenlétében (bal felső panel). Párhuzamos reakciókban a H1 hisztont kontrollként foszforiláltuk, hogy normalizáljuk a ciklin a-CDK2 és a ciklin B-CDK1 aktivitását (jobb oldali panel). A’ C ‘a’ csak kináz ‘reakciót jelöli transzfektált szubsztrátok nélkül (bal panel) és a’ nem kináz ‘ reakciót (jobb panel). A fehérjemintákat SDS PAGE segítségével választottuk el, majd a géleket PVDF membránokra helyeztük át. A foszfo-jeleket autoradiográfiával vizualizáltuk. A membránt ezt követően Anti-FLAG antitesttel (Sigma-Aldrich) vizsgálták, hogy megerősítsék a foszfo-jel csapágy sávjának identitását (bal alsó panelek). A csillag a kereskedelmi ciklin B-CDK2 készítmény nem specifikus sávját képviseli. (b) A Kinázreakciót úgy végeztük, hogy a vad típusú ciklin a-CDK2 kináz jelenlétében vagy hiányában szubsztrátként a GST-TRF2, GST-RAP1, GST-Rb (pozitív kontroll) és GST (negatív kontroll) enzimeket használtuk. A reakciókat az SDS PAGE, majd a Coomassie festés és az autoradiográfia (bal oldali panel) vizualizálta. Hasonló kinázvizsgálatot végeztünk vad típusú ciklin a/CDK2 és ATP-ons alkalmazásával, majd ezt követően foszfopeptid izolációs sémának vetettük alá. Az MS-elemzés megerősítette, hogy a TRF2 és a RAP1 foszforilációja pontosan azokon a helyeken történt, amelyeket a képernyőn azonosítottunk, egy további RAP1-Tel (jobb oldali panel). (c) A Kinázvizsgálatot a következők alkalmazásával végeztük: 62P-ATP, ciklin a-CDK2 vagy ciklin B-CDK1 növekvő mennyiségű tisztított GST-RL12-vel. A mintákat SDS PAGE segítségével választottuk el, majd a gélt coomassie-val (Alsó panel) festettük, majd autoradiográfiával (felső panel). A’ C ‘a’ csak kináz ‘ reakciókat jelöli transzfektált szubsztrátok nélkül.
az RL12 mint vivoCDK2 szubsztrát validálása
a fenti vizsgálatok számos új jelöltet validáltak, akiket a képernyőn CDK2 szubsztrátként azonosítottak in vitro. Annak meghatározására azonban, hogy egy új szubsztrátot is FOSZFORILÁL-e a CDK2 in vivo, átfogóbb elemzést végeztünk a riboszomális fehérje RL12. Először az epitóppal jelölt ciklin a-CDK2 és rl12 immunprecipitátumait kevertük emberi sejtekben, a 32P-ATP jelenlétében, és azt találtuk, hogy a ciklin a-CDK2 foszforilálta az RL12-T in vitro (5a ábra). A foszforiláció nagyrészt megszűnt egy mutáns RL12-ben, ahol az azonosított foszfozerin S38-at alaninnal helyettesítették, és helyreállt, amikor az S38-at treoninnal helyettesítették (5b ábra). Ezután foszfopeptid leképezést használtunk az S38-at tartalmazó peptid azonosítására, és megerősítettük, hogy a CDK2 in vitro közvetlenül foszforilálta (5c ábra). Annak tesztelésére, hogy az RL12 in vivo is foszforilálódik-e CDK2-függő módon ugyanazon a helyen, metabolikusan jelöltük a sejteket 32P-ortofoszfáttal és immunprecipitált vad típusú vagy RL12-S38A sejtekből, amelyek túlexpresszálják a ciklin E-CDK2-t, katalitikusan inaktív ciklin E-CDK2-t vagy a CDK inhibitor p21-et (az endogén CDK-k gátlására) . Mivel nem vizsgálhatjuk az endogén RL12 foszforilációt a megfelelő anti-RL12 antitest hiánya miatt, ezek a vizsgálatok a méhen kívüli RL12 foszforilációját vizsgálták in vivo (ezek a transzfekciós körülmények az RL12 mRNS körülbelül öt – tízszeres túlexpressziójához vezettek (további adatfájl 8). Megállapítottuk, hogy a vad típusú RL12, de az RL12-S38A nem foszforilált in vivo (5D ábra). Ez a foszforiláció fokozódott a ciklin E-CDK2-t túlexpresszáló sejtekben, de az inaktív ciklin E-CDK2-t nem, a P21 CDK-gátlót (amely gátolja az endogén ciklin-CDK-ket) túlexpresszáló sejtekben pedig csökkent; 5D ábra). Végül a jelzett sejtekből immunprecipitált rl12 fehérje foszfopeptid leképezését és foszfoamino sav analízisét alkalmaztuk, és megerősítettük, hogy az rl12 foszforiláció ciklin E-CDK2 által in vivo az S38-on is megtörtént (5e ábra). Rl12 S38 foszforilációról in vivo foszfoproteom vizsgálatokban is beszámoltak .
