az incPRINT a sejtes RNS–fehérje kölcsönhatásokat méri. interakciós intenzitás a Xist(a)-MS2 és a jelzett faktorok között, RNase-kezeléssel és anélkül. Két biológiai ismétlésből származó adatok átlagként vannak feltüntetve 6 S.D.; az RLU relatív könnyű egységek. B interakciós intenzitás a Xist (a) – MS2 és a jelzett tényezők között. A sejten belüli interakciós értékeket egy standard incPRINT kísérletben mértük. Az In vitro interakciós értékek a megjelölt fehérjék és a Xist(a)-MS2 RNS külön transzfekciójából származnak, amelyeket a sejtek lizálása után kombináltak az interakciós elemzésekhez. Az egyes kísérletekre vonatkozó két biológiai replikáció adatait átlagként mutatjuk be 6 s. d.; az RLU relatív könnyű egységek. c szórási diagram, amely bemutatja a Xist(a)-MS2 kölcsönhatási intenzitás korrelációját, amelyet két biológiai replikáció Nanoluk luciferáz lumineszcenciája határoz meg. A bemutatott medián-normalizált értékek. A négyzet alakú Pearson-korrelációs együttható látható. d szórási diagram, amely bemutatja a zászlóval jelölt fehérje expressziós szintek korrelációját, amelyet az Anti-FLAG ELISA határoz meg két biológiai replikátumból. A bemutatott medián-normalizált értékek. A négyzet alakú Pearson-korrelációs együttható látható. e Scatter grafikon, amely az RNS–fehérje interakció intenzitását és a fehérje expressziós szintjét mutatja. Az RLU relatív könnyű egységek.

a vizsgált RNS címkézéséhez használt MS2 szárhurkok számának optimalizálása érdekében a Xist(a)-t két, négy, hat, tíz vagy 24 MS2 szárhurokkal fuzionáltuk, és a kontrollfehérjékkel való kölcsönhatásukat egy kis léptékű incPRINT kísérletben teszteltük. A lumineszcencia intenzitásának növekedése közvetlenül korrelált az MS2 szárhurkok megnövekedett számával, akár tíz szárhurokig, az EGFP kontrollhoz való kötődés jelentős növekedése nélkül (kiegészítő ábra. 1b). Ezért az összes későbbi incPRINT kísérletben az RNS-eket tíz MS2 szárhurokkal címkézték.

annak megállapításához,hogy az incPRINT által detektált RNS–fehérje kölcsönhatások valóban előfordultak-e a sejtekben,vagy csak In vitro merültek fel a sejt lysis16, 17, 18 után, két független kísérlet lumineszcencia jelét mértük és hasonlítottuk össze. Az első kísérletben a Xist (a)-MS2 RNS-t és a FLAG-tagged tesztfehérjéket ugyanabban a sejtpopulációban transzfektálták, mint a fentiekben leírtuk. A második kísérletben a Xist (a)-MS2 RNS–t és a FLAG-tagged tesztfehérjéket külön-külön transzfektáltuk két különböző sejtpopulációban, és csak a sejtlízis lépés után egyesítettük, lehetővé téve az RNS-fehérje komplexek képződését kizárólag in vitro (kiegészítő ábra. 1c). Azt találtuk, hogy a kölcsönhatásokat előnyösen akkor detektáltuk, amikor a Xist (a)-MS2 RNS-t és a FLAG-tagged fehérjéket együtt transzfektáltuk (a standard incPRINT feltétel; Fig. 2b). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy amikor az incprint interakciós jelet észlelt, a sejtekben képződött RNS–fehérje komplexekből származott, míg az RNS–fehérje komplexek sejt utáni lízisének asszociációja elhanyagolható háttérként jelent meg incPRINT-specifikus körülmények között (ábra. 2b). Ezek a kísérletek együttesen megállapítják, hogy az incPRINT lumineszcencia leolvasással méri a sejtes RNS–fehérje kölcsönhatásokat.

