az eredmények és a megbeszélés

a HANCs a fej Epidermiszéből származik, és lb Génfunkciót igényel. Korábbi tanulmányok (5, 11, 17, 19) leírták az lb gének szerepét a sejt sors specifikációs folyamataiban. A Drosophila esetében a funkciónövekedési és funkcióvesztési kísérletek azt mutatták, hogy az lb gének meghatározzák a szív-és izomsejtek egy részének azonosságát, és hogy ez a funkció az LB erősen korlátozott, lineage-specifikus mezodermális expressziójából származik. Ezenkívül az lbe pontos elemzése (ábra. 1) és az lbl (az adatok nem jelennek meg) expressziós mintázata a szívfúzió kezdetén egy lb-pozitív sejtek háromszög alakú klaszterét tárta fel, amely csak a szív csúcsa előtt helyezkedik el (ábra. 1 A, nyílhegy). Ahhoz, hogy pontosabb leírást kapjunk ezeknek a sejteknek a helyzetéről a szívhez kapcsolódó nyirokmirigyek és gyűrűmirigyek tekintetében, kétszer jelöltük az embriókat az lb és a specifikus mirigy markerek számára (ábra. 1 B és C). A nyirok mirigy prekurzorok kiderült Anti-kígyó antitest szárny mindkét oldalán a szív csúcsa (ábra. 1B), de ne fedje át az lb által jelölt területet. Hasonlóképpen, az l(2)1857 enhancer trap vonal kettős festése, amely kifejezetten a LacZ-t fejezi ki a gyűrűs mirigy embrionális primordiájában (15), azt mutatja, hogy az lb-pozitív sejtek közvetlenül a gyűrűs mirigy előtt helyezkednek el (ábra. 1C).

a szívhez kapcsolódó lb-pozitív sejtek eredetének meghatározásához a korai stádiumtól kezdve követtük az embriók elülső részében az LB expressziót. A szívfúziót megelőző embrionális szakaszokban nem tudtuk kimutatni a két szív primordia elülső részéhez kapcsolódó lb expressziót. Ez a megállapítás azt sugallta, hogy az lb-pozitív sejtek eredetileg nem a szívterületen vannak meghatározva, és különböző eredetű sejteket képviselhetnek, amelyek a későbbi szakaszokban kapcsolódnak a szívsejtekhez. Valójában a 11. késői szakaszban az lb-pozitív sejtek egy csoportja a hátsó fej epidermiszében (ábra. 2A) lehet kimutatni. Ezek a sejtek kissé később kezdenek invaginálódni, és a hajtogatott epidermisz vezető részét képezik (ábra. 2B). Ennek az invaginációnak a helyzete és időzítése hasonlít a fej epidermiszének hajtogatására, ami a hátsó tasak hátsó részét, az úgynevezett frontális zsákot eredményezi (20). Annak ellenőrzésére, hogy az lb-expresszáló sejtek megfelelnek-e a frontális zsák csúcsának, az escargot-LacZ n516 vonalat használtuk, amely a lacZ-t a hátsó tasakképző sejtekben fejezi ki (20). A 14. szakasz kettős foltjai (ábra. 2B) és 16. szakasz (ábra. 2C) n516 anti-lbe és anti-6-galaktozidáz antitesteket alkalmazó embriók egyértelműen bizonyítják, hogy az lb és az esg együtt expresszálódik az invagináló frontális zsák hegyében. Az embrionális fej régiójának hátsó nézete (ábra. 2D) megerősíti, hogy ezek a sejtek ugyanazt a háromszög alakú elrendezést mutatják, mint a korábban bemutatott szívhez kapcsolódó lb-pozitív sejtek (hasonlítsa össze az ábrákat. 2D és 1).

ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a közvetlenül a szív előtt fekvő lb-expresszáló sejtek a fej epidermiszéből származnak, és a frontális zsák invagináció során a szívcsúcs felé vándorolnak. Ez a megfigyelés további kérdést vet fel az lb gének szerepével kapcsolatban a sejtcsoport specifikációjában. Korábban kimutattuk, hogy az lb gének fontos szerepet játszanak a szív-és izom prekurzorok egy részének specifikációjában (11, 19). Az egér lb ortholog lbx1 génjének funkcionális analízise (21, 22) azt is feltárta, hogy milyen hatással van az appendicularis izom prekurzorok specifikációjának és irányított migrációjának szabályozására. Sőt, a legfrissebb adatok azt mutatják, hogy az egerekben az lbx1 meghatározza a szív neurális címersejtjeinek szubpopulációját, amelyek szükségesek a normális szívfejlődéshez (23).