RL12 foszforilezése in vitro és in vivo. (a) HA-tagged RL12 vagy vektor kontroll (‘vec’) átmenetileg transzfektált U2OS sejtekbe és immunprecipitált 12ca5 antitest alkalmazásával. A ciklin a-CDK2 komplexeket átmenetileg külön-külön is expresszáltuk U2OS sejtekben, és ciklin A elleni antitest alkalmazásával immunprecipitáltuk. a Kinázvizsgálatokat rl12 (vagy kontroll) immunprecipitátum alkalmazásával végeztük ciklin a-CDK2 immunprecipitátummal vagy anélkül, ha jelen volt a 62P-ATP. B) hasonló vizsgálatokat végeztek vad típusú (wt) és a jelzett RL12 foszfozit mutánsokat tartalmazó ciklin a-CDK2 és RL12 immunprecipitátumokkal. A csillag az antitest könnyű láncát jelöli. (c) az rl12 izotóppal jelölt vad típusú (bal oldali panel) és s38t mutáns (jobb oldali panel) Foszfopeptid feltérképezése és foszfoamino-sav analízise. (d) vad típusú RL12, RL12-S38A, vagy vektor kontroll átmenetileg együtt transzfektált ciklin E-CDK2, katalitikusan inaktív (dn) ciklin E-CDK2, vagy p21. Az összes sejtet 32P ortofoszfát címkézésnek vetettük alá. Az RL12-t sejtlizátumokból immunprecipitálták, majd SDS PAGE-vel, majd autoradiográfiával vizualizálták. (e) Foszfopeptid leképezési analízist is végeztek a D) pontban bemutatott radioaktívan jelölt RL12-N. Az alsó nyíl egy in vivo kimutatott második és kisebb foszforilációs helyet mutat.
bár az eddig tesztelt új jelölteket validáltuk azzal, hogy megmutattuk, hogy a teljes hosszúságú fehérjéket a CDK2 foszforilálja, a listánkon szereplő néhány jelölt valószínűleg nem lesz fiziológiailag releváns ciklin a-CDK2 szubsztrátok. Például a kináz reakciókat lizátumokban végeztük, és az in vivo szubcelluláris kompartmentalizáció korlátozhatja a CDK2 hozzáférését egyes jelöltekhez. Sőt, lehetséges, hogy más sejtkinázok vagy redundánsak, vagy fontosabbak, mint a CDK2 az egyes szubsztrátok tekintetében in vivo. Ezért kritikus, hogy a jelölteket szigorúan, a lehető legélénkebb kontextusban értékeljék. E cél felé a folyamatban lévő vizsgálatokban géncélzási megközelítést alkalmazunk ezen foszforilációs helyek egy részének mutálására az endogén génekben fiziológiai jelentőségük tanulmányozására.