az RNS-fehérje kölcsönhatások nagy áteresztőképességű detektálása

az incPRINT skálázhatóságának teszteléséhez az RNS–fehérje kölcsönhatások szisztematikus azonosításához ~3000 FLAG–tagged humán fehérjéből álló testreszabott könyvtárunkat kérdeztük ki (beleértve a 6500 ismert RBPs10, 11,1300 transzkripciós faktort12 és a 170 kromatin-asszociált fehérjét) Xist(a)-MS2-vel. Az incPRINT által azonosított RNS-fehérje kölcsönhatások megbízhatóságának megerősítése érdekében minden kölcsönhatást biológiai duplikátumban vizsgáltunk, két lumineszcencia (RNS–protein interakciós intenzitás) és két ELISA (test protein expression level) értéket generálva minden vizsgált RNS–protein pár esetében. Az elégtelen szinten expresszált fehérjék kiszűrése után (lásd a ‘módszerek’ részt) 2405 fehérje interakciós adatait elemeztük. az incPRINT reprodukálhatóságát a biológiai Duplikátumok korrelációs pontszámainak kiszámításával értékeltük mind a lumineszcencia szempontjából (ábra. 2c; R2 = 0.87) és ELISA jelek (ábra. 2d; R2 = 0,99). Nevezetesen, nem találtak összefüggést a lumineszcencia és az ELISA értékek között, ami azt jelzi, hogy az interakciós intenzitás nem pusztán a fehérje expressziós szintjének tükröződése (ábra. 2e). Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy az incPRINT egy skálázható, nagy áteresztőképességű módszer, amely reprodukálhatóan méri az RNS-fehérje kölcsönhatásokat a sejtekben.

az incPRINT azonosítja az alacsonyan expresszált RNS-ek proteomját

ezután megpróbáltuk tesztelni, hogy az incPRINT képes-e robusztusan azonosítani az alacsony endogén szinten expresszált transzkriptumokkal kölcsönhatásba lépő fehérjéket. Az alacsony kópiaszámú RNS-ekkel társított fehérjék azonosítása általában kihívást jelent az RNS affinitás-befogás-MS megközelítések alkalmazásakor, az RNS-tisztítások tipikusan alacsony hatékonysága és a tömegspektrometriához szükséges nagy mennyiségű anyag miatt. Mivel a Firre funkcionálisan fontos lncrns, amely magasabb rendű nukleáris architektúrát modulál a kromoszómák19 között, és meglehetősen alacsony endogén bőséggel rendelkezik (sejtenként 20 molekula, RNS-Seq adatok alapján különböző egérszövetekben), az RBP-interaktómáját az incPRINT segítségével értékeltük. Az MS2 által megjelölt Teljes hosszúságú Firre-átirat az endogén FIRRE-nél 40-szer nagyobb volt az incprinthez használt HEK293T sejtekben (kiegészítő ábra. 2a). Amint arról az endogén transzkriptum19 esetében beszámoltunk, a Firre-MS2 előnyösen lokalizálódott a magban (kiegészítő ábra. 2b). Kihallgatása a könyvtár ~3000 fehérjék, incPRINT azonosított egy sor specifikus fehérjék Firre interaktorok (ábra. 3a, piros pontok; kiegészítő adatok 1), míg a fehérjék többsége nem lépett kölcsönhatásba a Firre-vel (ábra. 3a, szürke pontok; kiegészítő adatok 1). Fontos, hogy az incPRINT azonosította mind az ismert, mind az új Firre-kölcsönható fehérjéket. A Ctcf-et és a HNRNPU-t, amelyekről korábban két független tanulmány számolt be,hogy kötődnek a Firre-hez és fontosak a funkciójához19, 20, az incPRINT is azonosította (ábra. 3a). Az új Firre interaktorok kötésének érvényesítéséhez elemeztük az ECLIP data21 kódolást. Az eCLIP adatok, amelyek hét incPRINT által azonosított Firre-interakciós RBP-hez állnak rendelkezésre, megerősítették a Firre-hez való kötődésüket a K562 sejtvonalban, tovább igazolva az incPRINT módszert (kiegészítő ábra. 2C; kiegészítő adatok 2). A Firre nukleáris szervezetben19 betöltött szerepével összhangban az incPRINT által azonosított Firre interaktorok egy csoportja kromatin-asszociált fehérjék voltak, beleértve a CHD1, POU5F1, JARID2, EPC1, SATB1, MECP2, AEBP2 és CTCF (kiegészítő adatok 1). A fehérje domén elemzések azt mutatták, hogy a Firre-kölcsönható fehérjék szignifikánsan dúsultak az RNS felismerési motívum (RRM) szempontjából (ábra. 3b; kiegészítő adatok 3).

