eredmények

Az IL-7 Receptor azonosítása (CD127) a memória T-sejtjeinek markereként. Miközben új markereket kerestünk az effektor és a memória T-sejt részhalmazainak meghatározására az egérben, elemeztük az IL-7 receptor 6-lánc/CD127 felszíni expresszióját (ábra. 1a). Az LM-re adott elsődleges válaszok során az antigén-specifikus lép-T-sejt populációk különálló alcsoportjai megkülönböztethetők a CD127 expressziós szintek alapján. CD127 alacsony expressziós sejtek (CD127low) dominálnak az akut effektor fázisban. A memória T-sejt fázisba való átmenet során azonban a CD127low sejtek fokozatosan eltűnnek, míg a magas szintet kifejező populációk (CD127high) az idő múlásával rendkívül stabilak maradnak (ábra. 1 a és c). Ezek a különálló kinetikai értékek határozottan azt sugallják, hogy a CD127 expresszió szelektív jellemző a hosszú élettartamú memória T-sejtekre. Az effektor fázis során a CD127low CD8 + T-sejtek elsősorban a nem limfoid szervekbe vándorolnak, míg az LN-ben csak a CD127high CD8+ T-sejteket detektálják (ábra. 1b). A lép egy “köztes szervet” képvisel, ahol az összes különböző szubpopuláció az immunizálás után korán megtalálható (22, 23). Később a memóriafázis során az összes szerv antigén-specifikus T-sejtjeit Cd127 magas fenotípus jellemzi (ábra. 1 b és c). A CD127low és CD127high antigén-specifikus T-sejtek stimulációra adott válaszként történő proliferációs képességének összehasonlítása feltűnő különbségeket mutatott a két alcsoport között. Amint az ábrán látható. 1d, tisztított Listeria-specifikus CD127high T-sejtek gyorsan szaporodnak az anti-CD3 stimuláció után, míg a CD127low T-sejtek rosszul szaporodnak. Nem valószínű, hogy ezek a proliferációs különbségek a CD127-pozitív sejtek AB-mediált IL-7R stimuláció révén történő előnyeit tükrözik, mivel az ismert CD127 aktiváló vagy blokkoló aktivitású különböző MAB klónok ugyanezt a hatást mutatták rövid távú in vitro stimulációs vizsgálatokban (az adatok nem szerepelnek).

annak közvetlenebb bemutatása érdekében, hogy a hosszú élettartamú memória T-sejtek kizárólag a CD127 magas expressziós rekeszében vannak jelen Korán in vivo alapozás után örökbefogadó transzfervizsgálatokat végeztünk egy nemrégiben kifejlesztett reverzibilis MHC multimer-festési technikával (21) az antigén-specifikus T-sejtek funkcionális izolálására közvetlenül ex vivo. A CD127high LLO91–99-specifikus T-sejtek 10 napig lm-vel fertőzött egerekből történő örökbefogadása után az átvitt sejtek néhány héttel később még kimutathatók voltak a naiv recipiens egerek lépében (ábra. 2a), míg a CD127low sejtek átvitelét követő sejtszámok a kimutatási határon voltak. Ezt a megfigyelést nem az átvitt CD127 high és CD127low sejtek in vivo migrációjának különbségei okozták, mivel hasonló különbségeket találtunk a tüdőben (ábra. 2a) és egyéb szervek (LN és máj, az adatok nem jelennek meg). Annak az értelmezésnek a további alátámasztására, hogy a CD127high T-sejtek kizárólag antigén-specifikus memóriasejteket tartanak fenn, a recipiens egereket Listeria fertőzéssel történő örökbefogadás után megtámadták. Ismét csak egerekben, hogy kapott CD127high T-sejtek fertőzés előtt volt gyors bővülése átvitt LLO91-99-specifikus T-sejtek kimutatható (ábra. 2b). Ez az eredmény ismét nem a migráció különbségeinek tudható be, mivel az átvitt CD127low T-sejtek fenntartása vagy terjeszkedése nem volt kimutatható más szervben (ábra. 2b és az adatok nem jelennek meg). Bár ezek az örökbefogadó transzfervizsgálatok eredményei erősen alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a hosszú élettartamú memória T-sejtek kizárólag a CD127high T-sejtek rekeszében vannak jelen, ennek a kísérleti megközelítésnek is jelentős korlátait figyeltük meg. Különösen úgy tűnik, hogy az azonnali effektor funkcióval rendelkező memória T-sejtek meglehetősen érzékenyek az örökbefogadó transzfer kísérletekre, és a tisztítás és az intravénás alkalmazás után gyorsan elpusztulnak; bár hónapokig vagy évekig életben maradnak, ha in vivo érintetlenek maradnak (11). Így, bár az örökbefogadó transzfer eredményei megfelelnek annak az értelmezésnek, hogy a CD127 a hosszú élettartamú memória T-sejtek markere, nem zárhatjuk ki, hogy a különálló T-sejt-alpopulációk túlélésével kapcsolatos belső problémák is hozzájárulnak e kísérletek eredményéhez.

