gombás gazdaszervezet
a fonalas gombák gazdaszervezetként szolgálhatnak egy mikrobiális kárminsav-sejtgyárban, mivel képesek bőséges mennyiségű acetil-CoA és malonil-CoA építőelemet biztosítani a poliketid szintéziséhez állványzat. A szükséges celluláris infrastruktúrát is kínálják az ER membránhoz kötött C-glükozil-transzferáz UGT28 befogadására. Mivel az A. nidulans jól fejlett géntechnológiai eszköztárral rendelkezik, ezt a fajt választottuk kiindulópontként egy gombás kárminsav-sejtgyár kifejlesztéséhez. Mint a legtöbb fonalas gombák, A. nidulans képes előállítani rengeteg bioszintetikusan különböző másodlagos metabolitok beleértve jelentős számú aromás poliketidek. Chiang et al. korábban kimutatták, hogy az A. nidulans11 fő endogén PKS-termékeinek kialakulásáért felelős géncsoportok deléciója javította az A. nidulans mint sejtgyár potenciálját a poliketidek heterológ előállításához. Ily módon megnövekszik az acetil-CoA és a malonil-CoA építőelemek halmaza, és egyszerűsödnek az új termékek képződéséhez szükséges későbbi kémiai elemzések. A kárminsav előállítására szolgáló gombasejtgyár felé tett első lépésként ezért megszüntettük a domináns aromás poliketidek bioszintetikus útvonalait, amelyek potenciálisan zavarhatják a kárminsavtermelést, és megnehezíthetik az elemzést és a későbbi tisztítást. Pontosabban, az aspertecin, a monodiktifenon és a sterigmatocisztin termelésére szolgáló géncsoportokat, valamint a zöld konídium pigmentképződésért felelős géneket, a wA-t és a yA-t eliminálták egy nem homológ endjoining defficient A. nidulans háttérrel. A konidiális pigmentek várható hiánya mellett a kapott nid2252 törzs nem mutatott látható hatást a morfológiára és az alkalmasságra (kiegészítő Fájl, ábra. 1). Ezért a nid2252-t használtuk referenciatörzsként és a kárminsav előállítására szolgáló gombasejtgyár építésének alapjaként.
A flavokermezinsav-Antron képződésének félig természetes útjának kialakítása
a mikrobiális kárminsav-sejtgyár építésének fő akadálya a flavokermezinsav-antront szintetizáló természetes PKS hiánya volt, amely az út első feltételezett köztiterméke. Ennek a korlátozásnak a megkerülése érdekében alternatív bioszintetikus utat folytattunk ennek a poliketidnek a előállításához. Az oktaketid flavokermezinsav-Antron, annak C7-C12, C5-C14 és C2-C15 ciklizációs mintázatával elméletileg egyetlen lépésben kialakítható egy gomba nem redukáló I. típusú iteratív PKS, amely megfelelő terméksablon doménnel rendelkezik (ábra. 1 balra). Az irodalomban azonban még nem írtak le ilyen enzimeket. A flavokermezinsav-Antron kialakításának alternatív mechanizmusa egy kétlépcsős reakció, ahol a PKS nem redukált lineáris oktaketidláncot szintetizál, amelyet ezt követően transz-hatású ciklázok/aromatázok segítségével ciklizálnak a kívánt szerkezetbe (ábra. 1 jobb). Ilyen típusú reakciók léteznek a természetben például az Aktinorhodin (Act) útvonalon Streptomyces coelicolor12. Ebben az esetben az oktaketid gerincét egy multi-alegység II-es típusú PKS-rendszer, a KSa, a Ks ons és az ACP (act minimal PKS) szintetizálja, amelyet az actKR a C9 pozícióban redukál, majd ezt követően az aromatáz/cikláz, az actARO/CYC és a cikláz actcycyc2 hajtogat, hogy a 3,8-dihidroxi-1-metil-antrakinon-2-karbonsav (DMAC)7 triciklusos vegyületet kapjuk. A DMAC ugyanazt a hajtást jeleníti meg, mint a flavokermezinsav-Antron, de C9 helyzetben csökken.