az incPRINT azonosítja a Firre–kölcsönható fehérjéket. a normalizált Firre-fehérje kölcsönhatási intenzitás két biológiai ismétlésből átlagolva, növekvő sorrendben rendezve. A vízszintes szaggatott vonal az interakció intenzitásának határát jelenti, amelyet a Firre interaktorok osztályozásához használnak. A piros pontok Firre-kölcsönható fehérjék; a szürke pontok olyan fehérjék, amelyek nem kötődnek a Firre-hez. Azok a fehérjék, amelyekről ismert, hogy kötődnek a Firre-hez, vagy azok, amelyek kölcsönhatását validálták az ECLIP data21 kódolásában. Az adatok normalizálásához lásd a ‘módszerek’ részt. Az RLU relatív könnyű egységek. B ábra, amely megmutatja az incprint Firre-interakciós partnerek számát, amelyek egy adott Pfam domaint tartalmaznak a domain gazdagításának −log10(P) – jével szemben. A P értékeket az arányteszt segítségével számítottuk ki. Kék színnel vannak feltüntetve azok a domének, amelyek legalább háromszor vannak ábrázolva a lehúzott frakcióban, amelyek korrigált P < 0,05. Az RRM – 1 A PFAM pf00076 doménre utal. Az összes elemzett Pfam doménhez, lásd a kiegészítő adatokat 3.

annak megállapításához, hogy az incPRINT-hez az alacsony endogén szintű RNS-hez kötődő fehérjék sikeres azonosításához szükséges-e az RNS túlzott expressziója, egy sor fehérjét teszteltünk a Firre-MS2 különböző koncentrációival, a fent leírt túlzott expressziótól a hek293t sejtekben az endogén FIRRE-hez hasonló szintekig (kiegészítő ábra. 2d, e). Míg az RNS túlexpressziója magasabb interakciós pontszámokat eredményezett, lehetővé téve azok jobb elválasztását a háttér pontszámoktól, a luciferáz jel erősen kimutatható volt a háttérjel felett, amikor a Firre-MS2 hígításait alkalmazták (kiegészítő ábra. 2d). Fontos, hogy ez a jel nem kapcsolódott a tesztfehérje expressziós szintjéhez (kiegészítő ábra. 2e). Ezek az adatok együttesen bizonyítják az incPRINT hasznosságát az alacsony endogén szinten expresszált transzkriptumokhoz kapcsolódó fehérjék azonosításában.