a CD127 és CD62L antigén-specifikus T-sejtpopulációk fenntartása lehetővé teszi a memória T-sejt alcsoportok megkülönböztetését. A CD127high T-sejt populáció további jellemzése azt mutatta, hogy a cd62l magas és alacsony szintjét kifejező szubpopulációkra osztható (ábra. 3). A tisztított T-sejtek közvetlen ex vivo funkcionális analízise (21) (10-12 nappal a fertőzés után, amikor az összes szubpopuláció egyidejűleg kimutatható a lépben) további funkcionális különbségeket tárt fel. Míg a Cd62low T-sejt részhalmazok erőteljes és azonnali ex vivo citolitikus aktivitást mutatnak, a CD127high / CD62Lhigh T-sejtek a peptidbevonatú célsejtek nagyon gyenge lízisét mutatják (ábra. 3). A rendezett alcsoportok intracelluláris citokinfestése azt mutatta, hogy a CD127high/Cd62low T-sejtek, mint a CD127low/Cd62low részhalmaz, az effektor citokineket termelik INF-és tumor nekrózis faktor, míg a CD127high/CD62Lhigh részhalmaz IL-2-t termel, de az IFN-és a tumor nekrózis faktor (tumor nekrózis faktor), és a tumor nekrózis faktor (tumor nekrózis faktor) nem. Így a CD127 és CD62L marker kombinációja lehetővé teszi a korábban embereken leírtakhoz nagyon hasonló jellemzőkkel rendelkező T-sejt alpopulációk azonosítását. A CD127low / Cd62low T-sejtek a valós effektor t-sejtpopuláció összes ismert jellemzőjét mutatják (te, gyenge proliferatív aktivitás, korlátozott in vivo túlélés és azonnali effektor funkció). A CD127high / CD62Lhigh részhalmaz megfelel a TCM jellemzőinek, a CD127high/Cd62low t cellák pedig megfelelnek a TEM leírásának.

a különálló memória T-sejt alpopulációk generálása a CD40L által közvetített T-sejt Súgótól függ. Mivel úgy éreztük, hogy problematikus lehet kizárólag arra az értelmezésre alapozni, hogy a CD127 expresszió markerként használható az effektor és a hosszú életű memória T-sejtek megkülönböztetésére az örökbefogadó sejtátviteli kísérleteken, úgy döntöttünk, hogy elemezzük az egér mutáns vonalakat a T-sejt memória generálásának hibáival. Ha a CD127 valóban” korai ” memória T-sejt marker, akkor képesnek kell lennünk azonosítani a különbségeket a korai és késői időpontokban a cd127-pozitív részhalmazokban memóriahibákkal rendelkező egerekben.

mivel a legújabb tanulmányok kimutatták a T-sejt segítség fontosságát a hosszú távú memória-válaszok (2-4) generálásában, úgy döntöttünk, hogy meghatározzuk, hogy a CD4+ T-sejt-segítség jelenléte vagy hiánya a CD8+ T-sejt alapozás során különbségeket eredményez az antigén-specifikus T-sejt részhalmazban a korai posteffector fázisban detektált kompozíciók. MHC II-hiányos egerek, amelyek nem rendelkeznek a hagyományos CD4 + T-sejtek, hibás CD8 + memória válasz, és a védelem minősége idővel csökken (2-4). Az elsődleges fertőzés után 10 nappal a T-sejt szubpopulációk festése azt mutatta, hogy a CD127high/CD62Llow részhalmaz szinte teljesen hiányzik az MHC II–/– egerekben (ábra. 4a); a többi alpopuláció hasonló frekvencián van jelen, mint a WT C57BL/6 egerekben. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a T-sejt segítség hiánya megakadályozza az effektor memória fenotípusú T-sejt részhalmaz hatékony generálását, ami kulcsfontosságúnak tűnik a Gyors in vivo expanzióhoz és az effektor funkcióhoz.

