eredmények

először azt vizsgáltuk,hogy a CD63 és a H, K-ATPáz ugyanabban a szubcelluláris rekeszben található-e a gyomor parietális sejtjeiben. Korábbi munkák kimutatták, hogy a patkány parietális sejtjei magas CD63-szintet expresszálnak (22). A patkány gyomor fagyasztott szakaszain végzett immunfluoreszcens mikroszkópia azt jelzi, hogy a CD63 a patkány gyomor legtöbb sejtjében jelen van, beleértve a parietális sejteket is (ábra. 1A). A CD63 részben kolokalizálódik a HKA-val a parietális sejtekben. Ezenkívül egy erősen tisztított tve készítményt elemeztünk sertés gyomorból (C. T. Okamoto kedves ajándéka). A H, K-ATPáz hasonló készítményekben a fehérjetartalom 50% – át teszi ki (23). A Western blot elemzés azt mutatja, hogy a CD63 bőségesen jelen van a TVE-k tisztított készítményében (ábra. 1B).

a CD63 és a H,K-ATPáz közötti lehetséges In situ kölcsönhatás vizsgálatához lehúzási kísérleteket végeztünk biotinilezett paradicsomlektin alkalmazásával. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy ez a lektin specifikusan és egyedülállóan kötődik a HK-hez a Gyomorkészítményekben (24-27). A TVE készítményt anti-hk MAB-val és biotinilezett paradicsomlektinnel blotáltuk, hogy megerősítsük, hogy a lektin kifejezetten a glikozilezett hk-val társul. 1C). Ezután biotinilezett paradicsomlektint használtunk olyan fehérjék izolálására, amelyek kölcsönhatásba lépnek a HK-vel a TVE készítményben. Western blot elemzés azt mutatja, hogy a CD63 kicsapódik paradicsom lektin (ábra. 1D), bizonyítva, hogy a CD63 és a H, K-ATPáz in situ társulnak, és arra utalnak, hogy ez az összefüggés fiziológiailag releváns lehet. A TVE készítmény előkezelése 4% SDS – sel, majd 20-szoros hígítás lízispufferben, jelentősen csökkentette a kicsapódott CD63 mennyiségét. Ez a kezelés nem változtatta meg a kicsapódott hk-k számát (az adatok nem jelennek meg). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a cd63 jelenléte a pull-down-ban a HK Xhamsterrel való kapcsolatának tulajdonítható, nem pedig a CD63 és a paradicsomlektin közötti közvetlen kapcsolatnak.

a CD63 és a HK 63 közötti kölcsönhatás funkcionális jelentőségének további vizsgálatához cos-7 sejteket transzfektáltunk egy rabbit hk 6connitiv-t kódoló cDNS-sel, vagy egy FLAG-tagged CD63 konstrukciót (CD63-FL) kódoló cDNS-sel együtt. Megmutattuk, hogy a HK-nak nem kell összeállnia a HKa-val, hogy elérje a sejtfelületet transzfektált COS-sejtekben (20). Olyan CD63 konstrukciót használtunk, amely zászló epitóp címkét hordoz az N végpontján, mert a CD63 C végpontja tirozin alapú motívumot tartalmaz, amely a tetraspanin intracelluláris kereskedelméhez szükséges (13).

a HK CAC-vel és CD63-FL-lel kotranszfektált COS sejteket Anti-FLAG pAb alkalmazásával immunprecipitációnak vetettük alá. Az immunprecipitált anyag Western blot analízise azt mutatja, hogy a HK a Cd63-mal koprecipitálódik (ábra. 2, hk + CD63-FL). A CD63-FL és a HK ons fehérjék különböző mosószerekben koimmunprecipitálódnak, beleértve a 2% CHAPS-ot, az 1% Brij 96-ot és az 1% Triton X-100-at. A CD63 és a HK-K közötti kapcsolat egyike azon kevés leírt tetraspanin komplexeknek, amelyek túlélik a Triton X-100-ban történő oldódást, és így valószínűleg közvetlen kölcsönhatást jelentenek (28). A fő alegységnek két formája van: a fő (Érett), amely komplex szénhidrátokkal módosul, és a fő (mag), amely magas mannóz szénhidrátokkal módosul (29). Mindkét forma koprecipitálódik a CD63-mal, bár a csapadékban az ~ C / ~ M aránya az oldódási körülmények függvényében változik.

a HK-t nem detektálták a HK-vel transzfektált sejteken végzett FLAG immunprecipitációkban, csak a HK-vel transzfektált sejteken, bizonyítva, hogy a FLAG pab nem lép kölcsönhatásba a ++ – alegységgel (ábra. (2, hk). A HK (hk) nem koimmunprecipitálódik a FLAG pAb-val a CD63-FL-el és a CA-alegységgel külön-külön transzfektált sejtekből előállított lizátumok keverékéből (50: 50, vol/vol), megerősítve, hogy a kölcsönhatás in vivo történik (ábra. 2, második sáv). A FLAG pAb-val inkubált minták nem csapják ki a lizoszomális Lamp-1 fehérjét, ami azt jelzi, hogy a CD63-FL és a HK-K közötti kölcsönhatás specifikus, és nem a CD63 rekesz hiányos oldódásának eredménye (ábra. 2).