az incPRINT azonosítja az RNS-régió-specifikus interakciós partnereket

mivel sok lncrns moduláris állványként működik, lehetővé téve a specifikus RBP-k diszkrét RNS-domainekhez való kötődését1,5, megpróbáltuk tesztelni, hogy az incPRINT lehetővé teszi-e az RNS-domén-specifikus kölcsönhatások azonosítását. Ideális proof-of-principle molekula az lncrns Xist, mivel létfontosságú szerepet játszik az emlősök X-kromoszóma inaktiválásában (XCI)22,23, valamint moduláris felépítésében és funkciójában. A 17 kb hosszú Xist transzkriptum több konzervált szekvencia régiót tartalmaz (a-f ismétlésnek nevezzük), amelyek különböző funkciókat látnak el az XCI folyamat során, beleértve a géncsendesítés megindítását (az a ismétlés), az X – inaktív állapot fenntartását (az F-és B – ismétlés), valamint a Xist megfelelő kromoszómális lokalizációját és fokális felhalmozódását (a C-és E-ismétlés)13,24,25,26,27,28,29,30,31,32 (ábra. 4a). Ezenkívül számos független tanulmány korábban azonosított és validált egy sor funkcionális fehérje kölcsönhatást a teljes hosszúságú Xist7-vel,14,15,26,28,33,34,35. Igyekeztünk alkalmazni incPRINT három konzervált régiói egér Xist, azaz Xist(A), Xist(F), és Xist (C) (ábra. 4a). Az incprinthez használt HEK293T sejtekben kifejezve minden Xist-MS2 fragmens eltérő expressziós szintet mutatott az endogén Xist-hez képest, kezdve a Xist(a) 60-szoros 60-szoros növekedésétől a Xist(C) majdnem endogén expressziós szintjéig (kiegészítő ábra. 3a). Az összes egyedi Xist-MS2 fragmenst előnyösen a maghoz lokalizáltuk, hasonlóan a teljes hosszúságú endogén megfelelőjükhöz (kiegészítő ábra. 3b). Minden Xist régió (pl., Xist(A), Xist(F) és Xist(C)) ~3000 fehérjéből álló könyvtárunkkal kérdeztük ki. Az egyes Xist régiók különböző szinteken kifejezett jeleinek összehasonlítása (kiegészítő ábra. 3c), az egyes Xist régiók interakciós pontszámait az MS2 RNS kötési adatok (4.Kiegészítő adatok) felhasználásával normalizáltuk. A normalizálás érdekében az MS2 RNS adatkészletben a legmagasabb rangú luciferáz pontszámokkal rendelkező 200 fehérje halmazát az összes MS2-vel jelölt RNS közös kötőanyagaként határoztuk meg. A közös kötőanyagokat ezután minden egyes adatkészletben azonosították, és a medián interakciós pontszámukat minden vizsgált RNS-re kiszámították, és az egyes adatkészletek nyers lumineszcencia-intenzitásának normalizálására használták (lásd a módszerek című részt). Nevezetesen, az MS2 adatokat nem használták kötési specificitás kontrollként, mivel sok RBP felismeri az alacsony komplexitású RNS motifeket36 jelen van az MS2 tag-ben is, és mivel a fehérje kötődése az MS2-hez nem zárja ki a potenciális funkcionális kölcsönhatást a teszt RNS-sel. A Firre-hez hasonlóan azt találtuk, hogy a fehérjék többsége nem kötődik a vizsgált Xist fragmentumokhoz (ábra. 4B-d, szürke pontok; kiegészítő adatok 4), míg a fehérjék specifikus készleteit azonosították, amelyek kölcsönhatásba lépnek az egyes Xist régiókkal (ábra. 4B-d, piros pontok; kiegészítő adatok 4). Fontos, hogy az incPRINT által azonosított Xist-kölcsönható fehérjék között a korábbi vizsgálatokban azonosított jól ismert interakciós partnereket találtunk a teljes hosszúságú transzkriptum megkötésére 7, 14, 15 (ábrán látható. 4b-d, 1. Kiegészítő táblázat). Összehasonlítva az incPRINT által azonosított fehérjék halmazát és azok interakciós pontszámait az egyes vizsgált Xist régiókra (4. Kiegészítő adatok), azt találtuk, hogy minden Xist fragmens kölcsönhatásba lépett a megfelelő régióra specifikus fehérjék halmazával, az RBP-k kisebb hányada kötődik mindhárom Xist régióhoz (ábra. 4e). Így az incPRINT alkalmazása a Xist három konzervált régiójára lehetővé tette az RBP-k azonosítását és hozzárendelését olyan specifikus RNS-régiókhoz, amelyek korábban meghatározták a teljes hosszúságú Xist transzkriptum megkötését 7,14,15 (ábra. 4e; az ismert Xist-kölcsönhatásban lévő fehérjék a jobb oldalon vannak feltüntetve). Például az incPRINT az SPEN-t Xist(A) – specifikus interaktorként azonosította (ábra. 4e), korábbi megállapítások megerősítése7, 8. Hasonlóképpen, az rbm15, RBM15B és YTHDC1 az incPRINT azonosította, hogy kölcsönhatásba lépnek kifejezetten Xist(A) és Xist(F), de nem Xist(C), megerősítve a jelentett kötődés a 5′ végén Xist7, 9 (ábra. 4e). Ezenkívül azonosítottunk egy Xist (C)-specifikus kölcsönhatást a HNRNPU-val (más néven SAF-A), amelyről korábban kimutatták,hogy részt vesz a Xist lokalizációban7, 14, 33 (ábra. 4e, kiegészítő táblázat 1). Az RNS-régió-specifikus Xist-fehérje kölcsönhatások validálásához az ECLIP data21 kódolása 14 incPRINT által azonosított fehérjéhez áll rendelkezésre, amelyek közül több új Xist-kölcsönhatásban lévő RPB-k megerősítették kötődésüket a XIST-hez a K562 sorban (kiegészítő ábra. 3D; kiegészítő adatok 2), tovább erősítve módszerünk sajátosságait. A három Xist régió fehérje interaktómái közötti funkcionális különbséget Gene Ontology (GO) kifejezés dúsítási elemzésekkel igazolták. Az egyes Xist régiókra jelentett differenciálfunkciókkal összhangban a Xist(A)-és Xist(F)-asszociált fehérjéket dúsították az RNS-feldolgozásban részt vevő RBP-k számára, míg a C-ismétlődő régió előnyösen kölcsönhatásba lépett a transzkripciós szabályozásban részt vevő DNS-kötő fehérjékkel (kiegészítő ábra. 3e, f). A GO analízissel egyetértésben a fehérje domén analízis kimutatta, hogy a Xist(a)-kölcsönhatásban lévő fehérjék dúsultak az SPOC (Spen paralog és ortholog C-terminális) és az RRM fehérje domének, a Xist(F)-kölcsönhatásban lévő fehérjék dúsultak az RRM domén és a Xist(C)-kölcsönhatásban lévő fehérjék nem mutattak különösebb dúsulást (ábra. 4F; kiegészítő adatok 3), tovább kiemelve az incPRINT által azonosított fehérjekészletek specifitását minden Xist régióra. Összefoglalva, az incPRINT sikeresen visszanyerte az ismert Xist-protein kölcsönhatásokat és új RBP-ket fedezett fel. A moduláris lncrns egyes konzervált régióival kölcsönhatásban lévő specifikus fehérjehalmazok azonosításával megmutattuk, hogy az incPRINT lehetővé teszi az RNS-fehérje kölcsönhatások régióspecifikus hozzárendelését.