a jelen vizsgálat szempontjából különösen érdekes a Zhui cikláz és a Zhuj aromatáz a Streptomyces sp-ből. R1128, amely a nem redukált lineáris poliketidek két egymást követő ciklizációs reakcióját katalizálja a flavokermezinsavhoz hasonló redőkké egy trón13. Pontosabban, a ZhuI cikláz felelős az első gyűrű, a C7-C12 bezárásáért, a ZhuJ aromatáz pedig a második gyűrű, a C5-C14 bezárásáért. A harmadik gyűrű, a C2-C15 spontán képződik. A ZhuI-t és a ZhuJ-t korábban együtt fejezték ki S-Ben. coelicolor a oktaketidet képező II típusú act minimális PKS képződését eredményezi flavokermezinsav, ismert, mint 3,6,8-trihidroxi-1-metil-antrakinon-2-karbonsav (tmac) a bakteriális irodalom14. Sajnos egy azonos stratégiát nehéz lehet megvalósítani az A. nidulans – ban, mivel a II.típusú minimális PKSs-t több kísérlet ellenére sem sikerült sikeresen megvalósítani a Streptomyces nemzetségen kívüli heterológ gazdaszervezetekben15. És valóban, az act minipkeknek az A. nidulans és a Saccharomyces cerevisiae-ben való rekonstruálására tett kísérleteink hasonlóan sikertelennek bizonyultak (az adatok nem láthatók). A szükséges nem redukált oktaketid előállításának alternatív módja a III-as típusú PKS enzimekre támaszkodni, amelyeket sikeresen expresszáltak élesztőben, például a flavonoid bioszintézissel kapcsolatban16. Különösen érdekes az Aloe arborescens oktaketid szintáz (OKS), amelyről leírták, hogy nem redukált oktaketideket állít elő, amelyek spontán módon összehajlanak sek4 és SEK4b a vitro17-ben (ábra. 2a). Az Aspergillusban azonban nem vizsgálták, hogy a III. típusú PKSs termékek, amelyek AKCS-független enzimek, amelyek karbonsavakat szabadítanak fel, összehajthatók-e a Zhui típusú ciklázzal, amelyről leírták, hogy az AKCS-hez kötött szubsztrátokra hat. A jelenlegi tanulmányban ezért azt tűztük ki célul, hogy teszteljük a III. típusú OKS növény kompatibilitását a II. típusú PKS rendszerekből származó ciklázok/aromatázok kompatibilitásával, azzal a céllal, hogy mesterséges de novo bioszintetikus utat fejlesszünk ki a flavokermezinsav Antron prekurzor képződéséhez a kárminsav képződéséhez.
a nem redukált oktaketid kialakulása. a) nem redukált oktaketidek spontán hajtogatása. B) az Aspergillus nidulans nid2252 referencia törzs fenotípusa, valamint azok a törzsek, amelyek natív vagy optimalizált kodonhasználattal fejezik ki az OKS-t. C) Az A. nidulans nid2252 referencia törzs és az OKS expresszáló törzsek metabolikus profilja. Báziscsúcs kromatogram (világosszürke) kiválasztott metabolitok feltüntetésével: SEK4 (kék), dehidro-SEK4 (Sötétkék), SEK4b (lila), dehidro-SEK4b (sötétlila), mutaktin (narancs) és flavokermezinsav (mész).