ezután megvizsgáltuk, hogy a HK és a CD63 közötti kölcsönhatás befolyásolja-e az alegység szubcelluláris lokalizációját. A HK a Cos sejtek felületén átmenetileg transzfektált cos sejtekben van jelen (ábra. 3 A-C). A COS-sejtek kotranszfektálása során a COS-sejtek mind a HK-vel, mind a CD63-FL-vel kotranszfektálódnak (ábra. 3 D-F). Annak kizárására, hogy ez a megváltozott lokalizáció a CD63 túlzott expressziójának nem specifikus hatása lehet, megvizsgáltuk a CD63 expresszió hatását az aqp4 eloszlására. Az AQP4 egy vízcsatorna, amely jelen van a parietális sejtek bazolaterális plazmamembránjaiban. Nem esik át szabályozott endocitózison és exocitózison a H, K-Atpázzal (30, 31). Ez a csatorna nem koimmunoprecipitálódik CD63-FL-vel a kotranszfektált COS sejtek Triton X-100 lizátumában (ábra. 4A). Amikor a kotranszfektált sejteket immunfluoreszcens konfokális mikroszkóppal vizualizálják, az AQP4 nincs jelen a CD63-t tartalmazó rekeszben (ábra. 4B), jelezve, hogy a CD63 által indukált újraelosztás az intracelluláris vezikulákra specifikus az ezzel a tetraspaninnal kölcsönhatásba lépő fehérjékre.

a cd63 által közvetített újraelosztásának mechanizmusainak vizsgálatához hk a HK-k közül a legutóbbi munkát használtuk, amely a CD63 intracelluláris kereskedelmét jellemezte. Rous et al. (13) kimutatták, hogy a CD63 szélső C terminálisán jelen lévő tirozin-alapú motívum kölcsönhatásba lép a (Z) adaptor alegységekkel, A (Z) 62 és a (Z) 63 alegységekkel. A 6db fehérje a heterotetramer AP-2 komplex tagja. Ez a komplex jelen van a plazmamembránon, és összekapcsolja a cargo fehérjéket a clathrin réteggel, közvetítve azok endocitózisát (14). A 63 fehérje a heterotetramer AP-3 komplex tagja. Ez a komplex részt vesz a lizoszomális célzásban, és megtalálható mind a transz-Golgi hálózatban, mind egy hólyagos rekeszben, amely részben kolokalizálódik endoszómákkal (12). Amikor a CD63 YEVM tirozin-alapú motívuma aevm-re mutálódik, a CD63 nem képes kölcsönhatásba lépni sem a 62-vel, sem a 63-mal, és elsősorban a sejtfelszínen expresszálódik (13). Ha a HK-t a zászlóval jelölt CD63-AEVM konstrukcióval együtt fejezzük ki, akkor mind a CD63-aevm, mind a CA-alegység eloszlik a sejtfelszínen (ábra. 3 G-I). Így az intracelluláris Eloszlás a HK-t a Cd63 citoplazmatikus farokba ágyazott emberkereskedelmi jelek befolyásolják.

amikor a YEVM szekvencia a CD63 farkában YEVI-re mutálódik, a módosított motívum továbbra is kölcsönhatásba lép a xham2-vel (13). A CD63-YEVI elsősorban a késői endoszomális-lizoszomális rekeszben lokalizálódik, valószínűleg azért, mert a megváltozott tetraspanin fehérje közvetlenül ebbe a rekeszbe mozog, miután a kezdeti bioszintetikus áthaladt a Golgi-n (13). A cd63-YEVI kis populációja, amely eléri a plazmamembránt, károsodott internalizációt mutat, mert már nem képes kölcsönhatásba lépni a xham2-vel (13). Amikor a Cos-sejtekben a HK 63-YEVI konstrukciót és a CD63-YEVI konstrukciót koexpresszálják, a CD63-YEVI nagy része a késői endoszomális–lizoszomális kompartmentre lokalizálódik; azonban a COS-alegység a sejtfelszínen marad, és nem kerül újraelosztásra egy intracelluláris kompartmentbe (ábra. 3 J-L). A coimmunoprecipitációs elemzés megerősíti, hogy a HK-k mind a CD63-YEVI-vel, mind a CD63-AEVM-mel társíthatók (az adatok nem jelennek meg). Ezek az adatok arra utalnak, hogy ahhoz, hogy a HK 63-pozitív intracelluláris kompartmentbe kerüljön, ezeknek a fehérjéknek a sejtfelszínen kölcsönhatásba kell lépniük, és komplexként endocitózisnak kell lenniük.