az lncrns Xist különböző régióival kölcsönhatásba lépő fehérjék. egy sematikus ábrázolása az egér Xist átirat és annak A-F-konzervált ismétlődő régiók. Az exonokat dobozként, az intronokat vonalakként jelöljük. A Xist 5′ régiójának nagyított képe mutatja A Xist töredékek helyzetét a Xist átirat mentén. Az incPRINT kísérletekben használt Xist(a), Xist(F) és Xist(C) 0,9 kb-os, 2 kb-os és 1,7 kb-os töredékeit vízszintes színes sávok határolják. B normalizált Xist (a) – fehérje interakciós intenzitások két biológiai ismétlésből átlagolva, növekvő sorrendben rendezve. A vízszintes szaggatott vonal a Xist(A) interaktorok osztályozásához használt interakciós intenzitás-határértéket jelöli. A piros pontok Xist (a) – kölcsönhatásban lévő fehérjék; a szürke pontok olyan fehérjék, amelyek nem kötődnek a Xist(A) – hoz. A kiválasztott fehérjék, amelyekről ismert, hogy kötődnek a Xist-hez, megjelennek. Az adatok normalizálásához lásd a ‘módszerek’ részt. Az RLU relatív könnyű egységek. c, mint a (b), A Xist(F). d, mint a b) pontban, a Xist(C) esetében. e Hőtérkép, amely a Xist(A), Xist(F) és Xist(C) közötti interakció intenzitását mutatja. A korábban észlelt Xist-kölcsönhatásban lévő fehérjék a jobb oldalon vannak feltüntetve. Az RLU relatív könnyű egységek. f mint az ábrán. 3b, Xist(a), Xist(F) és Xist(C) interakciós partnerek esetében. Az SPOC a PFAM pf07744 doménre utal.

az incPRINT azonosítja a funkcionális RNS–fehérje kölcsönhatásokat

mivel a Xist jól jellemzett sejtfunkcióval rendelkezik az xci során a géncsendesítésben, megpróbáltuk tesztelni, hogy az incPRINT segítségével feltárt Xist-fehérje kölcsönhatások némelyike funkcionálisan releváns-e. A hangsúly a ZZZ3 fehérjén volt, amely kölcsönhatásba lép mindhárom vizsgált Xist régióval, és az RBM6, amely specifikusabban kötődik a Xist(A) és a Xist(F) régiókhoz (ábra). 4e). Először is megerősítettük a Xist és az rbm6 és a ZZZ3 kölcsönhatását endogén körülmények között a Xist együttes kicsapódásának tesztelésével mindkét fehérjével egér embrionális őssejtekben. A fehérjéket ha-címkével látták el a polimorf tx1072 ES sejtvonalban, amely lehetővé teszi a doxiciklin által indukált Xist expressziót,kiváltva az XCI-t differenciálás hiányában31,37,38, 39. RNS immunprecipitáció (rip) a Xist doxiciklin indukciója és a sejtek UV-keresztkötése után, majd a qRT-PCR analízisek a Xist transzkriptum rbm6 és ZZZ3 fehérjékkel való jelentős dúsulását azonosították, megerősítve in vivo kölcsönhatásukat (ábra. 5a. B). Nevezetesen, az incPRINT az RBM6-ot is azonosította a Firre-vel való kölcsönhatásként. A Rip qRT-PCR a Firre specifikus kölcsönhatását észlelte az RBM6-mal, de a ZZZ3-mal nem, így megerősítve a Firre-RBM6 kötődését endogén körülmények között, és tovább igazolva incPRINT eredményeinket (ábra. 5a. B).