poliketid prekurzorok előállítása kárminsav előállításához A. nidulans-ban
az OKS in vivo teljesítményének teszteléséhez egy gombás gazdaszervezetben az A. nidulans gpdA promoter által ellenőrzött OKS-t egyetlen másolatként illesztettük be az A. nidulans gpdA promoter által ellenőrzött ok-kat egyetlen példányban egy meghatározott lokuszba (5.integrációs hely, IS5) az A-ban. nidulans genom18. Két törzset építettek ki, az egyik a natív OKS kódolási szekvenciát, a másik pedig az A. nidulans kifejezésre optimalizált kodon változatát fejezte ki. Hét napos inkubációt követően szilárd táptalajon, lásd a módszerek részt a részletekért, mindkét törzs a micélium erős vörös-barna színét mutatta (ábra. 2b). A törzsek HPLC-HRMS-sel végzett metabolikus profilozása nem mutatott semmilyen nem redukált oktaketidet, hanem a várt SEK4 és SEK4b, valamint a flavokermezinsav és három másik, ismeretlen azonosságú vegyület jelenlétét (ábra. 2c), amelyek nem voltak jelen a nid2252 referencia törzsben. A SEK4-et és a SEK4b-t alapos HPLC-HRMS/MS elemzés alapján azonosították (kiegészítő Fájl, ábra. 2) és összhangban volt a korábban bejelentett értékekkel19, míg a flavokermezinsavat a D. coccus9-ből izolált hiteles referenciával hasonlították össze (kiegészítő Fájl, ábra. 3). A metabolit 13,0 perc múlva eluálódik. pszeudomolekuláris ionja volt + m / z 303.0867, amely megfelel a c16h14o6 molekuláris képletének, összhangban az ismert oktaketid sönt termékkel, a mutaktinnal, amelyet korábban az Act génklusterrel végzett Streptomyces-alapú kísérletekben7 írtak le. Ezt az azonosítást az UV spektrum részletes elemzésével erősítették meg, és a sek4 és SEK4b retenciós ideje is alátámasztotta (kiegészítő Fájl, ábra. 4). A c16h12o6 (− m/z 299,0566) molekuláris képletű két további metabolit oktaketid-termékeket jelzett, de nem felelt meg egy közös sönt-terméknek (kiegészítő Fájl, ábra. 5). Ezért a metabolitokat izoláltuk, és az 1D és 2D NMR kísérletek alapján a szerkezet tisztázása dehidro-SEK4 (más néven B26 a bakteriális irodalomban) és dehidro-SEK4b20 (kiegészítő Fájl, 6-11.ábra). Az OKS törzsben megfigyelt hat új poliketid képződése három különböző spontán első gyűrűzárási reakcióval magyarázható: C7-C12 (SEK4, dehidro-SEK4 és flavokermezinsav), C10-C15 (SEK4b és dehidro-SEK4b) és C7-C12 a C9 keton redukció után (mutaktin) (ábra. 2a és kiegészítő Fájl, Fig. 12). Ezek közül csak az első gyűrűzárási típus (C7-C12) teszi lehetővé a kívánt flavokermezinsav-Antron későbbi képződését egy második C5-C14, majd a harmadik C2-C15 gyűrűzáráson keresztül. Korábban beszámoltak arról, hogy a SEK4 és a SEK4b spontán dehidratálódva dehidro-SEK4, illetve dehidro-SEK4b képződést eredményez, míg a mutaktin képződése a poliketid lánc C9 pozíciójának enzimatikus redukciójától függ a hajtogatás előtt21. A flavokermezinsav képződése, amely a kárminsav útjában ismert köztitermék (ábra. 1), váratlan volt, mivel nem számoltak be arról, hogy ez a metabolit nem redukált oktaketidláncokból spontán alakulna ki. Ez arra utal, hogy az A. nidulans természetesen számos ciklázt/aromatázt termel, amelyek elősegítik a kívánt hajtogatási mintát. A két OKS-expresszáló törzs metabolitprofilja nem mutatott lényeges különbségeket a termelési szintekben, ezért úgy döntöttünk, hogy az OKS natív változatát kifejező törzsre összpontosítunk a kárminsav előállítására szolgáló gombasejtgyár további fejlesztéseinek alapjaként.