annak megállapításához, hogy az intracelluláris vezikulumokban kimutatott hk (hk) DCC)-ok megfelelnek-e a sejtfelszínről endocitizált proteinnek, megfigyeltük a CC-alegység internalizációját exogén CD63 expresszió jelenlétében és hiányában. A COS sejteket kotranszfektáltuk a HK-vel és a CD63-FL-lel. A sejteket ezután lehűtjük 4 (C) – ra, hogy megállítsuk az endocitózist, és a felületet hk (MAB) – val jelöltük. A jelölt sejteket inkubáltuk 37ccc-n 40 percig, hogy az endocitózis folytatódjon. Az inkubálás után a sejteket 4 db C-re hűtöttük, és a felületet Cy5-konjugált kecske anti-egér IgG-vel jelöltük. A sejteket Anti-FLAG pAb-val rögzítettük és inkubáltuk, majd fluoreszcein izotiocianát-konjugált kecske anti-egér IgG-vel és rodamin-konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel jelöltük. Így a felszínen maradt hk-Xhamstereket a Cy5 csatornán, az internalizált hk-Xhamstereket a fluoreszcein izotiocianát csatornán, a cd63-FL-t pedig a rodamin csatornán vizualizáltuk. Ez az elemzés azt mutatta, hogy az internalizált 63-alegység kolokalizálódik a CD63-mal, ami arra utal, hogy a CD63-mal kolokalizált hk-Kb a sejtmembránból származó endocitózis révén származik (ábra. 5 E-H). Azok a sejtek, amelyek nem fejezik ki túl a CD63-at, sokkal kevésbé internalizáltak a 40 perces inkubáció után (ábra. 5 A-D).

ahhoz, hogy számszerűsítsük a HK-K internalizálását, és tovább ellenőrizzük, hogy a HK-k és a CD63 a sejt felszínén társulnak-e, sejtfelszíni biotinilezési kísérleteket végeztünk. Az első kísérletben, a COS-sejteket transzfektáltuk a csak a CA-alegységgel, majd biotinileztük biotin-SS-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel 4 C-nél. A sejteket 4CC-re állítottuk vissza, és minden egyes időpontból egy lemezt eltávolítottunk a maradék sejtfelszíni biotintól a membrán-impermeáns Redukálószernek való kitettség révén MesNa. A sejteket lizáltuk és streptavidin gyöngyökkel inkubáltuk. A sztreptavidingyöngyökhöz kapcsolódó fehérjéket SDS/PAGE-vel választottuk el, a membránokat pedig hk MAB-val vizsgáltuk (ábra. 6A). A sejtfelszínen lévő hányados, a sejtfelszínen található, nem változik érzékelhetően, ahogy a 37-es C-alapú internalizáció halad előre. Az első 10 perc után a HK-vel jelölt hk-k egy kis hányada elkülönül a sejten belül, és a felület és az internalizált hk-k aránya továbbra is magas. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a cd63-hoz nem társított Alzheimer-alegység vagy nagyon lassan internalizálódik, vagy internalizálódik, de gyorsan újrahasznosul a felszínre, hasonlóan a transzferrin receptorhoz.

ezután arra törekedtünk, hogy jellemezzük a CD63-hoz társuló hk-K viselkedését. A COS sejteket kotranszfektáltuk a HK-vel és a CD63-FL-lel. A sejteket a fent leírtak szerint biotinileztük és lecsupaszítottuk. A CD63-hoz társuló hk-sok közül a HK-sok populációjának izolálásához a sejtlizátumot FLAG pAb-mal és protein a-konjugált agarózgyöngyökkel inkubáltuk. Az immunprecipitált anyagot kis mennyiségű, 3% SDS-t tartalmazó pufferrel eluáltuk, 30-szor hígítottuk 1% Triton X-100-mal, és sztreptavidin gyöngyökkel inkubáltuk. A sztreptavidingyöngyökhöz kapcsolódó fehérjéket SDS/PAGE-vel különítettük el, és a HK MAB-val próbáltuk (ábra. 6B). Azoknál a sejteknél, amelyeket nem vetettek alá sztrippelési protokollnak, az ebben a Western blot-ban detektált jel a cd63-hoz társított felszíni jelölésű 6-alegység teljes készletét képviseli, beleértve azokat a komplexeket is, amelyek még mindig a plazmamembránon voltak, valamint azokat a komplexeket, amelyeket vezikulákká internalizáltak. A sztrippelési protokollnak alávetett sejtek esetében a jel a cd63-hoz kapcsolódó, a sejtfelszínen a biotinilezés során jelen lévő, majd internalizált és a MesNa-csíktól védett DNS-alegység populációját képviseli.

a 0-min időpont, biotinylated HKß könnyen kimutatható anti-FLAG immunoprecipitates a unstripped sejtek, amelyek igazolják, hogy a HKß, valamint CD63 képesek egyesület a sejtek felszínén. A 0 perces időpontban visszanyert összes biotinilezett hk 6DC érzékeny a MesNa csíkra. A Cd63-hoz kapcsolódó, Biotinilezett, Mezna-reagenssel védett alegység mennyisége növekszik, ahogy a sejtek 37cc-nél inkubálódhatnak. valójában, a felszínen jelen lévő és a CD63-hoz 0 percnél társított hk-Kb-k mennyisége megközelítőleg megegyezik a CD63-hoz társított és a 45 percnél a sztrippeléstől védett hk-Kb-K mennyiségével. Ezek a megállapítások arra utalnak, hogy a cd63-hoz társított CBD-alegység internalizálódik, és nem tér vissza a sejtfelszínre.