rbm6 és ZZZ3 szükséges az XCI in vivo használatához. a HA-tagged rbm6 fehérje RNS immunprecipitációja (RIP). Bal oldali panel, western blot az RMB6 számára. Jobb oldali panel, a jelzett transzkriptumok RNS-szintje a bemenetben és az immunprecipitált eluátumokban. Minden dúsítás gapdh mRNS-re és a bemeneti mintára normalizálódik. Minden RIP kísérletet két független biológiai ismétléssel végeztünk. Az adatok átlagként vannak feltüntetve. d.; párosítatlan t-tesztek: * * P < 0,01. a HA-tagged zzz3 fehérje B RNS immunprecipitációja (RIP). Bal oldali panel, western blot a ZZZ3-hoz. Jobb oldali panel, a jelzett transzkriptumok RNS-szintje a bemenetben és az immunprecipitált eluátumokban. Minden dúsítást gapdh mRNS-re és a bemeneti mintára normalizálunk a ‘módszerek’ szakaszban leírtak szerint. Minden RIP kísérletet kétszer végeztünk független biológiai ismétléseken. Az adatok átlagként vannak feltüntetve d. d.; párosítatlan t-tesztek: * * P < 0,01; *P < 0,05, nem szignifikáns (ns). A teljes blotok Forrásadatfájlként vannak megadva. a Xist által kiváltott sejtek C reprezentatív RNS-HALKÉPEI a jelzett fehérjék kimerülésekor. A Xist piros színnel, az X-kapcsolt génlámpa2 pedig zöld színnel jelenik meg. A szaggatott vonal a sejtmagokat határolja. A csillagok az aktív X kromoszómából származó Lamp2 expressziót jelzik. A nyílhegyek a lamp2 expressziót jelzik az inaktív X kromoszómából, amely kiszabadul az XCI-ből.skála sávok, 5 MHz. d bi-allél Lamp2 expressziós sejtek mennyiségi meghatározása RNS FISH-sel értékelve, a Reduc kontrollhoz viszonyított hajtásarányban kifejezve. Az adatok három független kísérletek képviselteti magát, mint az átlagos kb s. d.; Student t-tesztek: ** P <0,01; *P < 0,05; nem szignifikáns (ns). Szaggatott vonal határolja a szint RLuc.

ezután annak tesztelésére, hogy az RBM6 és a ZZZ3 hatással van-e az XCI-re, egysejtű RNS fluoreszcens in situ hibridizációt (RNS FISH) használtunk az endogén Lamp2 expressziójának felmérésére, amely egy X-kapcsolt gén, amely általában az XCI iniciáció során elnémul40. A doxiciklin által indukált Xist expresszió után az Rbm6, Zzz3 és a pozitív kontroll Spen kimerülése (kiegészítő ábra. 4a, b) a Lamp2 csökkent hangtompításához vezetett, míg az XCI által indukált mono-allél expressziója változatlan maradt a Thap7 kimerülésekor, amely nem lépett kölcsönhatásba a Xist-rel, és negatív kontrollként használták (ábra. 5c, D; kiegészítő ábra. 4c; 2. Kiegészítő táblázat). Xist (- doxiciklin feltételek) hiányában a lamp2 expressziója változatlan maradt a fenti fehérjék kimerülésekor (kiegészítő ábra. 4D; kiegészítő táblázat 2). Fontos, hogy az X kromoszóma-elnémítás hibáit nem a Xist/Tsix megváltozott expressziója váltotta ki az egyes fehérjék kimerülésekor (kiegészítő ábra. 4e). Összefoglalva, a funkcionálisan fontos interaktorok azonosítása az incPRINT által azonosított RBP-k között bizonyítja az incPRINT felfedezési potenciálját.