annak tesztelésére, hogy a Drosophila lb szükséges-e a szívhez kapcsolódó sejtek specifikációjához, elemeztük a hátsó tasak képződését mindkét lb gén hiányos embrióiban (lásd anyagok és módszerek). Az esg RNS szondát markerként használva kimutattuk, hogy az lbdef embriókban hiányzik az ESG expresszió a frontális zsák disztális részében, amely a szívhez kapcsolódó sejteket hordozza (vö. 2 E és G F és H). Ezenkívül, amint azt a 14. stádiumú embriók dorsolaterális nézetei mutatják (ábra. 2 G és H), a tojássárgája zsák és a legtávolabbi esg-pozitív sejtek közötti távolság jelentősen megnő az lb-hiányos embriókban. Ez a megállapítás, amelyet a Nomarski optikai megfigyelés támaszt alá, feltárva, hogy a frontális zsák hátsó része megváltoztatta a morfológiát (az adatok nem jelennek meg), azt jelezte, hogy a HANCs nincs megadva, vagy nem vándorolnak megfelelően az lbdef embriókban. Mivel az elemzett hiány a szomszédos bap és C15 génekre is kiterjed, frontális zsákképződést teszteltünk bap mutáns embriókban és Arm-GAL4 >UAS-RNAiC15 embriókban. Mind a bap208, mind az RNAiC15 embriókban az esg-festett frontális zsák normális alakú volt (az adatok nem szerepelnek), így kizárva a BAP és a C15 gének hatását a szívhez kapcsolódó sejtek differenciálódására vagy migrációjára. Ezek az adatok határozottan arra utalnak, hogy az lbdef embriókban a disztális ESG-pozitív frontális sac sejtek rendellenes mintázata az lb funkció elvesztéséből származik.

mezodermális és nem mezodermális komponensek, amelyek részt vesznek a szív kiáramlási régiójának Mintázásában. Immunfestő kísérleteink azt mutatták, hogy a szív-rögzítő lb-pozitív sejtek nagyon közel vannak az lb-expresszáló kardioblasztokhoz (ábra. 1). Mivel a legtöbb elülső cardioblast ón-t expresszál (5), mi kettős jelölt embriókat Anti-Tin és anti-Lbe antitestekkel, hogy megjelenítsük a szívcsúcs megfelelő helyzetét és a frontális zsák legtávolabbi részét. Meglepő módon ez a két szerkezet körülbelül három sejthosszal átfedi egymást, amikor a hátsó oldalról megfigyelik (ábra. 3A). Ezenkívül az elülső szívterület oldalsó konfokális nézete (ábra. 3B) egyértelműen azt mutatja, hogy a frontális zsák csúcsa, amely nem-mezodermális lb-expresszáló sejtekből áll, közvetlenül a szívhez kapcsolódik. Pontosabban megfigyeltük, hogy az aorta elülső része (részben átfedve a szívvel összefüggő lb sejteket) ventrálisan hajlik, morfológiailag különálló területet képezve, amely megfelel a szív kiáramlási régiójának. Ez a morfológia arra utal, hogy lehet egy további sejtkomponens, amely elősegíti a szív ventrális hajlítását. Úgy döntöttünk,hogy egy ventrálisan elhelyezkedő izom jelenlétét keressük az aorta csúcsához. Az oldalnézet az embrió, kettős festett miozin nehéz lánc (Myo) és Lbe (ábra. 3C), egyértelműen azt mutatja, hogy a szív kiáramlása valóban egy fejizomhoz kapcsolódik, amelyet a COM-nak nevezünk. A konfokális szakaszok pontosabb elemzése azt mutatta, hogy a szív primordiumát valójában két szorosan fekvő com köti össze, amelyek a nyelőcsőből nyúlnak ki, és a szív kiáramlási régiójának mindkét oldalához kapcsolódnak (nyitott nyílhegyek az ábrán. 3D). Meglepő módon ezeket az embrionális fejizmokat korábban nem ismertettük. A COMs dokumentációjának hiánya valószínűleg azért van, mert a Drosophila embrióban a szomatikus fejizmok morfológiáját és eredetét nem vizsgálták szisztematikusan. A Miller (24) által végzett felnőtt fejizomzat egyetlen rendelkezésre álló leírásának felhasználásával nem tudtuk azonosítani a felnőtt fejizmokat, amelyek megfelelhetnek az itt bemutatott embrionális com-oknak.