A nem redukált oktaketidek hajtogatási útvonalának megtervezése
a nem redukált oktaketid promiszkuált hajtogatása csökkenti a kívánatos flavokermezinsav hozamát. Ezért azt képzeltük el, hogy a flavokermezsav-termelést növelni lehet a hajtogatási folyamat kívánt irányba történő racionalizálásával, a Zhui és ZhuJ kodonoptimalizált változatainak kifejezésével. Annak vizsgálatára, hogy a ZhuI és a ZhuJ befolyásolja-e az A. nidulans natív anyagcseréjét, először a ZhuI-t és a ZhuJ-t külön-külön és kombinációban expresszáló törzseket hoztunk létre az A-ban meghatározott genomi lókuszokból (IS6 és IS7). nidulans nid2252 referencia törzs. A három törzs HPLC-HRMS általi metabolikus profilozása nem tárt fel kimutatható metabolikus különbségeket (ábra. 3b). Ezután létrehoztunk egy törzset, amely együtt expresszálja az OKS-t ZhuI-val, amely kódolja azokat a ciklázokat, amelyek katalizálják a C7-C12 első gyűrűzáródás kialakulását (ábra. 3a). A csak OKS-t expresszáló törzshöz képest ez a törzs 2,5-, 2,2-és 2,1-szeres növekedést mutatott a flavokermesinsavban, a sek4-ben és a dehidro-SEK4-ben. A ZhuI-val egyetértésben a kívánt irányba hajtogatást irányítva ezeket az anyagcsere-változásokat a nemkívánatos első gyűrűs redőket tartalmazó metabolitok csökkent szintje kísérte (ábra. 3b és 1. táblázat). Az OKS-t és a ZhuJ-t együtt expresszáló törzs, amely az aromatázokat kódolja, amelyek katalizálják a C5-C14 második gyűrűzáródást (ábra. 3a), a flavokermezinsav szintjének 2,7-szeres növekedését eredményezte. Ezt a növekedést a C7-C12 első gyűrűs redővel (SEK4 és dehidro-SEK4) rendelkező metabolitok szintjének csökkenése kísérte, míg a várakozásoknak megfelelően a nem kívánt C10-C15 első gyűrűs redővel (SEK4b és dehidro-SEK4b) rendelkező metabolitok szintje nem változott (ábra. 3b és 1. táblázat). Végül a ZhuI-t, ZhuJ-t és OKS-t expresszáló törzs elemzése 4,1-szeres növekedést mutatott a flavokermezinsav termelésében ahhoz képest, amikor az OKS-t önmagában expresszálták. Ezenkívül ez a növekedés 60% – kal magasabb, mint amit az OKS-t expresszáló törzsek esetében figyeltek meg ZhuI-val vagy ZhuJ-val kombinálva (1.táblázat). Ez az eredmény azt jelzi, hogy a cikláz és az aromatáz additív módon képesek növelni a fluxust a mesterséges de novo útvonalon a kívánt termék, a flavokermezinsav felé (ábra. 3b).
az oktaketid gerinc hajtogatásának irányítása. a) bioszintetikus lépések a nem redukált oktaketidtől a flavokermezinsav-antronig. (b) az Aspergillus nidulans nid2252 referencia törzsek (törzs törölt PKS klaszterekkel) és a Nid2252 célzott kémiai analízise, amely ZhuI-t, vagy ZhuJ-t, vagy ZhuI + ZhuJ-t, vagy OKS-t, vagy OKS + ZhuI-t, vagy OKS + ZhuJ-t és OKS + ZhuI + ZhuJ-t expresszál. Bázis csúcs kromatogram (világosszürke) kiválasztott metabolitok feltüntetésével: SEK4 (kék), dehidro-SEK4 (Sötétkék), SEK4b (lila), dehidro-SEK4b (sötétlila), mutaktin (narancs) és flavokermezinsav (mész). c) minimális táptalajon hét napon át szaporított törzsek Kolóniamorfológiája.