mivel a CD4+ T– sejtek segítésének fontos mechanizmusait a CD40 és a CD40L (24-26) kölcsönhatása közvetíti, megvizsgáltuk, hogy a CD40L–/– egerek fenotípusa hasonló– e az MHC II – / – egerekéhez. Más közelmúltbeli vizsgálatokkal (27) összhangban a CD40L–/– egerek nem mutatnak különbséget a baktériumok terhelésében vagy a baktériumok clearance-ében az elsődleges Listeria fertőzés után (az adatok nem jelennek meg), és normális primer CD8+ T-sejt válaszok vannak az Lm szubletális dózisára (ábra. 4c). Azonban az a képességük, hogy gyorsan megtisztítsák az újrafertőződést magasabb Lm dózissal (60 0 LD50) csökken (ábra. 4B), korrelál a károsodott CD8 + memória T-sejt válaszokkal (ábra. 4C) és egy sokkal kisebb CD127high/CD62Llow részhalmaz (ábra. 4 e és f) a korai posteffector fázisban. A Listeriával történő újrafertőzés során a reagáló T-sejtek proliferációja a CD40L – / – egerekben egyenértékű a WT egerek sejtpopulációival, jelezve, hogy a fenotípus nem a memória T-sejtek proliferációs képességének általános hibája miatt következett be (ábra. 4d), hanem inkább a memória T-sejtek számának csökkentésére, amelyek képesek azonnal reagálni az antigén reencounterre. Ezt a fenotípust in vivo címkézési kísérletekkel igazolták, amelyekben a Brdurdot beépítették a teljes tágulási fázisba (ábra. 4D), valamint in vivo brdurd pulse-chase vizsgálatokkal, amelyek a proliferáció jelének elvesztését figyelték meg (az adatok nem láthatók).

az effektor memória fenotípusú T-sejt részhalmazok csökkentett generálása az alapozás után Korán átkerül a késői memória T-Sejtkészletbe. Adataink azt mutatják, hogy CD4+ T-sejtek vagy CD40L hiányában a CD127high / Cd62low T-sejt részhalmaza az alapozás után korán jelentősen csökken. Továbbá, mi (ábra. 4B) és mások (3-5) kimutatták, hogy a T-sejtek alapozása során a károsodott T-sejt-segítség megváltoztatja a védő immunitás minőségét az Lm vagy lymphocytás choriomeningitis vírussal való újrafertőzés felé. A CD127high/ Cd62low T-sejtek korai generációjának megfigyelt hibájának egyértelműbb összekapcsolása a későbbi t-sejtmemória minőségével ezeknél az egereknél antigén-specifikus T-sejt populációkat elemeztünk a memória fázis (5 hét az elsődleges Listeria fertőzés után) részletesebben. Ebben az időpontban az antigén-specifikus T-sejtek elemzését különböző szövetekből származó sejteken kell elvégezni, eltérő migrációs viselkedésük miatt. A lép mellett az LN-t választottuk a limfoid szervek reprezentatív szöveteként, a tüdőt pedig tipikus perifériás, nem nymphoid rekeszként. Ebben az időpontban ezekben a szervekben az antigén-specifikus T-sejtek szinte mind CD127high (ábra. 1b); a tüdő sejtjei CD62Llow (az adatok nem jelennek meg), míg az LN legtöbb antigén-specifikus memória T-sejtje CD62Lhigh (ábra. 5b). Az antigén-specifikus memória T-sejtek számának meghatározása egyértelmű azonnali effektor funkcióval a különböző szervekben, intracelluláris citokin festést végeztünk IFN-6-ra. Amint az ábrán látható. Az 5a, CD40L–/– egerekre jellemző, hogy az antigén-specifikus memória T-sejtek száma jelentősen csökkent, azonnali effektor funkcióval, összehasonlítva a WT egerekkel. Ez az eredmény igaz a CD8+ T cellarekesz frekvenciaszintjére (százalék) és abszolút számokra (ábra). 5a). Azonban MHC tetramer festése Ln-eredetű limfociták (ábra. 5b) szinte azonos számú antigén-specifikus T-sejtet tárt fel Cd62l magas fenotípussal. Néhány CD62Llow antigén-specifikus T-sejt szintén kimutatható a WT egerek LNs-jében, korrelálva az IFN-xhamstertermelő sejtek gyakoriságával (ábra. 5a). Ez a populáció alapvetően hiányzik a CD40L–/– egerek LNs-jében; a teljes CD8+/ Cd62low részhalmaz csökken a CD40L–/– egerekben, ami általános hibára utal ennek a T-sejt részhalmaznak a generálásában. Összefoglalva, adataink azt mutatják, hogy a CD40L-függő CD4+ T-sejt segítség hiánya a priming periódus kvantitatív különbségeket eredményez az antigén-specifikus CD8+ T-sejt szubpopulációkban, jelentősen csökkent az effektor memória fenotípust mutató sejtek száma (CD127high/Cd62low). Ezek a mennyiségi különbségek az azonnali korai effektor funkcióval rendelkező sejtekben a memória fázisba kerülnek, és befolyásolják a védő immunitás minőségét.