érdekes módon a Myo / Lbe kettős festés azt is feltárta, hogy a nem-mezodermális HANCs mindkét szívsejthez kapcsolódik (ábra. 3E) és a COMs (ábra. 3D). Mivel a HANCs expresszálja az lb-t, és szelektíven kapcsolódik a szívsejtek elülső lb-pozitív párjához (ábra. 3e és 4 D–F), feltételezzük, hogy ennek a kapcsolatnak a létrehozása homofil típusú sejtkölcsönhatásokkal járhat. A homotípusos sejtek közötti intercelluláris jelátvitelben részt vevő sejtadhéziós molekulák (25, 26) tesztelése segít meghatározni az lb-expresszáló HANCs és a szívsejtek közötti kapcsolat létrehozásának mechanizmusait.

az aortacsúcs, a COMs és az lb-expresszáló HANCs térbeli elrendezésének vizualizálásához számítógéppel támogatott 3D elemzést és konfokális letapogatások rekonstrukcióját használtuk. Ez a megközelítés teljes mértékben megerősítette megfigyeléseinket, amelyek azt mutatják, hogy a HANCs mellett a szív kiáramlási régió szorosan kapcsolódik egy pár com – hoz (ábra. 3F). Ezek az izmok mindkét oldalról átfedik a szív hegyét, és hozzájárulnak a ventrális hajlításhoz.

ahhoz, hogy megértsük, hogyan alakul ki a szív, a COMs és a HANCs közötti kapcsolat a fejlődés során, ezeket a struktúrákat a korai és késői 14.stádiumú embriókban figyeltük meg (ábra. 3 G és H). Adataink azt mutatják, hogy mind az lb-pozitív szívsejtek, mind az lb-expresszáló HANCs vonzza a kiterjesztő com-okat.

a COMs és a HANCs közötti kapcsolat úgy tűnik, hogy kissé megelőzi a COM kötődését az aorta csúcsához, és a 14.szakasz elején látható (ábra. 3G). Abban az időben a COM fillopodia kiterjed az lb-pozitív szívsejtek irányába (ábra. 3G), és véglegesen kapcsolódnak ezekhez a sejtekhez a 14. késői szakaszban, a szívfúzió kezdetén (ábra. 3 óra). Mivel a Com-ok érintkezésbe kerülnek a szívsejtekkel és a HANCs-okkal, mielőtt a hancs a szívhez kapcsolódna, feltételezzük, hogy a Com-ok a szív hegyének hajlítása mellett megkönnyítik a HANCs-kel való érintkezést. A szomatikus izmok és epidermális kötődési helyeik (ínsejtek) közötti érintkezés létrejöttét alaposan tanulmányozták (27), feltárva a cinkujj transzkripciós faktor csíkjának (28) és az RNS-kötő fehérje How kulcsszerepét (29). Ezeket a markereket használtuk annak tesztelésére, hogy a HANCs és a szívsejtek, amelyekhez a COMs csatolja az ínszerű sejtek megjelenítési tulajdonságait. A WT embriókon anti-Lbe/Anti-Stripe és a how-lacZ embriókon anti-Lbe/Anti-LacZ antitestekkel végzett kettős címkézés azt mutatta, hogy a HANCs és a COM-érintkező szívsejtek nem expresszálnak ínsejt markereket (az adatok nem szerepelnek). Ez a megállapítás azt jelzi, hogy az lb-pozitív sejtek az inak sejtjeitől eltérő mechanizmus alkalmazásával vonzzák a Com-okat. A Com-ok irányításának legérdekesebb jelöltjei a többfehérje-kötő motívumokkal rendelkező szekretált fehérje rés és receptorai Robo és Robo2 (30). A Slit és a Robo a közelmúltban a szomatikus izmok morfogenezise során a vonzás és a repulzió folyamatait szabályozó kulcsfontosságú komponensekként jelent meg (31), ami arra utal, hogy a COM vonzásában is szerepet játszhatnak.