meglepő, és nagyon biztató, további metabolikus elemzés a törzs co-expresszáló OKS, ZhuI és ZhuJ kiderült, hogy a fokozott képződését flavokermezinsav kísérte a termelés kermesinsav (ábra. 4). Ezért A. a nidulánok biztosítják a szükséges monooxigenázt a flavokermezinsav kermesinsavvá történő átalakításához, amely a kárminsav útjának végső köztitermékeként szolgálhat (ábra. 1).
a kermesinsav képződésében részt vevő oxidatív lépések. a) oxidatív lépések a flavokermezinsav-antrontól a kermesinsavig. B) célzott metabolikus analízis a flavokermezsav (FK) és a kermesinsav (KA) előállítására a NID2252 referenciatörzsben (törölt PKS-klaszterekkel rendelkező törzs), az OKS-t expresszáló törzsben és az OKS + ZhuI + ZhuJ törzsben. A kromatogram a bázis csúcskromatogramot (világosszürke) mutatja, flavokermezsav (mész) és kermesav (kék) jelzéssel.
kárminsav előállítása A. nidulansban
a kárminsav képződésének utolsó lépése a kermesinsav C-glükozilezése (ábra. 5a). A kárminsav bioszintetikus útvonalának ezen lépéséért felelős enzimet korábban azonosították a D. coccus-ban, és heterológ expresszióval jellemezték az S. cerevisiae8-ban. Ezért behelyeztük az UGT2 kódoló gént, amelyet az A. nidulans expressziójára optimalizáltunk, a nid2252 referencia törzs IS4 lokuszába, és hogy befejezzük az A. nidulans félig természetes kárminsav bioszintetikus útvonalát, ugyanabba a lokuszba a Zhui-t, ZhuJ-t és OKS-t együtt expresszáló törzsben. Az UGT2 expressziója önmagában a referencia törzsben nem befolyásolta a táptalaj színének megjelenését, sem az A. nidulans metabolikus profilját a nid2252 referencia törzshez képest (ábra. 5b,c). Ezzel szemben az OKS, ZhuI, ZhuJ és UGT2 együttes expressziója a közeg vörös színezését eredményezte, ami arra utal, hogy vízoldhatóbb színezék(ek) képződött (ábra). 5b). Ennek a törzsnek a célzott LC-HRMS elemzése megerősítette a kárminsav képződését22 (kiegészítő Fájl, ábra. 13), valamint a dcII9, 23 és egy dcii izomer (kiegészítő Fájl, ábra. 14), amely azt mutatja, hogy az UGT2 működőképes volt az A-ban. nidulánok és sikeresen befejezhetik a bioszintetikus utat (ábra. 5c). A kárminsav és a dcII pozitív azonosítása hasonló retenciós idők, UV-spektrumok, MS és MS/MS fragmentációs minták alapján történt a két vegyület tiszta standardjai esetében. Stathopoulou és munkatársai a kárminsav három izomerjét (kárminsav, DCIV és DCVII) írták le az irodalomban.23, mindhárom különböző retenciós időt mutat az LC-MS / MS alapú elemzésben. Elemzésünkben csak kárminsavat mutattunk ki, a dciv-t és a DCVII-t nem, a D. coccus-ból izolált autentikus kárminsav standard retenciós ideje és fragmentációs mintázata alapján (kiegészítő fájl, ábra. 13). Adataink együttesen határozottan bizonyítják, hogy lehetséges a kárminsav előállítása A. nidulans félig természetes úton.
glükozilezési lépés a kárminsav kialakításához. a) A DACTYLOPIUS coccus glükoziltranszferáz UGT2 szubsztrátként mind a kermezsavat, mind a flavokermezsavat elfogadja, ami kárminsav, illetve dcII képződését eredményezi. b) az UGT2 önmagában és a szintetikus PKS-szel kombinálva történő expressziójának fenotípusos hatása a nid2252 Aspergillus nidulans háttéren, hét napos inkubálás után készített képek. C) célzott metabolikus analízis glükozilált vegyületek, pl. kárminsav (vörös) és dcii (narancssárga), ráhelyezett báziscsúcs-kromatogram (világosszürke) előállítására.