a leginkább elülső lb-expresszáló szívsejtek központi szerepet játszanak a szív kiáramlási régiójának Mintázásában. Az a megfigyelés, hogy mind a COMs, mind a HANCs úgy döntött, hogy a leginkább elülső lb-pozitív szívsejtekhez kötődik, arra késztetett minket, hogy teszteljük, vajon az LB expressziójának deregulációja a szívben befolyásolhatja-e a szív kiáramlási régiójának mintázatát. A teszt elvégzéséhez a Gal4/UAS-célzott expressziós rendszert (16) használtuk. Két különböző GAL4 effektor vonalat, a 24B-GAL4-et és az ón-GAL4-et használtunk (ábra. 4 A és C). A 24B-GAL4 vonal célzott expressziót tesz lehetővé minden szív-és izomsejtben (ábra. 4A) egyenletes és magas szintű expresszióval a legtöbb elülső szívsejtben (nyíl az ábrán. 4A). A Tin-GAL4 vonal (kedvesen R. Bodmer) szelektíven indukálja az UAS transzgén expressziót négy kardioblasztban minden hemiszegmentben (ide tartoznak az lb-pozitív sejtek), de az indukció szintje a legtöbb elülső szívsejtben alacsonyabb (nyíl az ábrán. 4C), mint a 24B-GAL4 vonal. A szív lb expressziójának kibővítése érdekében mindkét GAL4 effektor vonalat keresztezték az UAS-lbe vonallal. A TIN-GAL4 vonal által vezérelt ektopiás lb szív expresszió gyengébb volt, mint az endogén lb expresszió a szívben, és nem figyeltek meg nyilvánvaló funkciónövekedést indukált változásokat a szív kiáramlási régiójának mintázatában (az adatok nem láthatók). Ezzel szemben a 24B-GAL4>az UAS-lbe embriók az lb expresszió jelentős kiterjedését mutatták a szívben (ábra. 4G), ami a COMs rendellenes érintkezéséhez vezet a szív csúcsával. Pontosabban azt találtuk, hogy a Com-k közvetlenül a szív elülső sejtjeihez kapcsolódnak, amelyek a szív kiáramlását képezik (csillag az ábrán. 4G), és nem a második pár szívsejtek, mint a WT (ábra. 4D). A coms megváltozott kapcsolata valószínűleg az ektopiás vonzó jelekből származik, amelyeket az lb megnagyobbodott szív expressziója generál. Ennek következtében a szív elülső részének ventrális hajlítása kifejezettebb volt(hasonlítsa össze az ábrát. 4 D és G). Észrevettük a COMs megváltozott morfológiáját is (nyílt nyílhegy az ábrán. 4 D és G), amelyek az lb 24B-GAL4 által vezérelt ektopiás izom expressziójából eredhetnek. A HANCs és a szívsejtek közötti érintkezést nem befolyásolták a kísérleti misexpressziós állapotok. Annak tesztelésére, hogy a szív lb expressziója szükséges-e a Com-k vonzásához, kihasználtuk az even-skiped (eve) korábban leírt negatív szabályozó hatását, amely képes specifikusan elnyomni az lb-t a szívsejtekben (5). Ismét a 24B-GAL4 és a Tin-GAL4 effektor vonalakat használták az eve kifejeződésének ösztönzésére a szívben. Megállapítottuk, hogy mindkét járművezető keresztezte az UAS-eve vonalat (Tin-GAL4 alacsonyabb penetrációval) az lb aktivitás elnyomásához vezet a szívben (ábra. 4 H és I). A hibás specifikációs hibák ellenére a szív primordia normálisan alakul ki a funkciós embriók uas-eve nyereségében (ref. 5.ábra. 4B), amely lehetővé teszi számunkra a COMs és HANCs monitorozását olyan kontextusban, amelyben az lb szív expressziója kimerült. Adataink azt mutatják, hogy ilyen lb-kimerült embriókban (lásd a szív lb expressziójának hiányát az ábrán. 4 H és I) A Com-ok nem kapcsolódnak a szív csúcsához. Megfigyeltük, hogy a Com-ok elöl kinyúltak, és az invagináló HANCs-hez kapcsolódtak (ábra. 4 H és I), amelyek már nem képesek megfelelően rögzíteni a szív hegyét. A fő COM ág, amely általában a szív kiáramlási régiójához kapcsolódik(vö. 4 E és F h-val és I-vel) hiányzott vagy összeolvadt a HANC-csatoló ággal. Ezért úgy gondoljuk, hogy a Com abnormális alakját és a szív csúcsával való érintkezésének teljes elvesztését a szív lb kimerülése okozza. Ezt a feltételezést támasztja alá az a tény, hogy ugyanazokat a fenotípusokat figyelték meg az embriókban ektopiás szív (Tin-GAL4-vezérelt) és szív plusz izom (24B-GAL4-vezérelt) expresszióval eve (vö. 4 H és I). A COMs megváltozott érintkezése és elhelyezése a késői 14. stádiumú embriókban jelent meg, amikor a miozin nehéz lánc még nem mutatható ki a cardioblastokban (ábra. 4 E és H). A 15. stádiumú embriók elemzése azt is feltárta, hogy a szív lb expressziójának elvesztése a lefelé történő szabályozással jár együtt a 63-tubulin (vö. 4 F és I) a szív kiáramlási régiójában, jelezve, hogy az lb expressziója a szívben fontos hatással van a végső szív morfogenezisre. Ezek az adatok kiegészítik a legutóbbi jelentéseket, amelyek leírják a puccs-TF receptor család tagjának morfogenetikai szerepét, Seven-up, az egyes szegmensek hátsó kardioblaszt párjában kifejezve, amelyek szükségesek az ostia kialakulásához az A5–A7 hasi szegmensekben (32, 33). Ebben az összefüggésben az lb szerepének bemutatása a szív kiáramlási régiójának mintázatában növeli annak lehetőségét, hogy a hasi szegmensekben az lb hasonló szerepet játszik a szívsejtek és a szívhorgonyzó izmok közötti kapcsolat kialakításában. Ezt a hipotézist még meg kell vizsgálni.

ezenkívül a bemutatott fenotípusok (ábra. 4) azt sugallják, hogy a szívben kísérletileg kimerült lb expresszió befolyásolja a szívsejtek vonzó jeleinek kibocsátását vagy vételét, következésképpen a COMs-szel való érintkezés megszakadásához vezet. Ugyanezt vagy hasonló izomvonzót valószínűleg az lb-pozitív HANCs termeli vagy fogadja, ami arra utal, hogy az lb szabályozza a sejt–sejt érintkezésben részt vevő gének expresszióját. Érdekes módon az egér lb homológjában megállapították, hogy az lbx1 gén szükséges az izom prekurzorok egy részének (21, 22) irányított migrációjához, jelezve, hogy létezhetnek konzervált sejtmozgási mechanizmusok, amelyeket az lb gének irányítanak.

együttesen, olyan embriók elemzésével, amelyekben a szív lb expressziója kibővült vagy kísérletileg kimerült, bebizonyítottuk, hogy az lb szükséges a HANCs és COMs helyes rögzítéséhez, következésképpen a szív kiáramlási régiójának megfelelő mintázásához. Ez a megállapítás betekintést nyújt a szív prekurzorok elülső–hátsó diverzifikációjának funkcionális jelentésébe a Drosophila szív minden szegmensében.

lehet-e a HANCs a neurális Címersejtek Drosophila prototípusa? A gerinces szív morfogenezise két különböző sejttípust foglal magában, a mezodermális szív primordiát és a fejrégióból vándorló idegi gerincsejtek szubpopulációját. Ebben a cikkben megmutattuk, hogy a Drosophila-ban a fej epidermiszéből származó nem-mezodermális sejtek egy csoportja (amelyet HANCs-nek neveztünk) hozzájárul a szív végső morfogeneziséhez. A gerinces neurális gerincsejtekhez hasonlóan a hanc-k irányított mozgásokon mennek keresztül, érintkezésbe kerülnek a szívsejtekkel, részt vesznek a szív kiáramlási régiójának mintázásában. Kimutattuk, hogy az LB homeobox gének, amelyekről ismert, hogy részt vesznek a kardiális prekurzorok diverzifikációjában (5, 11), HANCs-ben vannak kifejezve, és azok specifikációjához szükségesek. Hasonlóképpen, az LB ortológusa, az Lbx1 gén, nemrégiben kiderült, hogy szükséges a szív idegi címersejtjeinek egy részhalmazának specifikációjához egérben (23), jelezve, hogy az lb/Lbx1 gének konzervált szerepet játszanak a a szív nem mezodermális komponenseinek specifikációja. Ebben a nézetben a HANCs valóban összehasonlítható a gerinces neurális címersejtekkel. Adataink azonban azt is jelzik, hogy a HANCs legalább két olyan jellemzővel rendelkezik, amelyek csak a Drosophila-ra jellemzőek: (i) a hajtogatott fejű ektoderma részeként mozognak, nem pedig leválasztott idegi gerincsejtekként; és (ii) funkcionális komplexet alkotnak a Com-kkal, amelyeknek gerincesekben nincs homológ szerkezete. Ezért további elemzésekre van szükség a HANCs pontos szerepének és potenciális neurális címersejtszerű funkcióinak tisztázásához.